Abstract
Bakgrunn
Resveratrol (3, 4 «, 5 tri-hydroxystilbene), en naturlig forekommende polyphenol, viser anti-inflammatorisk, antioksidant, kardio og antitumor aktiviteter. Vi har nylig vist at resveratrol kan forbedre apoptose-induserende potensialet i TRAIL i prostatakreftceller gjennom flere mekanismer
in vitro
. Derfor denne studien var designet for å validere om resveratrol kan forbedre apoptose-induserende potensialet i TRAIL i en xenograft modell av prostatakreft.
metodikk /hovedfunnene
Resveratrol og TRAIL alene hemmet vekst av PC-3-xenotransplantater i nakne mus ved hemning av tumorcelleformering (PCNA og Ki67-farging) og indusere apoptose (TUNEL-farging). Kombinasjonen av resveratrol og TRAIL var mer effektive i å hemme tumorvekst enn monoterapi alene. I xenopodet svulster, resveratrol oppregulert uttrykk for TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5, Bax og p27
/K IP1, og hemmet uttrykket av Bcl-2 og cyclin D1. Behandling av mus med resveratrol og TRAIL alene inhiberte angiogenese (som vist ved redusert antall blodårer, og VEGF og VEGFR2-positive celler) og markører for metastasering (MMP-2 og MMP-9). Kombinasjonen av resveratrol med TRAIL ytterligere hemmet antall blodkar i tumorer, og som sirkulerer endotelial vekstfaktor reseptor 2-positive endotelialceller enn monoterapi alene. Videre resveratrol hemmet cytoplasma fosforylering av FKHRL1 resulterer i den forbedrede aktivering som demonstrert av økt DNA-bindende aktivitet.
Konklusjon /Betydning
Disse dataene tyder på at resveratrol kan forbedre apoptose-induserende potensialet TRAIL ved å aktivere FKHRL1 og dets mål gener. Evnen til resveratrol for å hemme tumorvekst, metastase og angiogenese, og forsterke den terapeutiske potensialet av TRAIL antyder at resveratrol alene eller i kombinasjon med TRAIL kan brukes for behandling av prostata cancer
relasjon:. Ganapathy S, Chen Q, Singh KP, Shankar S, Srivastava RK (2010) Resveratrol Forbedrer Antitumor aktivitet av TRAIL i Prostate Cancer xenografter gjennom Aktivering av FOXO transkripsjonsfaktor. PLoS ONE 5 (12): e15627. doi: 10,1371 /journal.pone.0015627
Redaktør: Hiranmoy Das, The Ohio State University Medical Center, USA
mottatt: 19 september 2010; Godkjent: 17 november 2010; Publisert: 28.12.2010
Copyright: © 2010 Ganapathy et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Resveratrol (3, 4 «, 5 tri- hydroxystilbene), en naturlig forekommende polyfenol, oppviser pleiotropiske helsemessige fordeler, inkludert anti-inflammatorisk, antioksidant, kardiobeskyttende og antitumor-aktivitet [1], [2], [3], [4]. For tiden er mange prekliniske funn tyder resveratrol som et lovende middel for kreft forebygging og /eller behandling. Som et potensielt anti-cancermiddel, og resveratrol blitt vist å hemme eller retardere vekst av forskjellige kreftceller
in vitro
og implanterte tumorer in vivo [5], [6], [7], [8] , [9]. Resveratrol er blitt vist å inhibere aktiveringen av JAK2-STAT3, Src-STAT3, AKT og IKK-NFkB veier og for å indusere apoptose i flere kreftcellelinjer [10], [11], [12], [13]. Vi har nylig vist at resveratrol downregulated uttrykket av BCL-2, Bcl-X
L og Survivin og oppregulert uttrykk for Bax, Bak, PUMA, Noxa, og Bim og død reseptorer (TRAIL-R1 /DR4 og Trail- R2 /DR5) [1], [14], [15]. Videre behandling av prostatacancerceller med resveratrol resulterte i dannelse av reaktive oksygenarter (ROS), translokasjon av Bax til mitokondrier og påfølgende nedgang i mitokondriemembranpotensialet, frigjøring av mitokondrielle proteiner (cytokrom c, Smac /DIABLO, og AIF) til cytosol , aktivering av effektor kaspase-3 og kaspase-9, og induksjon av apoptose [1], [14], [15]. Resveratrol-indusert ROS produksjon, ble caspase-3 aktivitet og apoptose hemmet av N-acetylcystein, noe som tyder ROS-produksjon, i det minste delvis, spiller en rolle ved formidling av anticancer aktivitet av resveratrol [1], [14], [15]. Resveratrol forbedret apoptose-induserende potensialet i TRAIL i PC-3 celler og lysfølsomt TRAIL resistent prostatakreft LNCaP celler
in vitro product: [1], [14], [15]. Samlet disse data tyder på at resveratrol kan regulere flere signalveier og besitter flere terapeutiske fordeler.
