Abstract
Å utvikle en helhetlig oversikt over kopi antall avvik (CNAS) i stadium II /III tykktarmskreft (CRC), karakterisert vi 302 svulster fra PETACC-3 klinisk studie. Mikro-stabile (MSS) prøver (n = 269) hadde 66 minimal vanlige CNA regioner, med hyppige gevinster på 20 q (72,5%), 7 (41,8%), 8 q (33,1%) og 13 q (51,0%) og tap på 18 (58,6%), 4 q (26%) og 21 q (21,6%). MSS svulster har betydelig flere CNAs enn mikro-ustabil (MSI) svulster: innen MSI svulster en roman sletting av tumor suppressor WWOX på 16 q23.1 ble identifisert (p 0,01). Focal avvik identifisert av GISTIC metode bekreftet presiseringer av onkogener inkludert EGFR, erbB2, CCND1, MET, og MYC, og sletting av tumor suppressors inkludert TP53, APC, og SMAD4, og genekspresjon var svært konkordant med kopi nummer avvik for disse genene. Nye amplikonene inkludert antatte onkogener som WNK1 og HNF4A, som også viste høyt samsvar mellom kopiantall og uttrykk. Overlevelsesanalyse knyttet en bestemt pasient segment kjennetegnet av kromosom 20 q gevinster til en bedre total overlevelse, noe som kan skyldes høyere uttrykk av gener som EEF1B2 og PTK6. CNA clustering også gruppert svulster preget av en dårlig prognose BRAF-mutant-lignende signaturen stammer fra mRNA data fra dette kullet. Vi avdekket ytterligere ikke-tilfeldig sammenheng mellom CNAs blant opphevet loci, inkludert positiv korrelasjon mellom 20 q gevinst og 8 q gevinst, og 20 q gevinst og kromosom 18 tap, i samsvar med co-utvalg av disse CNAs. Disse resultatene forsterke den ikke-tilfeldige natur av somatiske CNAs i trinn-II /III CRC og markere loci og gener som kan spille en viktig rolle i å drive utvikling og resultatet av denne sykdommen
relasjon:. Xie T, d «Ario G, Lamb JR, Martin E, Wang K, tejpar S, et al. (2012) En omfattende Karakterisering av Genome-Wide Kopier nummer Avvik i tykktarmskreft avslører Nye onkogener og mønstre av endringer. PLoS ONE syv (7): e42001. doi: 10,1371 /journal.pone.0042001
Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile
mottatt: 25. april 2012; Godkjent: 28 juni 2012; Publisert: 31.07.2012
Copyright: © Xie et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av et stipend fra den sveitsiske National Science Foundation (SNF 320030_135421) og Foundation Medic og et tilskudd av Krebsforschung Schweiz (KFS 02697-08-2010) til AR og MD. ST er en erfaren klinisk etterforsker av fondet for Scientific Research Flandern og har fått forskningsmidler fra den belgiske føderasjonen mot kreft og fra den belgiske Nasjonal kreftplan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. TX, JL, KW, MM, SW, PR og JGH er eller var ansatt av Pfizer Inc. Men dette betyr ikke endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Forfatterne har erklært at ingen andre konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) rangerer andre til lungekreft i både forekomst og dødelighet i utviklede land [1]. Det er preget av svært komplekse mønstre av somatiske genetiske endringer av onkogener og tumor dempere som driver initiering og progresjon [2], [3], [4]. Forstå cellulære og molekylære mekanismer som disse genetiske endringene letter tykktarmskreft formasjon er avgjørende for utvikling av målrettede terapeutiske strategier som tar sikte på å kontrollere sykdomsprogresjon mens minimere giftige bivirkninger.
