Abstract
Bakgrunn
Denne studien er designet for å utforske det terapeutiske potensialet til å undertrykke MAP kinase og PI3K /Akt trasé og histondeacetylase (HDAC) for å indusere ekspresjon av natrium /jodid symporter (NIS) og radiojodopptak i ikke-skjoldbrusk kreft celler.
Metoder
Vi testet virkningene av MEK-inhibitor RDEA119, den Akt inhibitor perifosine, og den HDAC-inhibitoren Saha på NIS-ekspresjon i tretten humane kreftcellelinjer avledet fra melanom, leverkreft, magekreft, tykktarmskreft, brystkreft, hjernekreft og. Vi har også undersøkt radiojodopptak og histone acetylering på NIS arrangøren i markerte celler.
Resultater
Totalt sett de tre-hemmere kan indusere NIS uttrykk, i varierende grad, i melanom og alle epithelial karsinom avledede celler, men ikke i hjernen kreft-deriverte celler. Saha var mest effektive og dens virkning kan bli betydelig forbedret ved RDEA119 og perifosine. Uttrykket av NIS, både mRNA og proteinnivåer, var mest robuste i melanoma celle M14, leverkreft celle HepG2, og magekreft celle MKN-7 celle. Radiojodopptak ble tilsvarende indusert, ledsaget av sterk økning av histon-acetylering ved NIS-promotoren, i disse celler ved behandling med de tre inhibitorer.
Konklusjoner
Dette er den første demonstrasjon av at samtidig undertrykke MAP-kinase og PI3K /akt trasé og HDAC kan indusere sterk ekspresjon NIS og radiojodopptak i visse ikke-thyroid humane kreftceller, som gir nye terapeutiske implikasjoner for medhjelper radiojod behandling av disse cancerne
relasjon:. Liu Z, Xing M (2012) Induksjon av Sodium /Iodide Symporter (NIS) Expression og radiojodopptak i Non-skjoldbrusk kreft celler. PLoS ONE 7 (2): e31729. doi: 10,1371 /journal.pone.0031729
Redaktør: Marian Ludgate, Cardiff University, Storbritannia
mottatt: 12 september 2011; Godkjent: 12 januar 2012; Publisert: 16 februar 2012
Copyright: © 2012 Liu, Xing. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Institute of Health R01 stipend CA134225 til Dr. Xing. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Som et trans glykoprotein uttrykt hovedsakelig i follikulære epitelceller skjoldbruskceller, natriumjodid symporter (NIS) spiller en fundamental rolle i transport av jod fra det ekstracellulære rom i skjoldbruskcelle for syntese av skjoldbrusk hormoner i skjoldbruskkjertelen [1] – [4]. Dette er den biologisk basis for den kliniske anvendelse av radiojod i diagnostisering og behandling av en rekke av godartede og ondartede sykdommer skjoldbrusk. Et typisk eksempel på anvendelse av denne funksjon av NIS er radiojod ablasjon i utstrakt bruk for behandling av kreft i skjoldbruskkjertelen [5], [6]. Radiojod behandling er vanligvis effektiv i tyroideacancer, men det blir ineffektiv når skjoldbruskkjertelen kreftcellene har mistet uttrykk for NIS og kan ikke lenger ta opp radiojod som vanligvis sett i dårlig differensierte og udifferensierte skjoldbrusk kreft [7] – [10]. Tidligere studier har vist at inhibitorer av histon-deacetylase (HDAC) kunne indusere ekspresjon av NIS i skjoldbruskkjertelen kreftceller [11], [12]. Vi har nylig vist at kombinasjonen av HDAC hemmer Saha med hemmere av MAP kinase og PI3K /Akt trasé kan indusere robust og synergistisk uttrykk for NIS og radiojodopptak i skjoldbruskkjertelen kreftceller [13]. Dette åpnet muligheten for romanen effektiv behandling av skjoldbruskkjertelkreft ved hjelp av radiojod som ellers ikke er ivrig for radioisotop.
