Abstract
Bakgrunn
Podocalyxin lignende 1 (PODXL) er en celle-adhesjon glykoprotein assosiert med aggressiv svulst fenotype og dårlig prognose i flere former for kreft. Målet med denne studien var å undersøke PODXL uttrykk i magekreft ved bruk av to forskjellige antistoffer.
Metoder
Etter svulst-microarray og immunhistokjemi vi evaluert PODXL uttrykk i tumorprøver fra 337 pasienter som gjennomgikk kirurgi ved adenokarsinom i Helsingfors universitetssykehus. Vi brukte to forskjellige antistoffer:. HPA2110, som er en polyklonale antistoff og en in-house monoklonalt antistoff kalt HES9, for å undersøke sammenhengen av PODXL uttrykk med clinicopathologic variabler og pasient overlevelse
Resultater
PODXL farging var positive med det polyklonale antistoff i 153 (57,5%) tilfeller og ved det monoklonale antistoff i 212 (76%). Polyklonale antistoff uttrykket var forbundet med tarmkreft type (p 0,001). Monoklonalt antistoff farging var assosiert med alder over 66 (p = 0,001), med tarmkreft (p 0,001), og med liten tumorstørrelse (≤ 5 cm; p = 0,024). Begge antistoffer ble forbundet med høy S-fase fraksjon (p = 0,022; p = 0,010), og høy tumor proliferasjon indeks (Ki-67; p = 0,003; p = 0,001). PODXL positivitet av det polyklonale antistoff indikerte redusert gastrisk cancer-spesifikk 5 års overlevelse på 24,0% (95% CI 16,9 til 31,1), sammenlignet med 43,3% (95% CI 33,7 til 52,9) for pasienter med PODXL negativitet (p = 0,001 ). Resultatet holdt seg betydelig i multivariabel analyse. (HR = 3,17, 95% KI 1,37 til 7,34, p = 0,007)
Konklusjon
I magekreft, er en PODXL uttrykk av polyklonale antistoff HPA2110 uavhengig markør for dårlig prognose
Citation. Laitinen A, Böckelman C, Hagström J, Kokkola A, Fermer C, Nilsson O et al. (2015) Podocalyxin som en prognostisk markør i magekreft. PLoS ONE 10 (12): e0145079. doi: 10,1371 /journal.pone.0145079
Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, CANADA
mottatt: 15 september 2015; Godkjent: 29 november 2015; Publisert: 16.12.2015
Copyright: © 2015 Laitinen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Finska Läkaresällskapet, Kurt och Doris Palander Foundation, Sigrid Juselius Foundation, og Medicinska understödsföreningen Liv och Hälsa. Fujirebio Diagnostics AB og utsikt, stor Onsen Consulting gitt støtte i form av lønn for forfattere CF og PÅ, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de siste tiårene, har forekomsten av magekreft redusert, spesielt i vestlige land, tilsynelatende på grunn av fallende forekomst av
Helicobacter pylori
, til bedre hygiene, og til mindre overfylt liv. Fordi magekreft har en dårlig prognose, er det fortsatt globalt den nest vanligste årsaken til kreftrelaterte dødsfall [1]. Den 5-års overlevelse, til tross for kurativ kirurgi, er bare ca 10-30% [2]. Den høye dødeligheten skyldes i hovedsak sen diagnose.
UICC Tumor Node Metastase (TNM) klassifikasjon er uten tvil den mest konsekvente prognostisk klassifiseringssystemet i dag. Men selv innenfor samme scene gruppe tumorer, kan forløpet av sykdommen variere. Opprette metoder for mer nøyaktig vurdering av neoplasi aggressivitet vil være av verdi ved vurdering av prognosen for enkelte pasienter med magekreft.
Podocalyxin lignende 1 (PODXL) er en anti-klebende trans glykoprotein som tilhører CD34 familie . Det uttrykkes vanligvis ved nyre podocytes [3], hæmopoietiske stamceller [4], vaskulær endothelia [5], og bryst epitelceller [6].
Den kliniske betydningen av PODXL i kreft progresjon er undersøkt i ulike karsinom typer, først som en stamcelle markør i testikkelkreft [7]. En senere funn er at tumor-celle-spesifikke PODXL ekspresjon er assosiert med en mer aggressiv fenotype og negativt resultat i flere krefttyper, for eksempel i bryst [6], prostata [8], eggstokk [9], kolorektal [10- 12], urothelial blære [13], bukspyttkjertel [14], og periampullary kreft [15].
