Abstract
Menneskelig bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC) er en kreft med en sturen prognose. Effekten av PDAC kreft terapi er ofte kortvarig; Men det er lite informasjon om hvordan denne sykdommen enhet så ofte får motstand mot behandling. Vi adopterte begrepet kreft stamceller (cscs) for å forklare mekanismen av resistens og evaluert effekten av en kandidat kreft narkotika å målrette disse behandlingsresistent cscs. Vi identifiserte en undergruppe av celler i PDAC med CSC funksjoner som ble beriket for aldehyd dehydrogenase (ALDH), en markør uttrykt i visse stilk /stamceller. Disse cellene var også svært motstandsdyktige mot, og ble ytterligere anriket ved behandling med gemcitabin. Tilsvarende kirurgiske prøver fra PDAC pasienter viste at de som hadde gjennomgått preoperativ kjemoterapi-strålebehandling oftere vises kreft med ALDH sterkt positive subpopulasjoner sammenlignet med ubehandlede pasienter. Viktigere, disse ALDH-høy kreftceller var følsomme for disulfiram, en ALDH inhibitor, når testet
in vitro
. Videre
in vivo
xenograft studier viste at effekten av disulfiram var additiv som for lav-dose gemcitabin når den brukes i kombinasjon. I konklusjonen, menneskelige PDAC-avledet celler som uttrykker høye nivåer av ALDH viser CSC funksjoner og har en nøkkelrolle i utviklingen av resistens mot anticancer behandling. Disulfiram kan brukes for å undertrykke denne terapi-resistente subpopulasjon
relasjon:. Kim SK, Kim H, Lee D-h, Kim T-s, Kim T, Chung C, et al. (2013) Reversere problematiske natur bukspyttkjertelkreft ved selektivt Targeting ALDH-High, terapiresistent kreftceller. PLoS ONE 8 (10): e78130. doi: 10,1371 /journal.pone.0078130
Redaktør: Benedetta Bussolati, Senter for molekylær bioteknologi, Italia
mottatt: 1 juli 2013; Godkjent: 17 september 2013; Publisert: 23 oktober 2013
Copyright: © 2013 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Creative forskningsinitiativ Program (2010-001827, https://www.nrf.re.kr). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Medforfatter Hoguen Kim er en PLoS ONE Editorial styremedlem, og forstår at dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
prognosen for pasienter med bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er svært dårlig. Bare 10-20% av PDACs er egnet for kirurgisk reseksjon ved førstegangsdiagnose, og svulsten tilbakefall har blitt rapportert å nå opp til 70-90%, selv hos pasienter som har gjennomgått kurativ reseksjon [1]. De terapeutiske muligheter i et flertall av pasientene etter hvert bli redusert til intensivert kjemoterapi og /eller strålebehandling [1,2]. Derfor er behandling av PDAC ekstremt utfordrende fordi den lett får motstand mot kjemoterapi-strålebehandling og blir problematiske.
En økende mengde forskning støtter konseptet av kreft stamceller (cscs) eller tumor initiere celler. Cscs karakter unike funksjoner, inkludert evnen til ubegrenset selvfornyelse, lang levetid, høy metastatisk potensial, og motstand mot kjemoterapi [3,4]. Dermed har cscs kommet for å bli anerkjent som en svulst sub-populasjon som bør kraftig målrettet [2,3,5]. Men som en praktisk sak, virkningsfullhetene for tiden tilgjengelige CSC-målrettet mot terapi er langt fra tilfredsstillende. Flere studier har validert rolle cscs i utviklingen av terapeutiske motstand i PDACs [4], og vist at de ofte er motstandsdyktige mot de mest brukte antikreftmidler, slik som gemcitabin og 5-fluorouracil [1,4,6].
i denne studien har vi antatt at begrepet cscs kunne forklare hvorfor effekten av standard kjemoterapi er ofte begrenset hos pasienter som får adjuvant kjemoterapi eller kjemoterapi-strålebehandling [7-11]. Vi videre en hypotese om at visse unike funksjonene cscs kan utnyttes til å re-bevisst PDACs til antikreftbehandlinger og deretter reversere problematiske natur; vår oppmerksomhet ble trukket til aldehyd dehydrogenase (ALDH), som har blitt anerkjent som en ny cscs markør spesielt som en del av et panel av stamcellemarkører [12-18]. Oppsamling av bevis støtter ideen om at øket ekspresjon av ALDH er assosiert med alvorlig prognose i bryst, lunge og prostata cancer [15,16,18]. Legge til denne listen, Rasheed et al. nylig rapportert at ALDH1-positive kreft i bukspyttkjertelen celler negativt påvirke overlevelsen av PDAC pasienter [12].