Gitt den unike funksjon av NIS å transportere jod i skjoldbrusk celler og klinisk suksess med å bruke radiojod for skjoldbruskkjertelen kreft ablasjon behandling, har det lenge vært foreslått og testet som eksogent indusert NIS uttrykk ved hjelp av målrettet genoverføring kan gi ikke-skjoldbrusk kreft celler radioiodine aviditet for radiojod ablasjon behandling [2] – [4], [14]. Slike studier er lovende, men har ennå ikke resultert i pålitelige kliniske applikasjoner. Store krefter er fortsatt behov for å forbedre flere viktige aspekter ved denne tilnærmingen, inkludert terapeutisk effekt, spesifisitet, sikkerhet og teknisk kompleksitet. NIS kan uttrykkes i forskjellige normale ikke-thyroid vev, selv ved et lavt nivå, inkludert, for eksempel, spytt, tåre, bryst, mage, tarm, lunge og nyre-vev [15] – [19]. Lav-nivå ekspresjon av NIS ble også rapportert i noen ikke-thyroid kreft så som brystcancer [20]. Vi har nylig vist at undertrykkelse av MAP kinase og PI3K /Akt trasé kan indusere uttrykk for NIS og radiojodopptak i melanomceller [21]. Gitt den synergisme i robust indusering av skjoldbruskkjertel-genekspresjon og radiojodopptak i skjoldbruskkjertelen kreftceller ved samtidig å inhibere HDAC, og MAP-kinase og PI3K /Akt trasé [13], i det foreliggende studiet vi testet potensialet i denne nye behandlingsstrategi for å indusere NIS ekspresjon for radiojodopptak i et utvidet panel av ikke-skjoldbrusk kreft celler.
Resultater
Induksjon av NIS genuttrykk i ikke-skjoldbrusk kreftceller ved å undertrykke MAP kinase og PI3K /AKT stier og HDAC
Vi testet effekten av MEK hemmer RDEA119, den Akt inhibitor perifosine, og HDAC hemmer Saha på uttrykk for
NIS
genet i 13 humane kreftceller (tabell 1). Disse inkluderte melanomceller og epitelceller carcinoma celler avledet fra hepatokarsinom, gastrisk karsinom, kolonkarsinom, og brystkreft, samt glioblastoma celle T98G og astrocytom celle SNB-78. For å demonstrere de målrettede legemiddeleffekter av de tre inhibitorer i disse cellene, vi først testet deres virkninger på deres målmolekyler i signalveier. Som vist på fig. 1, etter 30 timers behandling, RDEA119 0.5 uM og perifosine på 5 pM kunne gi en betydelig inhiberer fosforylering av ERK (p-ERK) og fosforylering av AKT (p-AKT), respektivt, i praktisk talt alle celler bortsett fra SNB-78 celle. Saha ved 0,5 uM i 30 timer kunne dramatisk forbedre acetylering av histon H3 i disse cellene med unntak av noen få celler, så som T98G og SNB78, hvori det var ingen eller bare en liten økning i histon acetylering. Disse resultatene samlet, viste de forventede mål effektene av disse hemmere.
Den MEK hemmer RDEA119, den Akt inhibitor perifosine, og HDAC hemmer Saha ble brukt til henholdsvis målrette disse signalveier eller molekyler. Cellene ble behandlet i 30 timer med 0,5 uM RDEA119, 5 uM perifosine eller 0,5 uM Saha som angitt. DMSO eller PBS ble anvendt i parallell som bærerkontrollen. Celler ble lysert for Western blotting etter behandlinger for å vise nivået av fosforylert ERK (p-ERK), fosforylert Akt (p-Akt) og acetylert histon (Ac-His) med spesifikke antistoffer. «+», Behandling med den angitte inhibitor; «-«., Behandling med kjøretøy
Vi har senere testet effekten av de tre-hemmere ved disse konsentrasjonene, enkeltvis eller i kombinasjoner, på uttrykk for
NIS
gen i de 13 celler ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. Som vist i tabell 1,
NIS
ekspresjon ble øket i varierende grad i alle cellene, med unntak av de to ikke-epiteliale kreftceller T98G og SNB78 som ikke har noen respons på disse medikamentell behandling. Den induserte
NIS
uttrykk var mest robuste i melanoma celle M14, den hepatokarsinom celle HepG2, og magekreft celle MKN-7, som ble brukt til videre studier som presenteres i de neste avsnittene. Individuelt, RDEA119 og perifosine hver hadde en mindre effekt og Saha viste de største utslagene på uttrykk for
NIS
. En synergistisk effekt ble sett når MEK hemmer eller Akt inhibitor ble hver kombinert med Saha og synergieffekter var enda mer robust når de tre stoffene ble kombinert, med et unntak som i HepG2 celler perifosine ikke forbedre ytterligere robust effekt av Saha .
