Abstract
Formål
Metylering-indusert stanse av
PRSS3
har vært vist seg å være signifikant assosiert med invasiv blærekreft, og uttrykk for
C16orf74
genet locus har vist seg å korrelere positivt med
PRSS3.
Målet med denne studien var å evaluere forholdet mellom
C16orf74
uttrykk nivå og progresjon i ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC).
Materialer og metoder
C16orf74
mRNA nivåer ble undersøkt ved real -time revers transkriptase polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) -analyse av 193 vevsprøver fra pasienter med primær NMIBC. Expression data ble analysert i form av kliniske og eksperimentelle parametre. Kaplan-Meier kurver og multivariate Cox regresjonsmodeller, henholdsvis, ble brukt til å bestemme progresjonsfri overlevelse og for å identifisere uavhengige prediktive parametre av progresjon.
Resultater
analyse ved hjelp av Kaplan-Meier-kurver avslørt langvarig progresjonsfri overlevelse av høy-
C16orf74
-expressors sammenlignet med lav-uttrykkere (p 0,001). Multivariat Cox regresjonsanalyse viste at lav
C16orf74
mRNA uttrykk nivåer er en betydelig risikofaktor for sykdomsprogresjon hos pasienter med primær NMIBC (HR: 10,042, KI: 2,699 til 37,360, p = 0,001)
Konklusjoner
Redusert uttrykk for
C16orf74
korrelerer signifikant med progresjon i primær NMIBC.
C16orf74
uttrykk nivå representerer et potensielt nyttig markør for å forutsi utviklingen i primær NMIBC pasienter
Citation. Kim WT, Yun SJ, Park C, Kim IY, Moon SK, Kwon TG, et al . (2010) Identifisering av
C16orf74
som en markør av Progresjon i Primær Non-blærekreft. PLoS ONE 5 (12): e15260. doi: 10,1371 /journal.pone.0015260
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 16 august 2010; Godkjent: 02.11.2010; Publisert: 21.12.2010
Copyright: © 2010 Kim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (2010-0001730). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mer enn 90% av blære kreft er overgangs karsinomer, og de fleste er papillær, godt eller moderat differensiert ikke-muskel invasiv blærekreft (NMIBC) [1] – [2]. Etter endoskopisk reseksjon, oppstår kreft tilbakefall hos de fleste (50-70%) av pasientene med NMIBC [3]. Omtrent 20% av disse pasientene senere oppleve sykdomsprogresjon til muskel invasiv blærekreft (MIBC) etter riktig behandling, inkludert transuretral reseksjon (TUR) og intravesikal behandling med epirubicin, mitomycin-C, eller Bacillus Calmette-Guerin (BCG) [1] – [2]. Dermed hyppige tilbakefall etter TUR og påfølgende kreft progresjon er problematisk for pasienter og urologer likt. Nesten 25% av nydiagnostiserte blærekreftpasienter har MIBC, og de aller fleste av disse tilfellene er av høy histologisk grad. Nesten 50% av pasienter med MIBC allerede har okkult fjernmetastaser ved diagnosetidspunktet [1] – [2]
En rekke potensielle tumor markører er identifisert for blærekreft, men få har vist effekt i. når det gjelder å forutsi tilbakefall av sykdommen og progresjon. Imidlertid har flere nyere studier antydet at suppressor gener
p53
,
RUNX3
,
RASSF1A
, og
PRSS3
er nært forbundet med utvikling og progresjon av blærekreft [4] – [7]. Spesielt
RASSF1A Hotell og
PRSS3
promoter metylering er assosiert med avansert tumor stadium [7], noe som antyder at disse genene kan være assosiert med blærekreft progresjon.
PRSS3
igjen har vist seg å være positivt forbundet med
C16orf74
uttrykk [8].
C16orf74 plakater (MGC17624) genet locus er på kromosom 16q24.1, og dens funksjon har ennå ikke karakterisert. Resultatene av flere genom-wide studier har indikert at
C16orf74
er involvert i inflammatoriske prosesser. Tumornekrosefaktor (TNF) -α er en viktig regulator av den inflammatoriske kaskaden i kroniske inflammatoriske sykdommer, og i pasienter med inflammatorisk sykdom,
C16orf74
er sterkt assosiert med et anti-TNF respons [9].
C16orf74
er en hypoksi-regulert gen [10] – [11]. Winter et al. [10] rapporterte at
C16orf74
median RNA uttrykk nivå er en uavhengig prognostisk faktor for tilbakefall overlevelse i hode- og halskreft.
C16orf74
har også vist seg å være oppregulert i lymfeknute-positiv metastaser hos pasienter med oral tungen plateepitelkarsinom [12], og å korrelere positivt med
PRSS3
uttrykk i brystkreft [8 ].