En veletablert genetiske mekanismen som kreftceller endre aktiviteten til onkogener og tumorundertrykkere er gjennom endringer i genet dosering. Detaljert karakterisering av DNA-kopi antall aberrasjoner (CNAS) har bidratt til å identifisere viktige onkogener inkludert ErbB2 og EGFR, så vel som tumor-suppressorer som TP53 [5]. Tallrike studier har dokumentert på genomsomatiske CNAs i CRC [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15] , [16], [17], [18], hvorav noen har blitt forbundet med klinisk utfall eller metastatisk progresjon [19], [20], [21], [22], [23], [24]. Men mange av disse studiene har vært begrenset av beskjedne utvalgsstørrelsen, lav oppløsning analyser, eller mangel på tilknyttede kliniske merknader, særlig for tidlig stadium (II /III) tykktarmskreft. Følgelig en omfattende oversikt over CNAs og deres tilknytning til utfallet i stadium II /III tykktarmskreft har ikke blitt utviklet.
Vi undersøkte somatisk CNAs i en samling av 302 stadium II /III tykktarm kreft avledet fra Pan- europeiske studier i adjuvant koloncancer (PETACC) -3 trial, en stor randomisert fase III vurdering av den rollen irinotecan lagt til fluorouracil (FU) /leucovorin (FA) som adjuvant behandling for tykktarmskreft [25]. Resultatene som presenteres her, utforske forholdet mellom CNA, mRNA [26] og utfall, og bidra til en helhetlig molekylær oversikt over scenen-II /III tykktarmskreft, som er av vesentlig betydning for raffinering pasientklassifisering og effektiv behandling.
materialer og metoder
klinisk og mRNA data for PETACC-3 pasienter
Alle stadium II /III tykktarmskreftpasienter inkludert i denne studien ble avledet fra PETACC-3 klinisk studie [25], med minst 5 års klinisk oppfølging for hver enkelt pasient. Alder, kjønn, scene, MSI (mikro-ustabil) samt BRAF og KRAS mutasjonsstatus på pasientpopulasjonen er oppført i tabell S1. mRNA uttrykk data ble generert på ALMAC Colorectal Cancer DSA plattform (Craigavon, Nord-Irland), som rapportert tidligere [26]. Pasient og etikk godkjenning for denne studien ble innhentet fra PETACC-3 translasjonell forskning Working Party (PTRW).
Molecular Inversjon Probe datagenerering
DNA ekstraksjoner ble utført på macrodissected formalinfiksert, parafin -embedded (FFPE) tumorvev avledet fra en enkel 5 um lysbilde fra 835 pasientprøver. Svulstvev i hver seksjon ble identifisert og merket av en kvalifisert patolog (F. Bosman). For normale kontroller, ble DNA ekstrahert fra prøver med tilstrekkelige mengder av histopathologically normal tilstøtende vev godt unna tumoravgrensninger. DNA ble kvantifisert ved hjelp av picogreen analysen. For prøver som ga mindre enn den anbefalte innspill DNA mengde (75 ng), ble tatt DNA fremføring inn i Molecular Inversjon probe (MIP) forsterker, merking og hybridisering protokoller ved hjelp av Affymetrix er OncoScan V1.0 FFPE Express tjenester (Affymetrix, CA) . Prøver som ikke klarte PCR forsterkning eller vises en Median Gjennomsnittlig Parvise Difference (MAPD) 0,6 etter hybridisering ble fjernet fra den endelige analysen, noe som resulterer i 302 tumorprøver sammen med 44 tilstøtende normale prøver som normal baseline komparator. Vanligvis prøver under 20 ng av innspill DNA mislyktes MIP forsterkning cutoff og ble ikke båret frem til å rekke hybridisering. Prøver med minst 75 ng av innspill DNA universelt gitt høy kvalitet kopi talldata (MAPD 0,6). Resultater varierte for innspill DNA mengder 20-75 ng, hvor MAPD . 0,6 filter servert å eliminere overdrevet støyende prøvene
Kopier nummer Data Analysis