etter demonstrasjon av mRNA-ekspresjon av NIS ved kvantitativ real-time PCR i melanom og epiteliale celler carcinoma, ved forsøkte vi å undersøke ekspresjonen av NIS på proteinnivået i disse cellene ved bruk av M14 melanomcelle , hepatokarsinom celle HepG2, og gastrisk karsinom celle MKN-7 som representanter som viste den mest robuste ekspresjon av NIS (tabell 1). Som vist på fig. 2, kombinasjonsbehandling av disse cellene med RDEA119, perifosine og Saha økt betydelig NIS protein uttrykk som oppdages ved Western blotting. Sammenlignet med M14 og HepG2-celler, viste MKN-7-celler en beskjeden økning i ekspresjon av NIS-protein i respons til kombinasjonsbehandling med de tre inhibitorer, som var likt mønsteret av NIS-mRNA-ekspresjon i disse cellene under denne behandling tilstanden (tabell 1). Dermed undertrykke MAP kinase og PI3K /Akt stier og HDAC kan indusere robust uttrykk for NIS i disse cellene både på transkripsjons og translasjonsforskning nivåer.
Celler ble behandlet i 30 timer med kombinasjonsbruk av RDEA119, perifosine, og Saha i de konsentrasjoner som er beskrevet i fig. 1, etterfulgt av standard Western blotting-analyse av cellelysater ved å bruke spesifikke primære antistoff mot NIS. Uttrykket nivå av ß-aktin ble analysert parallelt for kvalitetskontroll. «Control», behandling av celler med bilen; «R + P + S», behandling av celler med kombinert bruk av RDEA119, perifosine og Saha.
Cellular radiojodid opptak indusert ved å undertrykke MAP kinase og PI3K /Akt trasé og HDAC
med demonstrasjon av robust NIS uttrykk i ikke-skjoldbrusk kreftceller ved å undertrykke MAP kinase og PI3K /Akt stier og HDAC, brukte vi M14, HepG2 og MKN-7 celler for å teste den ultimate funksjonelle relevansen av dette funnet ved å undersøke evnen til disse cellene til å ta opp radiojodid etter induksjon av NIS. Som vist på fig. 3, radiojodid opptaket var tydelig indusert i disse cellene ved kombinasjonsbehandling med RDEA119, perifosine og Saha. Blant de tre celler, merket radiojodid opptaket ble spesielt sett i M14-celle, i samsvar med det funn at NIS uttrykk både mRNA og proteinnivåene var mest robuste i denne cellen.
Celler ble behandlet med RDEA119, og perifosine Saha som beskrevet i fig. 2, etterfulgt av inkubering med Na
125I i 1 time. Parallelle celler ble i tillegg behandlet med NIS-blokkering NaCIO
4 for å få uspesifikk radiojodopptak /binding med cellene. Cellene ble deretter vasket, lysert, og målt for radioaktivitet. Cell radiojodopptak presenteres som kpm /10
6 celler (på y-aksen i figuren) etter korreksjon for den ikke-spesifikke radioiodine bindende. Detaljerte forsøksfremgangsmåter er som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. «Control», behandling av celler med bilen; «R + P + S», behandling av celler med kombinasjonsbruk av RDEA119, perifosine og Saha. ** Sammenlignet med kontrollen, s. 0,01
Forbedring av histone acetylering av NIS arrangøren ved å undertrykke MAP kinase og PI3K /Akt stier og HDAC
Histone acetylering på promoter region fremmer genuttrykk [22]. For å undersøke om dette var en mekanisme involvert i uttrykket av NIS indusert ved medikamentell behandling i ikke-skjoldbrusk kreft celler i denne studien, ved siden utførte vi ChIP analyse av histone acetylering på NIS promoter. Vi undersøkte tre forskjellige regioner i NIS promoter for histon H3 og H4 acetylering i M14, HepG2 og MKN-7 celler. Disse områdene representerer minimal avgjørende NIS promoter [23]. Vi fant at histon-acetylering på følgende regioner av NIS-promoteren ble øket til forskjellige nivåer ved behandling med Saha i disse cellene (fig. 4a-c). Kombinasjonsbehandling med MAP kinase og PI3K /Akt stier og HDAC hemmere økt ytterligere histone acetylering på NIS promoter. Samlet denne histon acetylering ble observert i både H3 og H4 i de tre celler med unntak av MKN-7-celler hvor ingen signifikant endring acetylering ble sett i H3 (fig. 4c). Alle de tre regioner av den minimale essensielle