Disulfiram (1- [diethylthiocarbamoyldisulfanyl] N, N-dietyl-methanethioamide) er en irreversibel hemmer av ALDH som har blitt anvendt for å oppnå alkohol-unngåelsesadferd ved behandling av alkoholikere [19]. Disulfiram har fått oppmerksomhet som en kandidat kreft medisiner og til dags dato har blitt testet for flere solide tumorer, slik som brystkreft, melanom, og tykktarmskreft [20-22]. Selv om den nøyaktige mekanisme som ligger til grunn anticancer aktivitet av dette midlet ikke er blitt fullstendig klarlagt, har flere betydelige spor fremkom [20-26]. Nylig, Dalla Pozza et al. rapportert at kombinert behandling med gemcitabin og disulfiram med sink ion hemmet xenograft tumor vekst av kreft i bukspyttkjertelen celler [27]. Imidlertid er den direkte effekten av disulfiram på cscs av PDACs i forhold til ALDH ubestemt.
I denne studien utforsket vi relevansen av ALDH uttrykk og CSC populasjoner i PDAC. Vi sammenlignet responser på disulfiram mellom tumor sub-populasjoner med forskjellige nivåer av ALDH ekspresjon og funnet at ALDH sterkt positive celler var følsomme for disulfiram. Våre resultater tyder på anvendelsen av disulfiram som en anti-CSC middel som kunne forbedre effektiviteten av standard kjemoterapi mot PDAC.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
de følgende humane cellelinjer ble anvendt: CFPAC-1, MIA PACA-2, Panc-1, og ASPC-1 (bukspyttkjertelcancercellelinjer); hTERT-HPNE (normal pancreatic ductal epitel cellelinje). Alle cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) .De cellelinjer har blitt testet ved hjelp AmplFLSTR identifikator PCR Amplification kit (Applied Biosystems, Foster, CA, katt. 4.322.288) og godkjent av KCLB i februar 2013. Disulfiram og gemcitabin (Sigma) ble brukt for
in vitro
levedyktighet og
in vivo
xenograft analyser.
mennesketumorprøver
Denne retrospektive studien ble godkjent av Institutional Review Board of Yonsei University Medical Center. Skriftlig informert samtykke ble oppnådd fra hver pasient for lagring og bruk av prøven og medisinsk informasjon. Våre inklusjonskriterier definert en studie befolkning på 57 PDAC pasienter som hadde vært histologisk diagnostisert og operert Yonsei University Medical Center fra 2005 til 2008. Klinisk vurdering var utført basert på amerikanske Joint Committee on Cancer TNM (tumor-node-metastase) klassifikasjoner. Fordi stadium III og IV bukspyttkjertel kreft er unresectable henhold til TNM klassifiseringer [28], analyserte vi bare stadium II PDAC pasienter som fikk Whipples operasjon eller pylorus bevar pancreatoduodenectomy med lymfeknute disseksjon. For preoperativ kjemoterapi /CCRT, ble gemcitabin brukes i de fleste. (18/20; 90%) av pasientene
Flowcytometri
Alle cellelinjer ble analysert for å uttrykke ALDH av flowcytometri ved hjelp av en Aldefluor Kit (Aldagen, Inc.) å følge produsentens instruksjoner. For sammenligning av ALDH-lys og ALDH-negative celler, ble CFPAC-1 cancerceller sortert på grunnlag av intensiteten av deres ALDH-aktivitet målt ved hjelp av FACS (fluorescens-aktivert cellesortering, BD FACS Aria ™ II cellesorterer). Biotin-konjugert anti-CD24 og PerCP-Cy5.5 anti-CD44 antistoff (eBioscience) ble brukt i henhold til en immunfenotyping protokoll inkludert i håndboken som følger av leverandøren. DAPI (4 «, 6-diamidino-2-fenylindol) ble anvendt for å farge kjerner av levende celler. En PE Annexin V Apoptose Detection Kit I (BD Bioscience) ble anvendt i konjugering med 7-AAD (eBioscience) for å identifisere begynnelsen av apoptotiske kreftceller. For analyse av den LSK (lineage- Sca + c-kit +) hematopoetisk stamcelle-frekvens i benmargen fra murine femur og tibia, anvendte vi avstamning (CD11b-biotin, GR1-biotin, CD4-biotin, CD8-biotin, B220- biotin, Ter119-biotin) -streptavidin-PerCP-Cy5.5, PEcy7-konjugert SCA-en, og APC-konjugerte c-kit antistoffer (eBioscience).