Formålet med denne studien var å undersøke PODXL uttrykk i magekreft for å avsløre dens mulige rolle i aggressivitet og prognose. Vi besluttet å bruke to PODXL antistoffer som gjenkjenner forskjellige epitoper: et monoklonalt in-house HES9 antistoff og et kommersielt tilgjengelig polyklonalt antistoff HPA2110. Nylig fikk vi vite at disse to antistoffer er uavhengige markører for dårlig prognose ved kolorektalkreft [12]. De to antistoffene kan gjenkjenne to grupper av pasienter med kolorektal kreft, som begge har en dårlig prognose; kombinert bruk av disse antistoffene avdekket en pasientgruppe med enda dårligere prognose [16].
Materialer og metoder
Pasienter
Studien omfattet 337 påfølgende pasienter som gjennomgikk kirurgi for histologisk verifisert adenokarsinom i ventrikkel ved Kirurgisk avdeling, Helsinki University Hospital, fra 1983 til 1999. Diagnose og iscenesettelse i henhold til UICC klassifisering gitt 100 (29,7%) stadium IA-IB, 41 (12,2%) stadium II, 96 (28,5%) stadium IIIA-IIIB, og 100 (29,7%) Trinn IV pasienter. Lymfe-metastaser oppstod i 184 (55%) og fjernmetastaser i 93 (28%) tilfeller. Median alder var 66 år (range 30-87) og 163 (48%) var kvinner og 174 (52%) menn. Total eller partiell gastrektomi med utvidet (D2-D2 +) lymphadenectomy ble utført i 34 (10%) pasienter, total gastrektomi med D1-lymphadenectomy i 161 (48%), og delsum gastrektomi med D1-lymphadenectomy i 142 (42%). I alt ble 143 (43%) pasienter operert med kurativ hensikt, mens 176 (52%) gjennomgikk palliativ kirurgi. Ingen fikk neoadjuvant behandling, men 32 (9%) pasienter fikk postoperativ adjuvant behandling (28 kjemoterapi, radioterapi 2; 2 fikk begge). Overlevelsesdata og dødsårsak frem til november 2013 kom fra pasientjournaler, folkeregisteret Centre of Finland, og Statistisk Finland.
Studiet ble godkjent av Kirurgisk Ethics Committee of Helsinki University Hospital (Dnro HUS 226 /E6 /06, utvidelse TMK02 §66 17.4.2013) og nasjonale tilsynsmyndighet for velferd og helse ga tillatelse til å bruke vevsprøver uten individuelt samtykke i denne retrospektive studien (Valvira Dnro 10041 /06.01.03.01 /2012).
Vevsprøver
Formalin-fiksert og prøver kirurgiske vev parafininnstøpte kom fra arkivene til Avdeling for patologi. Pasienten vev ble avidentifisert og analysert anonymt. Histopathologically representative områder av vevsprøver ble definert og merket på haematoxylin- og eosin-farget lysbilder. Tre kjerner fra hver svulst blokk ble samplet med 0,6 mm-punchers og innebygd i en ny parafin blokk med et halvautomatisk vev microarrayer (Tissue Arrayer 1, Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, USA). Av de seks vev-array-blokker som er tilberedt, inneholdt hver 24-192 tumorprøver. Deler av 4 mikrometer hvert ble kuttet og behandlet for immunhistokjemi.
Antistoffer
Vi har sammenlignet to PODXL antistoffer mot forskjellige epitoper. Det polyklonale antistoff (HPA2110, Atlas Antibodies, Stockholm, Sverige) ble dannet mot et peptid med aminosyrerestene 278-415 av PODXL, og det monoklonale antistoff i huset HES9 [12] gjenkjenner aminosyrerestene 189-192 av PODXL . Begge epitoper forekommer i den ekstracellulære delen av PODXL molekylet. Den epitopsekvens av HPA2110 matcher tre proteinkodende PODXL spleisevarianter med 100% (PODXL 001, 005, og 201, The Human Protein Atlas). Den fjerde spleisevariant samsvarer med 87% (PODXL 202). De antigener i HES9 varer med 100% med alle spleisevarianter. Antistoffene er beskrevet i detalj [12,17,18].