NIS-promotoren viste histon acetylering med unntak av P1 region i M14-celler som viste ingen endring i acetylering av H3 etter medikamentbehandlinger (fig. 4a). Opp til omtrent 50 folder av økning av histon H4 acetylering ved den P2 region av NIS-promoteren i M14-celler (fig. 4a) og ca 20 folder av økning av histon H4 acetylering ved P1-regionen i HepG2-celler (Fig. 4b) var observert. Disse data tyder på at histone acetylering er en mekanisme som er involvert i NIS uttrykk indusert ved å undertrykke MAP kinase og PI3K /Akt stier og HDAC i disse ikke-skjoldbrusk kreft celler. M14 celler viste den mest robuste histone acetylering på NIS arrangøren og nest mest i HepG2 celler. MKN-7 celler vises en relativt beskjeden histone acetylering på NIS promoter. Det er interessant å merke seg at dette mønsteret på omfanget av histon acetylering i de tre celler ekko brønnmønstrene omfanget av NIS ekspresjon (Tabell 1, fig. 2) og radiojodopptak (fig. 3) i disse celler, noe som ytterligere støtter en viktig rolle histone acetylering i NIS uttrykk indusert ved å målrette den MAP kinase og PI3K /Akt stier og HDAC. Dette ser ikke ut til å gjelde for T98G celle som viste noen histone acetylering under behandling med Saha (Fig. 1), mens det ikke var noen økning i NIS uttrykk i denne cellen (tabell 1). Men denne acetylering nivået av histon var minimal i forhold til at i mange andre celler (Fig. 1). Derfor er korrelasjonen av NIS uttrykk med histon-acetylering ble samlet klart i forskjellige celler som ble testet.
Celler ble behandlet med Saha alene eller i kombinasjon med Saha RDEA119 og perifosine som beskrevet i fig. 2. Histone acetylering nivåer på de tre regionene (P1, P2 og P3) som utgjør minimal viktig formidler av
NIS
genet ble analysert ved kromatin immunoprecipitation (chip) analyse som beskrevet i materialer og metoder. Acetylering status for både histon H3 og H4 ble undersøkt ved hjelp av spesifikke antistoffer for chip. Ikke-spesifikke IgG-antistoffer ble anvendt som kontroll. Resultatene for M14, HepG2 og MKN-7 celler er presentert i fig. 4a, 4b og 4c, henholdsvis. For hver celle, viser det øverste panelet de faktiske resultater av PCR på DNA-fragmentene oppnådd ved brikken ved hjelp av ikke-spesifikt kontroll-IgG, anti-acetylert H3 (Anti Ac-H3)-antistoff eller anti-acetylert H4 (Anti Ac-H4) -antistoff . Identiske mengder av pre-immunoutfellingsstudier cellelysater fra ulike behandlingsforhold ble brukt til å starte immunoprecipitation. En alikvot av pre-immunoutfelling cellelysat ble direkte anvendt for å isolere DNA som «Input» kontroll. PCR-resultatene gjenspeiler histone acetylering nivåer. Presentert i den nedre panel for hver celle er et stolpediagram som viser kvantitativt acetyleringen nivåer av H3 og H4 ved de tre regionene
NIS
promotor basert på densitometriske målinger av det øvre felt. Resultatene er normalisert ved å dele de tilsvarende inngangssignaler og er presentert som forholdet mellom den indikerte behandling over kontrollen. «Control», behandling av celler med bilen; «Saha», behandling av celler med Saha alene; «R + P + S», behandling av celler med kombinert bruk av RDEA119, perifosine og Saha.
Diskusjoner
Radioaktivt jod ablasjon og adjuvant behandling er klassiske og standard behandling for skjoldbruskkjertelkreft , som drar nytte av den unike jodid transporterende funksjon av NIS i skjoldbruskkjertelen cellemembranen. Gitt det faktum at NIS er også normalt uttrykkes, i varierende grad, i flere ikke-thyroid vev, i den foreliggende undersøkelsen testet vi
NIS
ekspresjon og radiojodopptak i kreftceller avledet fra ikke-tyroid vev ved samtidig å undertrykke MAP kinase og PI3K /Akt stier og HDAC. Selv om rollen til MAP-kinase og PI3K /akt baner i ekspresjon av NIS ble undersøkt i melanom i våre tidligere studier [21], rollen av HDAC og histon acetylering i uttrykket av
NIS
i melanoma har ingen undersøkt. Vi har derfor også inkludert melanomceller i den foreliggende undersøkelse.