Kopier nummer data ble analysert med Nexus Copy antall 6.0-programvare (Biodiscovery, Inc., CA, USA). De rå kopitalldata for hver sonde levert av Affymetrix ble glattet av en kvadratisk korreksjon levert av NEXUS og sentrert ved hjelp av diploide regioner. CNA frekvens sammenligninger blant utvalgsgrupper (f.eks MSS versus MSI, scene-II versus scene-III) ble utført ved hjelp NEXUS standard terskler av 15% forskjell og betydning p 0,01 (Fishers eksakte test). For å generere kopitall segmenter og minimal felles områder (MCRene), søkte vi en modifisert versjon av rundskriv Binary Segmentering (CBS) algoritme [27] heter «Rank segmentering» i NEXUS. P-verdien cutoff for CBS var 1.0e-6, og segmenter ble tildelt en av 5 Skaper: forsterket ( 3,8 eksemplarer), fikk (2,3 til 3,8 kopier), uendret (1,7 til 2,3 eksemplarer), slettet (0,5 til 1,7 kopier) eller homozygously slettet ( 0,5 eksemplarer). For MCR frekvens betydning testing, brukte vi en p-verdi cutoff av 0,01 fra statistisk signifikans Testing for Aberrant Kopier nummer (STAC) metoden [28]. Hierarkisk clustering av CNA ble utført i NEXUS også (komplett kobling, kjønnskromosomer ignorert). For å oppdage fokale presiseringer, søkte vi GISTIC (Genomisk Identifisering av vesentlige mål i Cancer) versjon 2.0 [29] med en Q-verdi cutoff 0,25. Gener rapportert i GISTIC2 forsterkertopper ble videre undersøkt om de er beriket i eventuelle biologiske veier. Vi brukte kanoniske vei database levert av MSigDB [30]. Pathway gensettene med mindre enn 10 medlemmer eller mer enn 500 medlemmer ble ekskludert. Fishers eksakte test ble brukt for å få tilgang om disse genene er overrepresentert. FDR ble beregnet basert på 100 permutasjoner hvor tilfeldige sett av gener som er av samme størrelse ble testet. Vi har også brukt Fishers eksakte test for å se om frekvenser av visse CNAs variere mellom pasientgrupper (stadium II vs III, MSI vs. MSS etc). Survival analyse ble utført ved hjelp av Kaplan-Meier metoden med en p-verdi (log-rank test) cutoff av 0,01. For analyse av CNA /CNA korrelasjoner ble Pearson korrelasjon beregnet på gennivå for alle par av gener som tidligere beskrevet [31]. For å utlede sammendrag gennivå fra kopien antall data, tildelt vi kopitallverdier fra segmentet (e) overlapp hvert gen: når det var flere segmenter innenfor genet grense, vi i gjennomsnitt kopi tall fra disse segmentene. Alle genombasert data rapportert i dette manuskriptet er basert på NCBI bygge 36 (hg18) av det menneskelige genom.
Expression Data Analysis
genuttrykk data fra de PETACC-3 pasienter ble rapportert tidligere [26]. Vi passet det med genet nivå kopi talldata ved Entrez ID. Kopier nummer og genuttrykk data var samtidig tilgjengelig for 213 av de 269 MSS pasienter med tilgjengelige CNA data. For å teste cis-korrelasjon mellom et gens kopiantall og sitt eget mRNA-ekspresjon nivå over tumorer, kategorisert vi pasienter i henhold til deres avvik status (amplifikasjon, forsterkning, ingen endring, tap eller homozygot delesjon) som er knyttet til uttrykket verdiene av sonden setter kartlegging til det samme genet
Resultater
Kopier nummer Avvik og mikro Ustabilitet
33 av de 302 prøvene i vår analyse var mikro ustabil (MSI). konsistent med tidligere studier [ ,,,0],19], [32], gjennomsnittlig antall CNAs i MSI svulster (10,2 ± 6,5) var signifikant mindre (p 0,01, to utvalgs t-test) enn gjennomsnittlig antall CNAs i mikro stabil (MSS) svulster (33,2 ± 17.6). Likevel ble to fokusområdene slettet betydelig oftere i MSI prøver: chr16q23.1 (chr16:77,231,391-77,261,567 bp) i 24,2% av MSI prøver vs. 7,1% av MSS prøver (p 0,01), og chr20q11.1 (chr20 :28,118,678-28,244,164) i 24,4% av MSI prøver vs. 8,9% i MSS prøver (p 0,01). Interessant, den eneste gen som finnes i 16 q23.1 locus er WWOX tumor suppressor, en hemmer av Wnt /beta-catenin vei [33], som ofte aktiveres i tykktarmskreft.