Immunohistochemistry
Snittene ble fiksert på lysbilder og tørket i 12 til 24 timer ved 37 ° C, deretter ble deparaffinized i xylen og rehydrert ved gradvis avtagende konsentrasjoner av etanol i destillert vann. For antigen gjenfinning, ble delene behandlet i en forbehandling modul (Lab Vision Corp, Fremont, CA, USA) i Tris-HCl-buffer (pH 8,5) i 20 minutter ved 98 ° C. Seksjonene ble farget i en Autostainer 480 (Lab Vision) av Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase /DAB +, Kanin /Mouse (Dako, Glostrup, Danmark). Skinnene ble behandlet i 5 minutter med 0,3% Dako REAL Peroxidase-Blocking Solution for å blokkere endogene peroxidases. Deretter ble objektglassene inkubert i 1 time med et polyklonalt (fortynning 1: 250 = 2,5 ug /ml) eller monoklonalt antistoff (fortynning 1: 500 = 5 ug /ml) ved romtemperatur. Som en positiv kontroll for hver farging serie vi brukte prøver fra nyrevevet.
Skårer for immunoreaktivitets
HPA2110 og HES9 immunopositivity ble gradert i alle tilgjengelige kreft kjerner. Cytoplasmatiske PODXL og HES9 immunopositivity ble scoret som 0-3 basert på intensiteten av kreftcelle immunoreaktivitets, og den høyeste poengsummen av de tre kjerner servert for videre analyse. Negativ immunoreaktivitets ble scoret som 0, diffuse svak cytoplasma positivitet som en, moderat positiv eller fokalt sterkt positiv intensitet som to, og homogent sterk intensitet som 3. Alle prøvene ble scoret uavhengig av to forskere (AL og JH) blindet klinisk status og utfall data. Prøver med uharmoniske score ble vurdert på nytt, og konsensus poengsum servert for videre analyse. Vi var i stand til å behandle og scorer HPA2110 flekker i 266 og HES9 flekker i 279 prøver.
Statistisk analyse
Foreninger mellom HPA2110 og HES9 positivitet og clinicopathologic variabler ble vurdert av chi-kvadrat test eller Fishers eksakte test. Korrelasjoner mellom de to podocalyxin antistoffer ble bestemt ved Spearman korrelasjonstest. Sykdomsspesifikk overlevelse ble beregnet fra datoen for kirurgi for å dø av magekreft.
Overlevelseskurver ble konstruert i henhold til Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med logrank test. For univariable og multivariat overlevelse analyse, Cox proporsjonal risikomodell hadde følgende kovariater kom inn: alder, kjønn, scene, klasse, Laurens klassifisering, tumorstørrelse, tumor beliggenhet, PODXL uttrykk bestemmes av HPA2110 farging og HES9 flekker, ploidiresultat DNA, S- fasefraksjon, Ki-67 ekspresjon, og p53-ekspresjon. Stage, klasse, Laurens klassifisering, tumor størrelse, DNA ploidiresultat, S-fase brøkdel, og uttrykk for PODXL, HES9, Ki-67, og p53 ble ført som kategoriske kovariater. DNA ploiditet og S-fase brøkdel hadde vært vurdert tidligere av flowcytometri, og p53, og uttrykk Ki-67 vevet ved immunhistokjemi [19,20]. En p-verdi på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser ble gjort med IBM SPSS statistikk versjon 20.0 for Mac (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).