Vi var i stand til å indusere ekspresjon av NIS, i varierende grad, i melanomceller og lever, mage, kolon og brystcancer-celler, men ikke i ikke-epiteliale hjerne tumor-avledede celler, hvilket antyder at dette induserbar ekspresjon NIS kan begrenses til hudkreft celler og kreftceller av epitelial celle opprinnelse. Dette er interessant i overensstemmelse med fordelingsmønsteret av fysiologisk opptak av radiojod i vev av huden (restitusjonsfasen av brannsår), lever, mage, kolon, og bryst (ammende fase) på legemet skanning av tyroideacancer etter radiojod behandling [24 ] – [27]. Bemerkelsesverdig, vi også demonstrert radiojodopptak etter indusert uttrykk for NIS, i samsvar med NIS funksjonalitet i disse ikke-skjoldbrusk kreft celler. Våre data også for første gang viste at økt histone acetylering på
NIS
arrangøren var en viktig mekanisme involvert i uttrykket av NIS i disse ikke-skjoldbrusk kreft celler.
HDAC-hemmerindusert NIS ekspresjon ble tidligere påvist i HeLa-celler, og som i den samme studien, i HepG2 celler [28]. For å ta et steg videre, vi nylig vist synergistisk effekt av HDAC hemmer Saha på NIS uttrykk indusert ved å undertrykke MAP kinase og PI3K /Akt trasé i skjoldbruskkjertelen kreftceller, men i denne studien, ble histon acetylering ikke undersøkt [13]. I denne studien har vi for første gang direkte vist at undertrykkelse av MAP kinase og PI3K /Akt trasé forbedret histone acetylering på
NIS
promoter som en mekanisme for uttrykket av NIS indusert av samtidig målrette de to stier og HDAC i humane kreftceller.
demonstrasjon av NIS uttrykk på både mRNA og proteinnivåer samt radiojodid opptak i disse cellene etablerte den funksjonelle betydningen av induserbare uttrykk for
NIS
genet i disse ikke-thyroid kreft celler. Nivået av induserte NIS ekspresjon varierte mellom cellene som ble testet, med melanomcelle M14, hepatisk karsinom celle HepG2, og gastrisk karsinom celle MKN-7 og viser den mest robuste ekspresjon av NIS, noe som tyder på at NIS ekspresjon og radiojodopptak kan induseres fortrinnsvis i viss konkrete tilfeller av disse kreftformene for uklare grunner. Andre faktorer sannsynlig finnes som bestemmer induserbarhet av NIS-ekspresjon i disse kreftceller, som eksemplifisert ved østrogenreseptoren status som bestemmer induserbarhet av NIS-ekspresjon av all-trans-retinsyre i brystkreftceller [29]. Resultatene av denne studien har viktige kliniske implikasjoner. Melanom, leverkreft, og mage karsinom er vanlige humane kreftformer, alle med høy dødelighet, særlig i metastatisk og avanserte tilfeller. Som de sistnevnte tilfeller er vanligvis kirurgisk ubrukelige, er nye effektive medisinske behandlinger for tiden et presserende behov. Med induserbarhet av NIS ekspresjon og radiojodopptak i disse kreftceller vist i denne studien, kan det være mulig å behandle disse kreft ved hjelp av hjelpestoff radiojod som ved behandling av kreft i skjoldbruskkjertelen. Det faktum at induserte NIS ekspresjon var spesielt robust i noen cellelinjer, men ikke andre avledet fra disse kreftformene tyder på at dette radiojod behandling kan være effektiv i en undergruppe av pasienter med disse kreftformene.