Tilbakevendende CNAs, nye onkogener og Berørt Pathways
Gitt den relativt lave CNA utbredelse i MSI svulster, fokuserte vi våre analyser på de 269 MSS svulster. Som det har blitt rapportert tidligere [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], i frekvenser av kopitall gevinster og tap over genomet ble ikke tilfeldig fordelt (figur 1A), med CNAs spenner fra løssalgs gevinster og tap på bred kromosomale regioner, til Focal homozygote slettinger og høyt nivå presiseringer (figur 2). De vanligste områdene av gevinst omfattet kromosomale regioner 7 p, 8 q, 13 q, og 20 q, og de hyppigste områdene av tap omfattet 8 p, 17 p og 18 q (figur 1A).
(A) Frekvenser av kopiantallet gevinst (over aksen, blå) og kopiantall tap (under aksen, rød) over det menneskelige genom. (B) Betydningen av brenn presiseringer oppdages av GISTIC 2.0. Kromosom stillinger ble angitt langs y-aksen med cent posisjoner indikert med stiplede linjer. De ti mest betydningsfulle GISTIC topper vises i rød tekst. Andre GISTIC topper koder etablerte onkogener er i svart tekst. Detaljer for alle GISTIC topper er gitt i tabell S3.
(A-H) kopiantall tomter for hele genomet arrangert i kromosom ordre fra den korte arm av kromosom 1 (1pter) til den lange arm av kromosom X (Xqter) for 8 uavhengige tumorprøver. Amplikonene av særlig interesse er markert med piler, sammen med etablerte onkogener. Detaljer om alle amplikonene og GISTIC toppene er i tabell S3.
For å få ytterligere innsikt, oppsummerte vi tilbakevendende kromosom gevinster og tap i Minimal Vanlige Regions (MCRS) ved hjelp Betydelig Testing av Aberrant Kopier nummer (STAC) [28], og GISTIC [29] for å markere kandidat onkogener i MCRene basert på focality og amplitude av kopiantall endring. Totalt 66 MCRene ble identifisert ved frekvenser over 10% (tabell S2): Det var 25 MCRene av gevinsten som strekker seg fra 251 Kb til 104 Mb og 41 MCRene av tap som strekker seg fra 286 kb til 138 Mb. GISTIC bidratt til å avgrense MCRene til loci og gener som er av særlig betydning (tabell S3). Mange av de store toppene identifisert av GISTIC betjente etablert onkogener inkludert CCND1, CDX2, EGFR, erbB2, MET, og MYC (figur 1B), sammen med tumor suppressors som APC, SMAD4, og TP53. Flere av onkogene toppene ble drevet av høy-amplitude fokal hendelser i en undergruppe av tumorer (figur 2), og disse knutepunktene amplifikasjonene resulterte i signifikant økning i mRNA-ekspresjon for flere av disse genene. Sterkt signifikante GISTIC topper som ikke er forbundet med veletablerte onkogener eller tumor-suppressorer inkluderer 12 p13.33 (figur 2E, F) og 20 q13.12 (figur 2G, H), som hadde tilbakevendende høy størrelses fokal amplifikasjoner, samt 14 q32.31 som, selv om ikke svært forsterket, hadde gevinster av tilstrekkelig tilbakefall og focality som å gjengi en meget signifikant GISTIC Q-verdi (figur 1B, tabell S3). Med GISTIC fragment data, oppsummerer vi 114 kandidat kreft drivere i tabell S4, som inkluderer tolv (10%) etablerte onkogener som MYC, KRAS, og MET. Antatte onkogener inkludert WNK1 (figur 3A) og HNF4A (figur 3B) har Q-stillingen, forsterket frekvens, og cis-virkende virkninger på mRNA som er sammenlignbare med etablerte onkogener (figur S1). Vår analyse har falt mer enn 6000 gener fra MCR regioner i genomet til et håndterlig antall på ca 100 for ytterligere eksperimentell validering.
tumorprøver ble kategorisert etter sin CNA status (sletting, tap, normal, gain, forsterkning ) for det angitte gen. Panelene viser uttrykket nivå etter kategori for hver probeset fra ALMAC plattformen (se Materialer og metoder) som representerer det spesifikke genet. Verdiene ble sentrert for hver probeset; kategoriene er plottet hvis det var minst en prøve i det.