Western blotting
Protein ekstrakter ble oppnådd fra celler eller tumormasser ved hjelp av en proteinekstrakt løsning (Pro-Prep, intron) etter produsentens anvisninger. Antistoffer som benyttes for Western blot-analyse inkludert anti-ALDH1A1 (Abcam), GAPDH og anti-β-aktin (Sigma).
Sanntids polymerase kjedereaksjon (PCR)
Isolering av RNA og cDNA syntese ble utført etter produsentens protokoll (RiboEx, intron). SYBR grønn-baserte rekke PCR ble utført ved hjelp av iQ5 Flerfarget Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Sekvensene til de forskjellige PCR-primerne er tilgjengelig på forespørsel. Relativ mRNA uttrykk nivåer ble beregnet ved hjelp av sammenlignende Ct metoden med normalisering p-aktin.
Muse eksperimenter
Animal omsorg og eksperimentelle prosedyrer ble utført med godkjenning av KAIST Animal Care og bruk komité . Vi brukte seks uker gammel mannlig
Foxn1
nu
SCID-mus for xenograft analyser (Orient Bio). Disulfiram tabletter (Ind-Swift) ble oppløst i maisolje (Sigma) for oral administrering via en sonde. Gemcitabin (Sigma) ble injisert intraperitonealt (i.p.) for
in vivo
regresjon analyser.
For måling av disulfiram respons, fordelt vi xenotransplanted mus inn disulfiram-behandlede mus (300 mg /m
2, to ganger ukentlig, administreres via en sonde) og maisolje behandlet kontroll mus. For måling av effekten av kombinasjonsbehandlingen med disulfiram og lav-dose av gemcitabin, fordelt vi xenotransplanted mus i fem grupper som, disulfiram-bare behandlede mus (300 mg /m
2, to ganger ukentlig, tilført via en sonde) , lav dose av gemcitabin-behandlede mus (40 mg /m
2 kroppsoverflateareal, IP, ukentlig) [29], lav-dose gemcitabin sammen med oral disulfiram, 10-ganger høyere dose av gemcitabin-behandlede mus (400 mg /m
2 kroppsoverflate, ukentlig), og PBS-behandlede kontroll mus (IP).
Det anbefales at muntlig stoff disulfiram er tatt en startdose på 500 mg etterfulgt av en daglig vedlikeholdsdose på 250 mg i human [30]. Dosen oversettelse fra en dyreart til en annen ved hjelp av kroppsoverflate (BSA) normalisering metoden anbefales [31]. Ifølge denne formelen, vi administreres disulfiram av 300mg /m
2 til mus to ganger i uken
per oral
.
Tumor volummålinger
Mus ble registrert for behandling når deres svulster hadde nådd en størrelse på minst 200 mm
3. Tumorstørrelse ble målt med en skyvelære, og tumorvolumet ble beregnet ved bruk av standardformelen, lengde x bredde
2 x 0,5 (mm
3). Startfasen i kreftcelle-injiserte mus ble overvåket daglig, og tumorstørrelse ble bestemt ukentlig i 3 til 5 uker, som angitt.
Immunhistokjemi
tumor xenografter ble fiksert i formalin, innstøpt i parafin , seksjonert og farget med hematoxylin og eosin (H E). Immunhistokjemi (IHC) med anti-ALDH1A1 antistoff (Abcam) ble utført ved hjelp av en Dako Envision Kit følge produsentens instruksjoner. Vi benyttet som intern standard for å definere ALDH1A1 sterkt positive celler når amplituden av signalet var lik eller større enn den for vanlige stammen /stamceller som befinner seg i den tumor-frie området av den samme glide (figur S1).