Terapeutiske midler målrettet mot store signalveier, slik som MEK og BRAF inhibitorer for MAP-kinase pathway og Akt og mTOR inhibitorer for PI3K /Akt vei, så vel som HDAC-inhibitorer, blir for tiden aktivt utviklet klinisk [30] – [33]. Mange av dem har vist sterk terapeutisk potensial i ulike kreft hos mennesker, og noen har blitt godkjent for klinisk bruk. Det er derfor klinisk mulig å anvende disse inhibitorene til å målrette MAP-kinase og PI3K /Akt reaksjonsveier, og noen av dem i kombinasjon for å dobbeltkrum undertrykke de to banene for å indusere ekspresjon NIS. Den HDAC-inhibitor Saha, som også er blitt godkjent for behandling av visse kreftformer [34], kan inkluderes i denne medikamentkombinasjonsbehandling for å forbedre NIS uttrykk for radiojod behandling av kreftsykdommer. Ettersom disse stoffene selv er terapeutisk ved direkte å inhibere kreftcellevekst, anvendelse av dem i forbindelse med radiojod bruk for ytterligere å drepe kreftceller kan gjøre behandlingen en enda mer effektiv kjemoterapi. Dette kan vise seg å være en roman, og spesielt effektiv terapeutisk strategi for melanom og karsinomer i lever og tarmsystemet. Dette er teknisk lett formasjonen ved hjelp av klinisk bevist medikamenter for å indusere NIS ekspresjon og radiojodopptak i ikke-thyroid kreft celler, hvis bekreftet å være effektive i fremtidige studier, kan vise seg å være overlegne i forhold til NIS ekspresjon oppnådd ved genoverføring tilnærminger som det kan unngå viss sikkerhet, spesifisitet, effekt og tekniske kompleksitet problemstillinger knyttet til allment undersøkt plasmidfritt eller virus-mediert organ målrettet NIS genoverføring [4], [14].
Interessant, tidligere studier vist en basal uttrykk for skjoldbrusk gener i hudceller og melanomceller [35], [36]. Dette gir grunnlag for robuste indusert ekspresjon av skjoldbrusk gener og radiojodopptak i melanomceller ved å målrette den MAP kinase og PI3K /Akt stier og HDAC i våre nåværende og tidligere studier [21]. Det er også mulig, men gjenstår å bli undersøkt som en lav basal ekspresjon tilstand av skjoldbrusk-genene likeledes foreligger i hepatiske og gastriske karsinomer og andre krefttyper som ble undersøkt i dette studiet som blir robust aktiv ved undertrykkelse av de store signalveier.
Oppsummert denne studien for første gang demonstrerer robust NIS uttrykk og radiojodopptak i flere ikke-skjoldbrusk kreft celler ved samtidig målrette MAP kinase og PI3K /Akt stier og HDAC ved hjelp av sine hemmere. Ettersom mange av disse inhibitorer har allerede vist seg å være klinisk bart og lovende ved inhibering av forskjellige kreftformer, deres anvendelse for å indusere NIS uttrykk for adjuvant radiojod behandling i tillegg til sin direkte inhibering av kreftceller kan vise seg å være en ny og effektiv terapeutisk strategi for utvalgte ikke-skjoldbrusk kreft.
Materialer og metoder
humane kreftcellelinjer
Tretten humane kreftcellelinjer ble brukt i denne studien, inkludert melanom celler M14, UACC- 62 og A375; lever karsinomceller HepG2 og SK-Hep-1; gastric carcinoma celler MKN-7 og NUGC-4; colon carcinoma celler HT-29 og RKO; bryst carcinoma celler BT-20 og MDA-MB-231; glioblastom celle T98G; og astrocytom celle SNB-78. Disse cellene var fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia) og NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor /cellelinje Repository (Frederick, MD). M14, UACC-62, MKN-7, NUGC-4 og SNB-78-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (Mediatech, Inc., Manassas, VA) med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA). RKO, BT-20, MDA-MB-231, HepG2, SK-Hep-1, og T98G-celler ble dyrket i Eagles Minimum Essential Medium (ATCC, Manassas, VA) med 10% føtalt bovint serum. HT-29 celler ble dyrket i McCoys 5a-medium (ATCC, Manassas, VA) med 10% føtalt bovint serum. De A375-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (ATCC, Manassas, VA) med 10% føtalt bovint serum. Alle cellene ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2.
Under disse dyrkingsbetingelsene ble celler behandlet, der det er angitt, sammen med de MEK-inhibitor RDEA119, den Akt inhibitor perifosine, og den HDAC inhibitor Saha individuelt eller i kombinasjoner. DMSO og PBS ble brukt parallelt som bilen kontroll.