For ytterligere å søke etter mønstre av berørte pathway forandringer, vi kartlagt listen over gener forsterket i CRC (tabell S4) på kanoniske molekylære signalveier og cellulære prosesser. Tabell 1 viser topp kanoniske trasé muligens påvirket av de forsterkede gener. Cellesyklus er en av de mest beriket trasé berørt av somatiske CNA involverer gener som CCND1, MYC, TFDP1 og YWHAZ. KEGG «Pathways i kreft» ligger til grunn for det brede spekteret effekt av somatisk CNAs i sikte på flere viktige veier i kreft samtidig. Mer spesifikt, vi også identifisert enkelte kreftrelaterte trasé som er betydelig overrepresentert blant cis-virkende gener drevet av somatiske CNAs, inkludert erbB signalveien og MAPK kinase signalveien. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at disse somatiske CNAs kode romanen onkogene driver gener og potensielle terapeutiske mål i tykktarmskreft.
CNA Clustering og ikke-tilfeldige CNA Korrelasjoner i CRC
Vi utførte unsupervised hierarkisk clustering av den globale CNA data og identifiserte tre store klynger. Selv om vi ikke finner signifikante assosiasjoner til alder, kjønn, scene eller KRAS mutasjonsstatus, observerte vi at BRAF villtype tumor ble betydelig anriket i den største klyngen og BRAF mutanter i en av de mindre klynger (p 0,01). Tidligere har vi [26] utviklet en BRAF-mutant genekspresjon signatur fra PETACC-tre kohort og studerte sine prognostiske implikasjoner. Blant 213 MSS pasienter med mRNA uttrykk data tilgjengelig, identifisert signaturen 37 «BRAFm-lignende» prøver (inkludert 8 BRAF mutanter) samt 176 «ikke-BRAFm-lignende» samples. Vi re-løp clustering analyse på de 213 prøver (Figur 4A), og funnet svært betydelig berikelse av «ikke-BRAFm-lignende» samples (p 0,01) i den største klynge (cluster 2) og «BRAFm-lignende» prøver i cluster 1 (P 0,01, tabell 2). Sammenlignet med cluster 2, cluster 1 viser mye lavere frekvens av forsterkning /sletting hendelser, spesielt på chr13 q, 14 q, 18 q og 20 q (figur 4B). En nærmere titt avslører at klyngen en er fullstendig utladet fra CNAs på chr20 mens 95% av klase 2 prøvene hadde chr20 forsterket. Disse resultatene underbygge med observasjonen av relativt lavere ekspresjon av gener i chr20 BRAFm-lignende med hensyn til resten av de BRAFwt prøvene [26].
(A) Tre hovedklyngene. Den høyre merknad indikerer, i rekkefølge, BRAFm (i gul, BRAF mutanter, i blått, BRAF vill-typer), KRASm (mutanter i grønt), og BRAFm-lignende (i grønt, BRAFm-aktig, i rødt, ikke-BRAFm-aktig). Lilla farge indikerer manglende verdier. (B) Genome-wide frekvens tomt på kopiantall gevinst (over akse, blå) og kopi nummer tap (under aksen, rød) over tre store klynger.