Vi utførte IHC analyse av ALDH1A1 og sammenlignet glandular differensiering med ALDH1A1 uttrykk på de menneskelige PDAC prøven (Figur 1a). For å uttrykke sammenhengen numerisk, telte vi ALDH1A1 sterkt positive kreftceller per totale kreftceller som består av godt differensierte og dårlig differensierte kjertler, henholdsvis. Vi undersøkte tre godt differensiert og tre dårlig differensierte PDAC tilfeller av menneske i 10 kraftige felt (X400 forstørrelse).
(A) IHC analyse av ALDH1A1 i kirurgiske eksemplarer av menneske kronisk pankreatitt og PDAC. Øvre paneler, H E flekken og nedre paneler, ALDH1A1 IHC flekken. (B) Hyppigheten av ALDH1A1 sterkt positive celler mellom godt differensiert og dårlig differensierte PDACs. (C) profiler av ALDH-aktivitet av humane PDACs i henhold til hvorvidt preoperative behandling ble utført. * P 0,05. Feilfelt representerer standardavvik.
Begrense-fortynning analyse
For å estimere hyppigheten av koloni-formasjon, fortynnet vi CFPAC-1 celler i en enkelt celle per brønn (100 ul) og dyrket på 96 brønners plate i 5% CO
2 inkubator ved 37 ° C. Etter to uker, vi telles hver koloni utvekst fra en enkelt celle og beregnede antall kolonier ut av totale brønner.
Livskraftig analysen
Vi utførte levedyktighet analysen av WST (vannløselig tetrazoliumsalt) fargestoff (EZ-cytox celleviabilitet analysen kit, itsBIO), i henhold til leverandørens instruksjoner. Prøvene ble lest av en mikroplateleser ved bruk av 450 nm bølgelengde for absorbansen. For å kvantifisere celleviabilitet, bestemt vi gjennomsnittsverdiene fra tredoble eller kvadruplikeres opplesninger og har fått standardkurve ved hjelp GraphPad Prism 5-programvaren.
statistikker
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 5-programvaren. For analyse av cellenes levedyktighet og tumorvolum etter behandling, ble betydelige forskjeller mellom middel bestemt ved en analyse av varians (ANOVA) etterfulgt av t-tester. IHC og flowcytometri resultatene ble analysert ved t-test, og forholdet av tumorer inneholdende ALDH-sterkt positive cancerceller i kirurgisk-resekterte PDACs ble sammenlignet ved chi-kvadrat-metoden. Vi sammenlignet kolonidannende effektivitet ved en analyse av t-test. Alle rapporterte P-verdier er tosidig, og P-verdier mindre enn 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans.
Resultater
ALDH1 uttrykk i en subtraksjon av tumorous og ikke-tumorous menneskelige bukspyttkjertelen vev
Terminal duktale celler har blitt rapportert som bukspyttkjertelen stilk /stamceller i flere studier [32-34] og Rovira et al. karakteriserte ALDH1 uttrykksmønster av disse cellene i mus [35]. Imidlertid har uttrykket mønster av ALDH1 i ikke-tumor humant pankreatisk vev ikke blitt rapportert. Vi undersøkte derfor menneskelige prøver og fant ut at, i likhet med de murine bukspyttkjertelen, menneskelig kronisk pankreatitt utstilt regenerativ metaplasi og prolifererende duktale celler som ville være den umiddelbare avkom av bukspyttkjertelen stilk /stamceller [32,35] {Rovira, 2010 # 96} viste også høye nivåer av ALDH1A1 uttrykket (figur 1A).
I menneskelig PDAC, varierte ALDH1A1 uttrykk mellom ulike celler over et bredt spekter fra negative til sterkt positiv (figur S1). Spesielt dårlig differensierte PDACs vises rikere ALDH1A1 sterkt positive kreftceller enn godt differensierte PDACs gjorde (figur 1A). Figur 1B viser statistisk signifikant forskjell i frekvens av ALDH1A1 sterkt positive celler mellom godt differensiert (n = 7) og dårlig differensiert (n = 7) PDACs. Vi telte kreftcellene i de 10 høyeffekts felt (X400) av representant lysbilde fra hver av PDAC prøver.