Western blotting
Celler ble lysert i RIPA buffer med standard proteasehemmere (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California) og standard Western blotting analysene ble utført som beskrevet tidligere [37] med primære antistoffer, inkludert anti-fosfo-ERK, anti-fosfo-Akt, anti-Ac-Histone H3, eller anti-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); anti-Ac-Histone H4 (Cell Signaling, Danvers, MA); eller anti-NIS-antistoffer (Millipore Corp., Billerica, MA).
RNA ekstraksjon og kvantitativ real-time PCR
Etter en 30-timers behandling av celler med de indikerte hemmere, total RNA ble isolert ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) følge instruksjonene fra produsenten. Tre mikrogram total RNA ble revers-transkribert ved hjelp Oligo-dT primere og hevet III RT (Invitrogen, Carlsbad, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Kvantitativ real-time PCR ble utført for å analysere uttrykk for
NIS
genet ved hjelp iTaq SYBR Grønn Supermix med ROX (Bio-Rad, Hercules, CA) på en ABI 7900HT PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA). p-aktin ble kjørt i parallell for å standardisere inngangs cDNA. Primerne designet for
NIS Hotell og
p-aktin
gener og metodene som brukes til å beregne relative uttrykk nivåer av
NIS
var som beskrevet tidligere [13].
radioaktivt jodid opptaksanalyse
radioaktivt jodid opptaksanalyse ble utført som beskrevet tidligere [13]. I korthet, etter en 30-timers behandling med de angitte inhibitorer, ble celler inkubert med 1 pCi Na
125I og 5 uM ikke-radioaktiv Nal i 2 ml medium på 6-brønners plater ved 37 ° C i 1 time. For å bestemme NIS-spesifikt opptak, ble parallelle celler behandlet på lignende måte med inhibitorene i tillegg ble behandlet med 200 uM NaCIO
4 i 30 minutter før Na
125I behandling. Mediet ble aspirert og cellene ble hurtig vasket tre ganger med Hanks balanserte saltløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Cellene ble så trypsinert og lysert med 1 ml 0,33 M NaOH. Parallelle plater av celler som ble behandlet identisk med inhibitorene, men uten radiojod inkubering ble anvendt for å bestemme antall celler ved slutten av forsøket. Radioaktiviteten assosiert med celler ble tellet med en gammateller og presenteres som cpm /10
6 celler etter korrigering for ikke-spesifikk binding radiojodid av celler i nærvær av NaCIO
4.
Kromatin immunpresipitering (chip) assay
ChIP analysen ble utført ved hjelp av EZ-Magna brikken kit (Millipore Corp., Billerica, MA) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, etter medikamentell behandling, 1 x 10
7-celler ble kryssbundet med 37% formaldehyd i 10 minutter, etterfulgt av inkubasjon med glycin-oppløsning i settet i 5 min. Etter 2 vaskinger med PBS ble cellene lysert og ultralydbehandlet 12 ganger i 10 sekunder ved 20% puls strømmen med Sonifier Cell Disrupter Modell Micros-150D (Branson, Danbury, CT). Den tverrbundne protein /DNA ble deretter inkubert over natten med anti-acetylert histon H3, anti-acetylert histon H4 antistoffer eller kontrollere ikke-spesifikk IgG, og renset ved hjelp av protein A-kuler. Etter vasking med bufferne i settet i den rekkefølgen i henhold til protokollen som tilbys, protein A-kuler med protein /DNA-komplekser ble inkubert med proteinase K ved 62 ° C i 2 timer med risting. DNA-fragmenter ble separert ved sentrifugering og deretter renset ved bruk av spinn kolonner. Tre par av primere som spenner over den minimale essensielle promoter område av NIS-genet ble anvendt i analysen som tidligere beskrevet [23]. Standard sluttpunkt PCR ble utført som følger: etter 3 minutter denaturering ved 95 ° C, ble reaksjonsblandingen kjørt i 32 sykluser ved 94 ° C, 60 ° C, og 72C ° hver i 30 sekunder, etterfulgt av en forlengelse ved 72 ° C i 8 min (for alle tre par av primere).
Statistical Analysis
dataene presentert her er representanter for i det minste to tilsvarende forsøk utført i duplikater eller triplikater. Forskjellene mellom gruppene ble analysert ved
t
test og en
P
verdi mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