Vi har tidligere rapportert at i cellelinjer CNAS ved ukoblet loci var ofte korrelert med hverandre, og at slike korrelasjoner var sannsynligvis et resultat av valget [31]. For å vurdere om et lignende fenomen var tydelig i klinisk stadium II /III MSS tykktarmskreft, gjennomførte vi parvise korrelasjoner av kopi nummer for alle gener (~22 k) over hele genomet. Som forventet ble tilstøtende (knyttet) gener sterkt korrelert (figur 5A, i nærheten av diagonalt). På et høyere nivå noen kromosomarmer ble opphevet (f.eks chr1p vs. en q, 10p vs. 10 q) eller anti-korrelert (f.eks chr8 p vs 8 q). I tillegg var det en rekke sammenhenger mellom koblede loci (figur 5A, off-diagonal), noe som tyder på co-utvelgelse av disse genomiske regioner. For eksempel ble kromosom 8 p tap korrelert til tap av kromosomer 17 p og 18, sammen med gevinst på kromosom 20 q. Kromosom 13 gevinster ble korrelert til kromosom 14 tap. Fordelingen av gene-genet foreninger var vesentlig annerledes enn en randomisering av CNV data (figur 5B). I likhet med det som ble funnet i andre kreft innstillinger [31], [34] der var en skala-fri struktur hvor et par gener var sterkt korrelert til mange andre gener, mens de fleste genene korrelert til bare noen få gener. Dette tyder på at et lite antall DNA loci fungere som nav i en svært tilfeldig hierarkisk struktur.
(A) Pair-klok korrelasjoner beregnet fra genkopitallet er bestilt av kromosomposisjoner gjennom genomet på X og Y akser, med rød indikerer en positiv korrelasjon og blått indikerer en negativ korrelasjon. Den røde diagonal representerer korrelasjonen av et gen med seg selv. De nedre høyre og øvre venstre deler av grafen representerer speilbilder av hverandre som viser eksemplar nummer korrelasjoner av koblede loci. (B) Log /logg tomter for betydelig gen /gener sammenhenger (| R | ≥0.3)
Forholdet mellom CNA til scenen og utfallet
For å identifisere individuelle CNAs som forbinder med. tumor stadium, sammenlignet vi CNA frekvenser mellom stadium II (n = 30) og stadium III MSS prøver (n = 239). Mens begge gruppene hadde lignende mønstre av CNA, en sletting på kromosom 3p14.2 hadde signifikant (p 0,01) høyere frekvens i fase III svulster (24,3%) i forhold til scenen II svulster (3,3%). Dette locus koder FHIT, en kandidat tumor suppressor og apoptotisk regulator i tykk- og endetarmskreft [35], og jo høyere frekvens av sletting i fase III svulster tyder på at tap av FHIT funksjon kan bidra til utviklingen av tykktarmskreft fra et lavere til høyere stadium sykdommen .
stort sett med stadium II /III MSS tykktarmskreft prøver med tilhørende tid til tilbakefall, tilbakefall-free-overlevelse (RFS) og total overlevelse (OS) ga en unik mulighet til å identifisere CNAs forbundet med utfall. Ved hjelp av Kaplan-Meier-analysen, vi først undersøkt om ch20q forsterkning åpenbart av prøven clustering tidligere beskrevet fører til statistisk signifikante forskjeller i overlevelse sannsynlighet. En fått MCR på kromosom 20 q11.21-q13.33 (chr20:29,297,270-62,435,964 bp) ble signifikant assosiert med forbedret OS i fase III svulster (p 0,01). GISTIC identifisert ett fragment i denne MCR på 20q13.33 (chr20:61,440,621-61,778,204 bp) som også ble signifikant assosiert med forbedret OS. Denne regionen på ca 300 kb inneholder ett interessante gener som EEF1A2 og PTK6. Anand et al. rapportert [36] EEF1A2 over-uttrykk i ca 30% av ovarietumorer og noen etablerte eggstokkreft celler. Imidlertid ble høy EEF1A2 proteinekspresjon assosiert med signifikant økt 20-års overlevelse sannsynlighet hos kvinner med serøse ovarietumorer [37], eller i primære brystsvulster, og denne beskyttende effekten er antatt å være på grunn av EEF1A2 er høy ekspresjon i å redusere aggressivitet [ ,,,0],38]. PTK6 ble også rapportert [39] som positivt forbundet til metastaser overlevelse ved brystkreft; og viser sterk cis CN /mRNA korrelasjon i vår analyse (tabell S4). Her CNA data tyder på at forsterkning av 20 q13.33 locus kan være en betydelig prognostisk markør for CRC kreft.