Deretter undersøkte vi de kirurgiske prøver som enten fikk preoperativ kjemoterapi /samtidige chemo-strålebehandling ( CCRT; n = 20) eller ikke (n = 37), og søkte for tilstedeværelsen av ALDH1A1 sterkt positiv (tabell S1). Disse cellene ble identifisert ved å sammenligne nivået ALDH1A1expression fra en individuell kreftcelle som i en normal stilk /stamceller som inngår i den tilstøtende tumorassosierte kronisk pankreatitt vev (figur S1). Vi fant at frekvensen av tumorer som innehar ALDH sterkt positive celler var høyere i de pasientene som fikk kjemoterapi /CCRT før kirurgi (80,0%) sammenlignet med den for de pasientene som fikk kirurgisk reseksjon alene (51,4%) (figur 1C) Dette tyder på at ALDH sterkt positive kreftceller ble beriket av konvensjonell kjemoterapi /CCRT.
kreft~~POS=TRUNC celler~~POS=HEADCOMP som sterkt uttrykt ALDH vise flere CSC har
For å etablere en
in vitro
plattform , vi vist en normal human pankreatisk duktus epitelcellelinje (hTERT-HPNE) og fire humane PDAC-avledede cellelinjer (CFPAC-1, MIA PACA-2, PANC-1 og ASPC-1). Vi målte ALDH-aktivitet i hver cellelinje ved hjelp av strømningscytometri Aldefluor sett (figur S2). Fordi ALDH1A1 er en viktig produkt av
ALDH
genet, fluorescens intensitet bør positivt korrelert med ALDH1A1 [36]. Således, kunne en subpopulasjon av celler som uttrykker høyt ALDH i flowcytometri skal stemme overens med den ALDH1A1 sterkt positive celler observert i humane PDAC prøver.
Vi definerte tre undersett av celler basert på deres strømningscytometrisk fordeling i forhold til portstyrings av DEAB negativ kontroll enten som ALDH-negative (celler lokalisert inne i regionen gated av DEAB kontroll), ALDH-høy (celler som ligger i regionen i løpet DEAB kontroll), og ALDH-lys (en undergruppe ALDH-høy celler). I hTERT-HPNE, den ALDH sterkt uttrykker undergruppe utgjorde mindre enn 5% av den totale befolkningen. Blant de fire PDAC cellelinjer, MIA PACA-2 (mer enn 90% av den totale populasjonen) og CFPAC-1 (ca. 50%) viste rikelig ALDH-høy kreftceller. I PANC-1 og ASPC-1-celler, prosenter av ALDH-høy populasjoner var sammenlignbare med eller mindre enn den til hTERT-HPNE celler. Konsekvent ble ALDH1A1 protein påvist i betydelige mengder i MIA PACA-2 og CFPAC-1 cellelinjer, men bare på minimale nivåer i PANC-en og ASPC-1 celler (Figur S2).
På bakgrunn av tidligere litteratur [12-14,18,37] og våre observasjoner, utledet vi at ALDH-lys kreftceller kan faktisk representere cscs. Tidligere studier har søkt ALDH, som en del av et panel med andre stamcelle markører, for å identifisere normale og kreft stamceller i bukspyttkjertelen [12,13,37]. Vi testet om ALDH alene kan brukes som en bona fide stamcelle markør og om celler med høye nivåer av ALDH uttrykk faktisk representert cscs. For å gjøre dette, vi brukte CFPAC-en cellelinje fordi det er kjent at en undergruppe av CFPAC-en er beriket med kreft stamceller lignende celler [38], og vi fant ut at CFPAC-en viste jevnt fordelt ALDH-high og -negativ kreft celler i Aldefluor analysen. Vi ytterligere sortert celler basert på størrelsen av deres ALDH-aktivitet er identifisert ved hjelp av FACS og sammenlignet den øvre og nedre 5% av celler, som vi definert som ALDH-lyse og ALDH-negative underpopulasjoner, respektivt. ALDH1A1 mRNA og proteinnivåer var i samsvar med ALDH nivåer identifisert ved FACS (figur S2).