Nylig rapporterte vi identifisering av en progresjon relatert gen klassifiserer som hadde sterk prediktiv verdi i form av sykdom utfall i NMIBC [13]. I den studien,
C16orf74
var en av åtte kandidatgener identifisert for å forutsi sykdomsprogresjon i NMIBC, noe som tyder på en mulig sammenheng mellom blærekreft og
C16orf74
. I denne studien, vurderte vi sammenhengen mellom
C16orf74 Kjøpe og NMIBC utbytte ved hjelp av data fra en tidligere studiepopulasjonen samt nye tilfeller, alle med langsiktig oppfølging.
Resultater
1. Baseline
Gjennomsnittsalderen for de 193 pasienter med primær NMIBC var 64,1 ± 14,0 år, og median oppfølgingsperioden var 44,9 måneder. Sytti-en pasienter (36,8%) opplevde tilbakefall og 20 (10,4%) opplevde progresjon. Andre baseline karakteristikker for pasientene er presentert i tabell 1.
2. Verdien av
C16orf74
mRNA uttrykk nivå som en prognostisk markør for progresjon
Forholdet mellom
C16orf74
mRNA uttrykk nivå og tid til progresjon ble analysert. Ved hjelp av en ROC-kurve, ble en cut-off verdi (11,7784) for progresjon med den høyeste kombinerte følsomhet (53,2%) og spesifisitet (85%) bestemt. Tid til progresjon var signifikant forskjellig mellom de høye og lave
C16orf74
mRNA uttrykk grupper, ved at tid til progresjon i high
C16orf74
uttrykk gruppen var signifikant lengre enn den lave uttrykk (p 0.001) (fig. 1). I univariate Cox regresjonsanalyse av flere clinicopathological variabler (alder, kjønn, tumorstørrelse, antall, kvalitet, scene, intravesikal terapi, og
C16orf74
mRNA uttrykk nivåer), alder, intravesikal terapi og
C16orf74
mRNA uttrykk nivåer var signifikante risikofaktorer for progresjon (p = 0,031, p = 0,034 og p 0,001, henholdsvis). I multivariat Cox regresjonsanalyse, alder og lav
C16orf74
mRNA uttrykk nivåer var vesentlige risikofaktorer for progresjonsfri overlevelse hos pasienter med primær NMIBC (HR: 1,049, KI: 1,005 til 1,094, p = 0,030, og HR : 10,042, CI: 2,699 til 37,360, respektivt) p = 0,001 (tabell 2). I multivariat Cox regresjonsanalyse hos pasienter med intravesikal terapi, alder og lave C16orf74 mRNA uttrykk nivåer var vesentlige risikofaktorer for progresjonsfri overlevelse hos pasienter med primær NMIBC med intravesikal terapi (HR1.055, KI: 1,005 til 1,108, p = 0,031; og HR: 14.170, CI:. 2,719 til 73,837, p = 0,002, henholdsvis)
Diskusjoner
Trypsin er et medlem av serinproteasefamilien kodet av tre trypsinogen gener inkludert
PRSS1
,
PRSS2 Hotell og
PRSS3
kode trypsinogen I, trypsionogen II, og trypsinogen IV (også kjent som mesotrypsinogen), henholdsvis [14] – [16] . Dette enzym har vært kjent som en potent proteolytisk enzym som kan ødelegge vev [17] – [18]. Det er motstridende rapporter i litteraturen av den rollen trypsin eller PRSS3 i tumorprogresjon, med enkelte studier tildele en positiv rolle [19] – [23], mens andre har rapportert at trypsin eller PRSS3 spiller en svulst undertrykkende rolle. Ekspresjonen av PRSS3 er redusert i blæren, spiserøret, og mage kreft, og tap av PRSS3 uttrykk skyldes epigenetisk stanse gjennom promoter hypermethylation [7], [24] – [25]. Spesielt har stanse av
PRSS3
av arrangøren metylering vært signifikant assosiert med invasiv tumor stadium i blærekreft [7].
uttrykk for
C16orf74
har vist seg å korrelerer positivt med
PRSS3
. Hockla et al. [8] rapporterte at
C16orf74
er ned regulert av knockdown av
PRSS3 Hotell og oppregulert ved mesotrypsin behandling. Hittil har det ikke vært noen rapporter om en sammenslutning av
C16orf74
med blærekreft, unntatt som angitt i et tidligere arbeid av forfatterne [13]. Her, analyserte vi forholdet mellom mRNA uttrykk nivåer av
C16orf74 Hotell og progresjon i primær NMIBC. Redusert uttrykk for
C16orf74
var signifikant assosiert med sykdomsprogresjon i NMIBC pasienter, noe som tyder på at
C16orf74
har en svulst undertrykkende rolle, lik
p53, RUNX3 Hotell og
PRSS3
, i sykdomsprogresjon. Hittil funksjonen til
C16orf74
er ukjent, og flere studier er nødvendig for å definere nøyaktig sti der
C16orf74
påvirkninger progresjon i grunnskolen NMIBC.