I tillegg chr20q forsterkning, søkte vi Kaplan-Meier analyse for å vurdere forholdet til alle andre MCRene og GISTIC topper med RFS og OS. Det var ingen signifikant sammenheng mellom MCRene eller GISTIC topper versus OS eller RFS for scene II svulster, muligens reflekterer begrenset antall prøver i denne gruppen (n = 30). Imidlertid, en delesjon på kromosom 10 p (Chr10:0-10,743,764 bp) var signifikant assosiert med dårlig RFS i stadium III tumorer alene (p 0,01) eller stadium II /III tumorer kombinert (p 0,01), så vel som dårlig OS i fase II /III svulster kombinert (p 0,01). Tilsvarende vil en slettet MCR på 19 p13.12 (chr19:14,425,490-15,580,441 bp) ble signifikant assosiert med OS (p 0,01) i stadium II /III svulster kombinert (figur S2)
Diskusjon
.
hoved~~POS=TRUNC målene~~POS=HEADCOMP med denne studien var å utvikle en helhetlig oversikt over kopi antall avvik (CNAS) og tilhørende genene i stadium II /III tykktarmskreft, for å klargjøre den underliggende biologi, og å knytte CNAs med utfallet. Regioner av tilbakevendende og brenn CNA identifisert i disse svulstene markere genomiske regioner mest sannsynlig til å kode onkogener og tumor dempere. Etablert onkogener som er identifisert i denne studien som representerer positive kontroller omfatter MYC, CDX2, EGFR, MET, ErbB2, og CCND1.
De mest fremtredende nye amplikonene identifisert i denne studien omfatter 12 p13.33 og flere loci på 20 q (20 q11.21, 20 q13.12, 20 q13.31). Den 12 p13.33 amplicon koder spennende kandidat WNK1, et medlem av WNK familie av serin /treonin kinaser som påvirker MAPK signal og en rekke kreft kjennetegnene inkludert cellecyklusprogresjonen, unndragelse av apoptose, invasjon og metastasering, og metabolsk tilpasning [ ,,,0],40]. Den komplekst mønster av gevinster og forsterkning på kromosom 20 q foreslå flere onkogene drivere på dette kromosomet arm, i samsvar med observasjoner i brystsvulster [41] og andre krefttyper. Den 20 q13.12 fragment, som ble observert i flere svulster (figur 2G, 2H) og er den mest betydningsfulle GISTIC toppen på 20 q, koder 11 gener, og ingen av disse har vært utvetydig beskrevet som onkogene sjåfører i tykktarmskreft. Likevel, de rapporterte funksjonene til noen av disse genene tyder på at videre undersøkelser er berettiget. For eksempel regulerer transkripsjonsfaktor HNF4A epitelcelle polaritet og fremmer tarm neoplasi i mus [42]. WISP2 (WNT1 induserbar signalveien protein 2 /CCN5) regulerer aktiviteten av transformerende vekstfaktor â (TGFa) signalveien og ekspresjon av gener assosiert med epithelial-til-mesenchymale overgang [43]. Toppen på 20 q13.31 koder BMP7, et medlem av TGFa super av proteiner som overekspresjon i tykktarmskreft betydelig korrelerer med markører for patologisk aggressivitet som levermetastaser og er en uavhengig prognostisk faktor for total overlevelse [44]. Funksjonell karakterisering av disse og andre kandidat onkogener i tykktarmskreftcellekultur, pasient-avledet xenografter, eller genetisk modifiserte musemodeller vil bidra til å klargjøre eventuelle funksjonelle konsekvenser. Pathway analyse presentert tidligere gir ikke bare en bedre forståelse av mulige biologiske sammenheng med kandidat drivere CNA, men også bidra til å antyde andre gener på den endrede vei for hvilke terapeutiske alternativer kan være tilgjengelige. På den annen side viser overlevelsesanalyse forbedret total overlevelse for prøven segment med chr20 q13.33 forsterkning. Denne foreningen i kontrast til funn av en annen gruppe som rapporterte forsterkning på 20 q13 indikerer dårligere total overlevelse i sporadiske kolorektal kreft [45]. Den nøyaktige grunnlag for dette avviket med våre funn til er ikke klart, men analysene av Aust et al. var på en betydelig mindre kohort (120 prøver).