Resultater
Immunohistochemistry
Cytoplasmatiske HPA2110 reaktivitet, evaluert i 266 tilfeller var negativ i 113 (42,5%), svakt positiv i 120 (45,1%), moderat positiv i 29 (10,9%), og sterkt positive i 4 (1,5%) tilfeller. Av de 279 tilfellene hell farget for cytoplasma uttrykk ved HES9, 67 (24,0%) var negative, 137 (49,1%) svakt positiv, 54 (19,4%) moderat positiv, og 21 (7,5%) sterkt positiv. I den endelige analysen, svakt til sterkt positiv HPA2110 og HES9 immunoreaktivitets (score 1-3) ble sett på som positivt uttrykk. Representative bilder av immunostainings er i figur 1. Både HPA2110 og HES9 farget jevnt i hele cytoplasma, med kjernefysiske eller celle membran immunopositivity merkbar. Den cytoplasmatiske uttrykk for podocalyxin av to forskjellige antistoffer HPA2110 og HES9 korrelert (r
s = 0,455, p 0001, Spearmans rank korrelasjon test)
Bilder AD farget med polyklonale HPA2110 antistoff og EH med. det monoklonale HES9 antistoff. Original forstørrelse 40x
Association of HPA2110 og HMS-9 med clinicopathological variabler og biomarkører
sammenslutninger av HPA2110 og HES9 med clinicopathological variabler og molekylære biomarkører var som følger:. Positive (score 1-3) HPA2110 farging ble forbundet med intestinal krefttype (p 0,001), positiv HES9 farging var assosiert med alder over 66 (p = 0,001), med tarmkreft (p 0,001), og med små (≤ 5 cm) tumorstørrelse (p = 0,024). Både HPA2110 og HES9 var assosiert med høy S-fase fraksjon (SPF, p = 0,022; p = 0,010) og høy spredning indeks av tumoren (Ki-67, p = 0,003; p = 0,001) (tabell 1 og 2).
Survival analyserer
Positiv HPA2110 uttrykk indikerte en magekreft spesifikk 5-års overlevelse på 24% (95% KI 16,9 til 31,1), sammenlignet med pasienter med negativ HPA2110 farging med 5-års overlevelse på 43% (95% KI 33,7 til 52,9) (p = 0,001 log-rank test) (figur 2 og tabell 3). Den magekreft spesifikke 5-års overlevelse for pasienter med HES9-positiv tumor farging var 30% (95% KI 23,1 til 36,1), og for de med negativ farging, 40% (95% KI 27,7 til 52,1; p = 0,130 log -rank test) (figur 2).
(A) HPA2110 og (B) HES9 uttrykk og overlevelse hos pasienter med ventrikkelkreft.
i subgruppeanalyse, HPA2110 var en signifikant markør av dårlig prognose i grupper av yngre pasienter (alder i henhold til 66 år) (p = 0,006), og for mannlige kjønn (p = 0,002), diffus-type kreft (p = 0,001), og trinn i pasienter (p = 0,048) (fig 3 og tabell 3). I de andre undergruppene studert, gjorde HPA2110 ikke tjene som en prognostisk markør
HPA2110 uttrykk forble signifikant i multivariat analyse (HR = 3,17;. 95% KI 1,37 til 7,34; p = 0,007; Tabell 4 ). Andre uavhengige prognostiske faktorer i multivariat analyse var scenen, klasse, og DNA ploiditet.
Diskusjoner
Vi viser her at kreftspesifikke 5-års overlevelse var signifikant bedre for mage kreftpasienter ha en PODXL-negativ svulst. Egentlig blant stadium 1 pasienter med PODXL-negative tumorer, kun én pasient døde av kreft. I multivariat analyse, positiv PODXL uttrykk fungert som en uavhengig markør for dårlig prognose. Positiv PODXL uttrykk både av polyklonale antistoff HPA2110 og monoklonalt antistoff HES9 var assosiert med høy solfaktor ved flowcytometri og Ki-67 flekker, begge er markører for høy spredning av kreftceller og dermed dårligere prognose.
Positiv ekspresjon av PODXL av begge antistoffer ble forbundet med intestinal cancer type, men en PODXL-negativ tumor viste seg ikke å være en prognostisk markør i tarmkreft. Omvendt, kreft-spesifikke 5-års overlevelse i gruppen av diffuse typen kreft var betydelig verre for pasienter med en PODXL-positiv tumor. Vanligvis har diffuse typen kreft er assosiert med dårligere prognose enn har tarmtype [21].
Så langt vi kjenner til, er vi de første til å rapportere en prognostisk verdi for PODXL i magekreft. Dette har vært tydelig for flere andre krefttyper, for eksempel bryst [6], prostata [8], eggstokk [9], kolorektal [10-12], urothelial blære [13], bukspyttkjertel [14], og periampullary kreft [15] . En studie på tykktarmskreft viser samsvar mellom primærsvulster og tilhørende lymfeknutemetastaser i den enkelte pasient, og PODXL uttrykk forblir også upåvirket av neoadjuvant strålebehandling. Disse funnene støtter den kliniske nytten av PODXL som en markør for dårlig prognose [22]. Her har vi ikke studere PODXL uttrykk i lymfeknutemetastaser i magekreft, og ingen av pasientene i denne kohorten fikk preoperativ kjemoterapi, selv om det er for øyeblikket ganske rutine. Disse effektene av preoperativ kjemoterapi på PODXL uttrykk i magekreft trenger ytterligere evaluering.