Vi neste analysert CFPAC-1 celler med ulike nivåer av ALDH for co-uttrykk for CD24 og CD44, som ofte brukes stamcelle markører [14]. Dette viste at ALDH-aktivitet positivt korrelert med de av CD24 og CD44 (figur 2A). En begrensende fortynning kolonidannende analyse avslørte at ALDH-lyse-celler hadde større kolonidannende aktivitet enn ALDH-negative celler (figur 2B). Vi separat dyrkede ALDH-lys og ALDH-negative celler, og analysert ALDH aktivitet etter 2 uker (Figur 2C). Avkommet av ALDH-lyse celler omfattet både ALDH-lyse og ALDH-negative celler; dermed ALDH-lyse celler vellykket re-etablert den opprinnelige befolkningen. I kontrast, ALDH-negative celler mislyktes i å fullt igjen den ALDH-lyse cellepopulasjon.
(A) FACS analyse for CD24
+ CD44
+ CFPAC-1 celler kategorisert i ALDH
lyse, ALDH
høye og ALDH
negative grupper. (B) begrensende fortynning kolonidannende analyser utført med FACS-sortert CFPAC-1 celler. (C) ALDH-aktivitet målt ved hjelp av FACS-analyse i ALDH
negativ og ALDH
lyse CFPAC-1 celler dyrket separat i 2 uker. (D) Analyse av ALDH
lyse og ALDH
negative CFPAC-en celle levedyktighet etter behandling med gemcitabin. (E) Representant bilde og grafisk sammenligning svulst forekomst etter injeksjon av FACS-sortert ALDH
lyse eller ALDH
negative CFPAC-1 celler. Mus ble injisert med angitt antall celler (ALDH
Br, 5 x 10
5 [
n
= 5]; ALDH
Ng, 5 x 10
5 [
n
= 5], og ALDH
Ng, 1 x 10
6 [
n
= 5]; ALDH
Br, 1 x 10
6 [ ,,,0],
n
= 10]) på den høyre flanke og observert i 5 uker. 1X10
5ALDH
negative kreftceller ikke klarte å generere noen nodule, selv når observasjonsperioden ble utvidet til 14 uker. ALDH
Br, ALDH-lys og ALDH
Ng, ALDH-negative. * P 0,05 og *** P 0,0005.
Et annet godt karakterisert funksjon i cscs er deres motstand mot cellegift og /eller stråling terapi [3]. Derfor vurderte vi følsomheten av ALDH-lyse og -negative cancerceller til et konvensjonelt anticancer medikament, gemcitabin. ALDH-lys cancerceller var meget motstandsdyktig mot gemcitabin sammenlignet med ALDH-negative kreftceller, noe som krever betydelig høyere konsentrasjoner for å drepe 50% av cellene (den halve maksimale inhibitoriske konsentrasjon, IC
50) (figur 2D). Dette resultatet er kompatibel med de av menneskelig data som ALDH sterkt positive kreftceller ble beriket av konvensjonell kjemoterapi /CCRT (figur 1C).
Neste, vi subkutant injisert 5 x 10
5 FACS sortert CFPAC-en ADLH-lyse og -negative kreftceller i flankene av nakne mus, henholdsvis. De ALDH-lys xenopodet cellene begynte å danne en nodule innen 1 uke etter injeksjon, og etter 5 uker 60% av musene hadde lykkes dannet en knute (figur 2E). Men det samme antall ALDH-negative kreftceller ikke klarte å generere en hvilken som helst nodul, selv når observasjonstiden ble utvidet til 14 uker. ALDH-negative krefttyper var i stand til å etablere tumorknuter bare når injeksjonen antallet celler ble økt til 1 x 10
6. På histologisk undersøkelse, de xenograft knuter stammer fra ALDH-lys kreftceller utstilt strukturer med ulike grader av differensiering, alt fra godt differensierte celler som vellykket dannet organisert kjertlene med en lumen til dårlig differensierte celler som knapt dannet mislykket kjertel arkitekturer (figur S2). Tumorceller som befinner seg i dårlig differensiert områder ofte oppviste en relativt atypiske og pleomorfe morfologi og vist bisarre kjerner sammenlignet med de fra godt differensierte områder. IHC for ALDH1A1 viste sterkere positive celler i solid ark enn i velformede kjertler (Figur S2), på en måte som er forenlig med de menneskelige PDAC prøver (Figur 1A-B).
Resultatene indikerte at ALDH nivåer er tilstrekkelig til å definere en undergruppe av kreft i bukspyttkjertelen celler som viser dårlig differensiering, repopulating evner, motstand mot gemcitabin og større tumorgenisiteten, som er kompatible med de typiske trekk ved cscs.