Våre analyser av sammenhenger mellom CNA og utfallet i dette settet med stadium II /III tykktarm kreft avdekket tre loci som var signifikant assosiert med total overlevelse (OS) eller tilbakefall overlevelse (RFS). Sletting av distale tuppen av kromosom 10 p (10 p15.3-P14) var assosiert med dårlig OS og RFS, mens en interstitiell sletting av kromosom 19 p (19 p13.12) var assosiert med dårlig OS, og gevinst på 20 q var forbundet med betydelig bedre OS i stadium III svulster. Mens 10 p strykninger, 19 p delesjoner, og 20 q gevinst tidligere er blitt rapportert i fase II /III coloncancere [16], ingen av disse loci har tidligere blitt knyttet til utfall i disse tumorene. Omvendt vi ikke observere signifikante assosiasjoner av utfallet til tidligere rapportert CNAs eksempel sletting av 16 p13.2 i fase II /III tykktarmskreft [46], eller sletting av fem Q34 og gevinst på 13 q22.1 i fase II svulster [ ,,,0],17]. En mulig forklaring på disse åpenbare avvik kan være knyttet til den begrensede makt de respektive studiene. For stadium III MSS svulster, våre resultater representerer analyser av markert høyere prøvenumrene (n = 239) sammenlignet med publiserte arbeider (for eksempel 31 trinn III svulster i [46]). For stadium II MSS svulster, er vår prøvesett underpowered, som representerer 30 prøver sammenlignet med 41 [46] og 39 [17] svulster i tidligere studier. Disse resultatene understreker behovet for omfattende analyser av store samlinger av klinisk kommenterte tumorprøver som stadium III MSS svulst sett beskrevet i dette arbeidet.
Vi har også rapportert her en betydelig ikke-tilfeldig korrelasjon opphevet DNA loci med en skala-fri struktur i stadium II /III tykktarmskreft. Disse svært koblet strukturer foreslå en syklus av tilfeldige endringer i kopiantall etterfulgt av valg av en undergruppe av endringer der det gis en selektiv fordel å tumor initiering og progresjon. Selv om dette er en lang stående idé i kreft, sammenheng mellom koblede loci tyder på at svært bestilt strukturer kan dukke opp, potensielt fokusert rundt biologiske funksjoner av betydning for svulsten. Fremtidige analyser kunne vurdere effekten av ukoblet kopitall korrelasjoner på genekspresjon, inkludert anrikning av trasé og nettverk, og avgjøre om mRNA styres av et par korrelert loci overlapping, hvor en uavhengig virkning av hver loci var observerbar. Dette ville identifisere trasé som ble selektivt endret under tumorigenesis og som derfor kan representere nye målrettbare funksjoner.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
boksplott for EGFR, ErbB2 og MYC er mRNA uttrykk gruppert etter CNA status.
doi: 10,1371 /journal.pone.0042001.s001 plakater (PPT)
Figur S2.
Kaplan-Meier-kurver viser CNAs viser signifikant sammenheng med total overlevelse.
doi: 10,1371 /journal.pone.0042001.s002 plakater (PPT)
Tabell S1.
Kjennetegn på pasienter inkludert i studien.
doi: 10,1371 /journal.pone.0042001.s003 plakater (XLS)
Tabell S2.
Minimal felles områder identifisert i 269 MSS stadium II /III tykktarmskreft prøver.
doi: 10,1371 /journal.pone.0042001.s004 plakater (XLS)
tabell S3.
GISTIC topper identifisert i 269 MSS stadium II /III tykktarmskreft prøver.
doi: 10,1371 /journal.pone.0042001.s005 plakater (XLS)
Tabell S4.
Berørte gener i utvalgte GISTIC amplikonene.
doi: 10,1371 /journal.pone.0042001.s006 plakater (XLS)