Vi brukte to antistoffer som gjenkjenner PODXL, en kommersielt tilgjengelig polyklonale antistoff HPA2110 og en in-house monoklonalt antistoff HES9 [16]. Immunoexpression av det monoklonale antistoff HES9 var sterkere enn ved det polyklonale antistoffet. Begge antistoffer farget jevnt gjennom hele cytoplasmaet, og heller ikke farget kjerner eller cellemembranen. Variasjonen i fargeintensitet og distribusjon var svakere ved bruk av polyklonale antistoff, noe som gjør scoring vanskeligere. I utgangspunktet PODXL er en trans molekyl, og derfor ble det overraskende å ikke finne det på cellemembraner i mage kreftcellene ved enten antistoff. Betydningen av cytoplasmatisk, ikke-membranseptum, ekspresjon av PODXL, dens rolle og funksjon, trenger ytterligere evaluering.
Disse forskjellige antistoffer vi brukte gjenkjenne ulike deler av PODXL molekylet, sannsynligvis forklarer hvorfor deres ekspresjon i noen av eksemplarer som skilte seg og resultatene var ikke identiske. Kaprio et al. [16], brukes de samme antistoffer i tykktarmskreft, og fant en interessant forskjell mellom fargemønstre. Det polyklonale antistoff ble positivitet membranøs [9,10], men, det monoklonale antistoff positivitet var tydelig hovedsakelig i cytoplasma. I tykktarmskreft, sterk positivitet med både monoklonale og polyklonale antistoff viste en undergruppe av pasienter med enda dårligere overlevelsen. Vi fant ikke denne type korrelasjon i mage kreftprøver. Overall, positivitet blant mage kreftpasienter var lavere enn i tykktarm kreftpasienter. I kolorektal kreft var omtrent 94% av tilfellene positiv for PODXL med disse to antistoffer, mens det i magekreft positivitet først i 76% tilfeller med det monoklonale antistoffet og i 58% med det polyklonale antistoff. Hyppigheten av PODXL positivitet i magekreft var nær som hos brystkreft og eggstokkreft (40% og 67%) [6,9].
PODXL er et trans glykoprotein. Det har vist seg at slimstoffer, som også er glykoproteiner, spille en rolle i epitelial til mesenchymale overgang (EMT) [23,24]. Rollen PODXL i kreft er ukjent, men det kan bli spekulert i at også PODXL kan ha en rolle i EMT. EMT kan forklare hvorfor pasienter med høyt PODXL uttrykk har dårligere overlevelse.
Styrken ved denne studien er en stor pasient kohort med magekreft og en lang oppfølging med pålitelig klinisk oppfølging tid og overlevelsesdata. Ved TMA teknikk, er det bare små områder av tumoren evaluert sammenlignet med hel-vevssnitt. I tykktarmskreft, Larsson et al. [22] funnet at bruken av hele seksjoner tillot identifikasjon av et større antall tumorer som PODXL-positive enn gjorde TMA analyse. Fordi PODXL uttrykk er heterogen, kan bruk av TMA teknikk føre til undervurdering av positive saker. Skårer for både monoklonalt-antistoff og polyklonale-antistoff uttrykk var for noen eksemplarer vanskelige; tilfeller med bare et par kreftceller og slike hvor verdien av kreftcellene var uidentifiserbare ble således utelukket fra analysen. Dette, delvis forklarer det høye antallet ekskludert tilfeller. På den annen side, gjør det mulig for TMA teknikk analyse av store pasientkullene med en homogen fargemetoden.
Som konklusjon, tjener PODXL immunofarging som en uavhengig markør for dårlig prognose i magekreft. Dette er, så vidt vi vet, den første rapporten om den prognostiske verdien av PODXL uttrykk i magekreft. Fremtidige studier bør bekrefte denne foreningen og løse mekanismer som PODXL påvirker utvikling og atferd av magekreft.
Takk
Vi takker Päivi Peltokangas og Elina Aspiala for deres utmerkede teknisk assistanse.