PI3K signalering spiller en sentral rolle i intracellulære signaltransduksjonsveier som er involvert i cellulær transformasjon, cellevekst, og tumorigenesis [16], [ ,,,0],17]. Inaktivering av AKT resultater i defosforylering og aktivering av FOXO transkripsjonsfaktorer, rapporteres å megle cellesyklus arrest, DNA-reparasjon, og apoptose [18], [19]. Disse transkripsjonsfaktorer, hører til «O» undergruppe av bevinget-helix /gaffelhodetranskripsjonsfaktor-familie, består i hovedsak av fire medlemmer FOXO1, FOXO3a, FOXO4, og FOXO6 [20]. FOXO proteiner er evolusjonært konservert transkripsjonsfaktorer involvert i flere grunnleggende cellulære prosesser, som virker som endepunktet for transkripsjonelle programmer som er involvert i apoptose, stressrespons og lang levetid [21], [22]. Siden oppheving av FOXO funksjonen er ofte observert i menneskelige kreft, vil reaktivering av FOXO proteiner være en attraktiv strategi for kreftterapi og forebygging. De FOXO proteinene integrere innganger regulatoriske fra en rekke oppstrøms signalveier, viktigst som respons på vekstfaktor og stress signalering [23]. Nylig har FOXO faktorer er etablert som tumor suppressors, fremme transkripsjon av pro-apoptotiske molekyler som Fasl og Bim når PI3K /AKT veien er nedregulert grunn av næringsstoff eller serum sult og cellulært stress [24], [25]. Triple knockout musemodeller viste tumorsupressorproteinene egenskaper FOXOs, som mus samtidig mangler de viktigste medlemmene av pattedyr FOXO underfamilien, FOXO1, FOXO3a og FOXO4, er utsatt for å utvikle hemangiomer og lymfoproliferative sykdommer [26]. Omvendt, den enkelte eller sammen inaktivering av FOXO1, FOXO3a eller FOXO4 resulterte i en mindre alvorlig fenotype, som støtter ideen om funksjonell redundans av disse FOXO faktorer [26]. Videre har tvunget ekspresjon av FOXO blitt vist å hemme tumorgenese i xenograft-modeller i nakne mus [27], [28]. Derfor er reaktivering av FOXO basert på dens tumorsupressorproteinene egenskaper ansett som en meget attraktiv anti-kreft-strategi. Siden FOXO proteiner ble rapportert å være kritiske mediatorer av apoptose indusert av kreft narkotika, postulerte vi at FOXO uttrykk eller transkripsjonen aktivitet kan være viktig begivenhet i formidling effektene av resveratrol.
TNF-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL ) har vist seg å TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 [29]. Vi og andre har vist at TRAIL kan indusere apoptose i forskjellige cancercelletyper [29], [30], [31], [32], [33]. Basert på prekliniske data, synes det som TRAIL har store løftet som et selektivt anticancermiddel [31], [32]. Resveratrol har vist seg å forbedre den terapeutiske potensialet av TRAIL
in vitro product: [14], [34]. De interaksjoner av resveratrol og TRAIL ble blokkert av dominant negativ FADD eller caspase-8 siRNA [14], [15]. Kombinasjonen av resveratrol og TRAIL forbedret mitokondrie dysfunksjoner under apoptose. Resveratrol behandling kan aktivere ytre TRAIL-reseptor-mediert død vei, og dermed øke følsomheten til TRAIL i prostatakreftceller. Men de molekylære mekanismer som resveratrol kan forbedre den terapeutiske potensialet i TRAIL
in vivo
har ikke blitt undersøkt.
Formålet med vår studie var å undersøke de molekylære mekanismer som resveratrol forbedrer terapeutiske potensialet i TRAIL i prostatakreft xenotransplantater i nakne mus. Våre resultater indikerer at resveratrol hemmet PC-tre xenograft vekst og markører for metastasering, og angiogenese gjennom aktivering av FOXO transkripsjonsfaktorer. Dermed våre data tyder på at resveratrol kan brukes alene eller i kombinasjon med TRAIL for forvaltningen av prostatakreft.