ALDH-lys PDAC celler er selektivt og effektivt eliminert av disulfiram
Fordi vi identifisert ALDH-lys kreftceller som svært gemcitabin-resistente, vi mistanke om at ALDH sterkt positive celler var ansvarlige for kjemoterapi motstand. For å selektivt eliminere ALDH-lyse celler, vi slått til disulfiram, som er en velkjent irreversibel hemmer av ALDH [19], og undersøkt sammenhengen mellom nivået på ALDH uttrykk og disulfiram følsomhet i alle fire humane PDAC cellelinjer. Vi behandlet disulfiram og beregnes IC
50-verdier basert på levedyktighet analyser. Vi observerte en invers korrelasjon mellom prosentandelen av celler som uttrykker ALDH og IC
50-verdier for disulfiram (figur 3A og figur S3).
(A) IC
50 av disulfiram ifølge ALDH uttrykk. (B) Aldefluor analyse av ALDH aktivitet i CFPAC-1 celler behandlet med disulfiram (topp paneler) eller behandlet forbigående med disulfiram fulgt av narkotika tilbaketrekning (bunnpaneler). (C) Flowcytometrisk analyse for 7AAD
-AnnexinV
+ tidlige apoptotiske celler etter 12 timers behandling med disulfiram (10 uM). (D) Representative vestlige blotter viser ALDH1A1 proteinnivået i CFPAC-en i henhold til reguleringsforhold, disulfiram-behandlede celler, og i forbigående disulfiram-behandlede celler med påfølgende tilbaketrekking av disulfiram. (E) RT-PCR og QRT-PCR målinger av ALDH1A1 mRNA uttrykk i kontroll og disulfiram-behandlede celler. * P 0,05.
toksisitet av cytostatika på normalt vev er en annen viktig faktor under kreft behandling. Derfor simulert vi toksisiteten av disulfiram ved å måle deres effekter på en normal pankreas epitelcellelinje, hTERT-HPNE (figur S3). hTERT-HPNE celler var stort sett ufølsom for forholdsvis høye konsentrasjoner av disulfiram. Spesielt, IC
50 av disulfiram for hTERT-HPNE celler langt overskredet de av Mia Paca-2 og CFPAC-1 celler, noe som indikerer at en tilstrekkelig bred terapeutisk vindu kan sikres. I motsetning til virkningene av disulfiram på MiaPaCa-2 og CFPAC-1-celler, IC
50 verdier av disulfiram for PANC-1 og ASPC-1 cancercellelinjer var meget høy, en forskjell som vi tillegger den lave prosentandelen av PANC-en og ASPC-1 celler som uttrykker ALDH.
Deretter undersøkte vi videre effekten av disulfiram på ALDH-lys kreftceller, ved å vurdere ALDH nivåer ved flowcytometri i de gjenværende levedyktige CFPAC-1 kreftceller etter behandling med disulfiram (10 mm) i 12 timer ( Figur 3B). Disse forsøkene viste at disulfiram ikke påvirke ALDH-lav befolkning. For å teste om disulfiram effekten ble opprettholdt selv etter at det hadde blitt fjernet, hadde det blitt trukket fra media og cellene ble deretter dyrket i ytterligere 2 uker. Interessant, etter disulfiram var blitt trukket ut, cellene ikke klarte å gjenopprette det opprinnelige tumor hierarkiet og oppviste en vedvarende skift til venstre side av strømningscytometrisk fordeling. Dessuten, disulfiram ut til å indusere apoptotisk celledød i CFPAC-1-celler, økning av forholdet mellom 7AAD-negative og annexin V-positive celler som representerer populasjonen gjennomgår tidlig apoptose (figur 3C og fig S3). ALDH1A1 mRNA og proteinnivåer forble vedvarende redusert i repopulated celler, noe som indikerer at ALDH uttrykket ikke ble gjenopprettet (Figur 3D-E). Sammen er disse resultatene uthever potensialet for disulfiram for selektivt og effektivt målet og eliminere cscs som ellers ville være motstandsdyktig overfor vanlige antikreftbehandlinger. Videre utførte vi
in vitro
kolonidannende analyse ved hjelp av disulfiram-forbehandlet CFPAC-1 celler. Som forventet, disulfiram-forbehandlet celler dannet kolonier mye sjeldnere enn kontrollcellene gjorde (Figur S3).