Vanligvis klinisk og patologiske parametere som svulst klasse, tumor stadium, lymfatisk invasjon, tumor størrelse, CIS, papillær eller solid tumor arkitektur, og multifokaliteten har vært betraktet som nyttige prognostiske parametere for sykdomsutvikling i NMIBC. Av disse faktorene, generelt svulst klasse, etappe, og tilstedeværelse av CIS er ansett som den viktigste. I denne studien, intravesikal terapi var en risikofaktor for progresjon ved univariat analyse. Det er imidlertid mulig at pasienter som fikk intravesikal terapi var i en klinisk høyrisikogruppe for tilbakefall eller progresjon, snarere enn at behandlingen påvirkes progresjon [26]. Ulike molekylære markører har også blitt evaluert for sykdomsprogresjon. Nylig har flere studier identifisert mulige progresjon relaterte gener i NMIBC bruker genekspresjonsanalyser [27] – [29]. Wang et al. [27] foreslått en 57-gen panel for å bidra til å forutsi utviklingen i NMIBC. Birkhahn et al. [28] rapporterte at
HRAS
,
VEGFR3
, og
VEGF
uttrykk nivåer var knyttet til progresjon med 81% sensitivitet og 94% spesifisitet. Eguchi et al. [29] rapporterte at tapet av 8p23.3 er en markør for å forutsi progresjon og tilbakefall i NMIBC. Tidligere identifiserte vi en kandidat progresjon relatert gen klassifiserer som hadde sterk prediktiv verdi i form av sykdom utfall i NMIBC [13]. Selv
C16orf74
er en enkel molekylær markør innenfor denne kandidaten progresjon relaterte genet klassifikator, var det tilstrekkelig å forutsi risikoen for progresjon i NMIBC med en sterk hazard ratio på mer enn 10 på multivariat analyse.
i denne studien har vi undersøkt mRNA uttrykk nivåer av
C16orf74
i humane primære NMIBC vev i en relativt stor befolkning med en langsiktig oppfølgingsperioden, sammen med flere kjente kliniske risikofaktorer, blant annet alder , tumorstørrelse, antall tumorer, T-kategori, for tumor karakter, og intravesikal terapi [30] – [31]. Disse aspektene i studiedesign låne styrke til resultatene, og det sterkeste at
C16orf74
kan være en klinisk nyttig prediktor for progresjon i primær NMIBC.
I konklusjonen, redusert uttrykk for
C16orf74
var signifikant assosiert med progresjon i grunnskolen NMIBC, og uttrykket nivået av
C16orf74
var en uavhengig prognostisk determinant for tumorprogresjon.
C16orf74
kan spille en nøkkelrolle i utviklingen av NMIBC. Dermed
C16orf74
uttrykk nivå representerer en nyttig markør for å forutsi utviklingen i primær NMIBC pasienter.
Materialer og metoder
1. Etikk Uttalelse
Den etiske komiteen for Chungbuk National University godkjent denne protokollen, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hvert fag. Innsamling og analyse av alle prøvene ble godkjent av Institutional Review Board of Chungbuk National University.
2. Pasienter og vevsprøver
Primær NMIBC prøver fra pasienter med histologisk verifisert overgangsordning celle carcinoma oppnås ved vårt institutt ble brukt for den aktuelle studien. Pasienter med samtidig carcinoma
in situ plakater (CIS) eller en kortsiktig oppfølgingsperioden (mindre enn 6 måneder), og de som gjennomgikk radikal cystektomi eller for hvem det var ufullstendig datainnsamling, ble ekskludert for å gjøre studiepopulasjonen mer homogen. Totalt 193 primær NMIBC Prøvene ble analysert.
Alle svulster ble macrodissected, vanligvis innen 15 minutter etter kirurgisk reseksjon. Hver blærecancer prøve ble bekreftet ved patologisk analyse av en del av vevsprøve i ferskt frosset seksjoner fra TUR prøver, og ble deretter frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C inntil bruk. En annen TUR ble utført 2-4 uker etter den første reseksjon når en blærekreft prøven ikke inkluderer riktig muskel eller når høyverdig svulst ble oppdaget [32]. Pasienter som hadde en T1 svulst, flere svulster, store svulster (≥3 cm i diameter), eller høygradig Ta NMIBC fått en syklus av intravesikal behandling (BCG eller mitomycin-C) [26], [32]. Hvis en pasient nektet intravesikal behandling, ble det ikke gitt etter TUR. Behandlingsrespons ble vurdert ved cystoskopi og urin cytologi. Pasienter som var fri for sykdom innen 3 måneder etter behandling ble vurdert hver 3. måned for de første 2 årene, og deretter hver 6. måned etterpå [26], [32]. Svulster ble iscenesatt og gradert etter 2002 TNM klassifisering og 1973 WHO karaktersystemet, henholdsvis [32] – [33]. Tilbakefall ble definert som tilbakefall av primær NMIBC med en lavere eller samme patologisk stadium, og progresjon ble definert som sykdom med en høyere TNM stadium ved tilbakefall.