Oral administrasjon av disulfiram selektivt fjerner ALDH-høy kreftceller og hemmer tumorvekst i kombinasjon med lavdose gemcitabin
For å teste effekten av disulfiram
in vivo
, vi subkutant injisert mus med CFPAC-1 kreftceller og delt xenotransplanted mus inn disulfiram-behandlet og maisolje behandlede kontrollgrupper. Tumorvekst ble betydelig forsinket ved administrasjon av disulfiram (figur 4A). IHC for ALDH1A1 av xenograft tumorer viste at hyppigheten av ALDH1A1 sterkt positive cancerceller ble merkbart redusert ved disulfiram-behandling (figur 4B). Vi telte kreftcellene i de 10 høyeffekts felt (X400) av representant lysbilde fra xenografttumorer av kontroll (n = 3) og disulfiram behandlet (n = 3) grupper. ALDH1A1 protein nivåer ble også redusert i disulfiram-behandlede tumorer (Figur 4C). En strømningscytometrisk analyse av ALDH-uttrykkende celler dissosiert fra svulster viste et skift til venstre for fordelingen i disulfiram-behandlede mus, noe som indikerer at ALDH-aktivitet ble undertrykt av disulfiram (figur 4D og fig S4). Vi utførte
in vivo
tumorigenitet analyser ved hjelp av disulfiram-forbehandlet CFPAC-1 celler. Som forventet, disulfiram-forbehandlet cellene hadde en tendens til å generere mindre knuter sammenlignet med tilsvarende kontrollceller (figur S4, P 0,05).
(A) vekst på CFPAC-1 xenografter ble målt og presenteres som prosentvis endring i volum etter behandling med disulfiram (300 mg /m
2, PO, n = 4). (B) Histologisk analyse og kvantifisering sammenligne hyppigheten av ALDH1A1 sterkt positive celler i kontroll og disulfiram-behandlede CFPAC-1 xenopodet mus. Grafen viser kvantifisering av ALDH1A1 sterkt positive celler i henhold X400 forstørrelse i kontroll og disulfiram-behandlede grupper. (C) Representant Western blot viser ALDH1A1 protein uttrykk i kontroll og disulfiram-behandlede svulster. (D) Aldefluor analyse av ALDH aktivitet i dissosiert kreftceller hentet fra kontroll og disulfiram-behandlet CFPAC-1 xenografter. (E) Vekstraten for CFPAC-1-xenografter ble målt og vist som den prosentvise volumendring etter behandling av mus med bærer (kontroll), disulfiram (300 mg /m
2, PO), lavdose gemcitabin (40 mg /m
2, IP), høy dose gemcitabin (400 mg /m
2, IP), eller disulfiramand lavdose gemcitabin sammen (n ≥ 3). * P 0,05, ** P 0.005, og *** P 0,0005.
Til slutt, vi utforsket for de potensielle fordelene ved kombinert disulfiram og gemcitabin terapi. Flere tidligere kliniske studier har vedtatt kombinasjonsbehandlinger basert på lav-dose gemcitabin protokoller for å unngå alvorlige toksisitet [29,39-41]. Tilsvarende har vi utviklet en protokoll som ble vedtatt lavdose gemcitabin [29] sammen med oral disulfiram. Oppmuntrende, kombinasjonen av lav-dose gemcitabin og disulfiram undertrykte effektivt tumorvekst i en grad sammenlignbar med den til en 10-ganger høyere dose av gemcitabin (figur 4E). Derfor konkluderer vi at disulfiram ikke bare kunne oppnå additive /synergis kreft effekter ved kombinasjonsbehandling i våre
in vivo
PDAC-modeller, men vil også muliggjøre en betydelig reduksjon i den nødvendige dosen av cytostatika.
diskusjon
behandlingen av PDAC er ekstremt utfordrende, da denne svulsten er ofte ildfast til konvensjonelle anticancer behandling. De fleste pasienter til stede med en inoperabel svulst når utgangspunktet diagnosen; derfor intensive neo-adjuvant og /eller postoperativ kjemoterapi /CCRT er indisert for flertallet av pasientene på en palliativ hensikt. I denne studien har vi beskrevet et scenario der PDAC blir vanskelige å antikreftbehandlinger fra perspektivet til cscs.