3. RNA-ekstraksjon og konstruksjon av cDNA
RNA ble isolert fra vev ved anvendelse av 1 ml TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) og homogenisering i en 5 ml glassrør. Homogenatet ble overført til et 1,5 ml rør og deretter blandet med 200 ul kloroform. Etter inkubering i 5 minutter ved 4 ° C, ble homogenatet sentrifugert i 13 minutter (min) ved 13.000 x
g
ved 4 ° C. Den øvre vandige fasen ble overført til et rent rør og deretter 500 mL isopropanol ble tilsatt. Blandingen ble inkubert i 60 min ved 4 ° C, og deretter røret ble utsatt for sentrifugering i 8 minutter ved 13 000 x
g
, 4 ° C. Den øvre vandige fasen ble fjernet og blandet med 500 ul av 75% etanol, og deretter sentrifugert i 5 minutter ved 13000 x
g
, 4 ° C. Etter kassering av den øvre vandige lag, ble pelleten tørket ved romtemperatur, oppløst i dietylpyrokarbonat (DEPC) -behandlet vann, og deretter lagret ved -80 ° C. Kvaliteten og integriteten av RNA ble bekreftet ved agarosegelelektroforese og etidiumbromidfarging, etterfulgt av visuell inspeksjon under ultrafiolett lys. cDNA ble fremstilt fra 1 pg av total RNA ved anvendelse av en første-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll.
4. Real-time PCR
Real-time PCR amplifisering ble utført med en Rotor Gene 6000 instrument (Corbett Research, Mortlake, Australia) for å kvantifisere uttrykk for
C16orf74
. Real-Time PCR-analyser ble utført i mikro-reaksjonsrørene (Corbett Research, Mortlake, Australia) med SYBR Premiks EX Taq (TAKARA BIO INC., Otsu, Japan). Primere som brukes til forsterkning var
C16orf74 plakater (179 basepar) forstand (5′-AAT GTG TGT CAG CAG CAG CA-3 «) og anti-sense (5»-TTT CTC CAT CAT CTG GGC AC-3 «). PCR reaksjonen ble utført i et sluttvolum på 10 ul som består av 5 pl av 2 x SYBR forblanding EX Taq-buffer, 0,5 ul av hver av 5′- og 3»-primeren (10 pmol /pl) og 1 pl av prøven cDNA. Produktet ble renset med QIAquick Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), kvantifisert med et spektrofotometer (Perkin Eimer MBA2000, Fremont, CA), og deretter sekvensert med en automatisert laser fluorescens sequencer (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Foster City, WI). Ti-ganger seriefortynninger av en kjent konsentrasjon av produktet (100 pg /mL til 0,1 pg /ul) ble anvendt for å etablere standardkurven for real-time PCR. Den sanntids-PCR-betingelsene var som følger: en syklus på 20 sekunder (sek) ved 96 ° C, etterfulgt av 40 sykluser med 2-sek ved 96 ° C for denaturering, 15 sek ved 60 ° C for gløding og 15 sek ved 72 ° C for forlengelse. Smelte program ble utført ved 72-95 ° C med en oppvarmingshastighet på 1 ° C pr 45 sek. Spektrale data ble tatt og analysert ved hjelp av Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0 Build 14 (Corbett Research, Mortlake, Australia). Alle prøver ble kjørt i triplikat.
glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH)
ble analysert som en endogen RNA referanse genet og genekspresjon ble normalisert til uttrykk av
GAPDH
.
5. Statistisk analyse
For å normalisere svært skjev fordeling av mRNA uttrykk nivåer av
C16orf74
, dataene ble naturlig log transformert og deretter tilbake forvandlet for tolkningen av resultatene [34]. Mottaker operasjonelle egenskaper (ROC-kurver) ble anvendt for å bestemme den optimale grensepunktet for mRNA nivå som ga det høyeste kombinerte sensitivitet og spesifisitet for progresjon. Ved hjelp av disse verdiene, ble pasientene klassifisert i høye eller lave
C16orf74
uttrykk grupper. Kaplan-Meier-metoden ble brukt til å beregne tid til progresjon, og forskjeller ble vurdert ved hjelp av log-rang statistikk. Den prognostiske verdien av
C16orf74
i form av progresjon ble analysert ved hjelp av multivariate Cox proporsjonal fare regresjonsmodeller. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 12.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL), og en p-verdi på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
.