Resultater
Resveratrol øker antitumor tumor aktivitet av TRAIL i PC-3 xenografter
in vivo
Vi har nylig vist at resveratrol kan forsterke apoptose induserende potensialet i TRAIL
in vitro
. Derfor, i denne studien undersøkte vi om resveratrol kan forsterke antitumor aktivitet av TRAIL
in vivo
. PC-3-celler ble xenopodet i Balb c nakne mus. Etter svulstdannelse, ble disse musene behandlet med resveratrol, TRAIL, eller resveratrol pluss TRAIL i 6 uker og effekten av disse midlene på tumorvekst ble undersøkt. Resveratrol og TRAIL alene hemmet vekst av PC-3 xenografter (Fig. 1). Til sammenligning, er kombinasjonen av resveratrol og TRAIL var mer effektiv til å inhibere tumorvekst enn enkelt middel alene.
(A), PC-3-celler ble injisert inn i de rette flanker Balb c nakne mus. Etter tumordannelse (ca. 100 mm
3), ble mus behandlet med saltvann, resveratrol (30 mg /kg, tre dager per uke), TRAIL (15 mg /kg, fire ganger i løpet av tre første ukene) eller resveratrol pluss TRAIL . Tumor volum ble målt ukentlig. Data representerer gjennomsnitt ± SE. *, # Og $ er signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05)
Disse dataene tyder på at resveratrol kan forsterke antitumor aktivitet av TRAIL i prostatakreft
Regulering av svulst. celleproliferasjon og apoptose ved resveratrol og /eller TRAIL i PC-3-xenografter
tumorcelle-proliferasjon og apoptose kan regulere størrelsen av tumoren til enhver tid. Derfor, utførte vi immunhistokjemi i tumorvev for å måle ekspresjonen av Ki67 og PCNA, og TUNEL assay for å måle apoptose (Fig. 2A). Tumorcelle-proliferasjon ble målt ved å telle Ki67 og PCNA-positive celler, og apoptose ble målt ved å telle TUNEL-positive celler (Fig. 2B-D). Behandling av mus med resveratrol og TRAIL alene resulterte i inhibering av tumorcellevekst og induksjon i apoptose. Kombinasjonen av resveratrol og TRAIL var mer effektive i å hemme tumorcelle spredning og indusere apoptose enn monoterapi alene. Disse dataene tyder på at resveratrol, men effektive alene, kan forbedre antitumoraktivitet av TRAIL i prostata kreft.
(A), Immunhistokjemi ble utført i tumorvev avledet fra kontroll, resveratrol og /eller TRAIL-behandlede mus på uke 6 for å måle celleproliferasjon ved Ki67 og PCNA farging og apoptose ved TUNEL analysen. (B, C og D), Kvantifisering av Ki67, PCNA og TUNEL-positive tumorceller. Tumor lysbilder av ulike behandlingsgruppene ble visualisert under mikroskop, og Ki67, PCNA og tunel positive celler ble kvantifisert. Data representerer gjennomsnitt ± SE. * Og ** er signifikant forskjellig fra sine respektive kontroller, P . 0,05)
In vivo
regulering av død reseptor TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 av resveratrol og /eller sti
Siden resveratrol forbedrer det terapeutiske potensialet i TRAIL ved å indusere apoptose
in vivo
, vi søkt å undersøke de molekylære mekanismer som resveratrol forbedrer antitumor aktivitet av TRAIL i PC- 3 xenografter. Vi neste undersøkte effekten av resveratrol og /eller TRAIL på uttrykk for døds reseptorer (TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5) ved immunhistokjemi i tumorvev avledet fra
in vivo
forsøket (Fig. 3A , venstre og høyre panel). Behandling av mus med resveratrol forbedret uttrykk for DR4 og DR5. TRAIL litt indusert uttrykk for DR4 og DR5. På den annen side behandling av mus med en kombinasjon av resveratrol pluss TRAIL viste signifikant forbedrede uttrykk for DR4 og DR5 proteiner enn for mus behandlet med resveratrol alene eller TRAIL alene.
(A), Immunhistokjemi ble utført for å måle uttrykk for TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 i tumorvev avledet fra kontroll og behandlede mus på uke 6. Kvantifisering av DR4 og DR5 positive celler er også vist på panelet til høyre. (B), Uttrykk for TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5 og β-aktin i tumorvev avledet på uke 6. Western blot analyse ble utført for å måle uttrykket av DRs (venstre panel). Kvantifisering av DR4 og DR5 positive tumorceller (panel høyre). (C), Måling av DR4 og DR5 ved hjelp av ELISA. Proteiner ekstrakter ble utarbeidet og uttrykk for DRs ble målt i henhold til produsentens anvisninger.
Vi bekreftet immunhistokjemi data ved å undersøke uttrykket av disse proteinene ved Western blot analyse (fig. 3B). Behandling av mus med Resveratrol og TRAIL alene resulterte i oppregulering av dødsreseptorer DR4 og DR5. Til sammenligning resveratrol pluss TRAIL behandlinger hadde flere effekter på induksjon av DR4 og DR5 sammenlignet med monoterapi alene. Disse dataene er i overensstemmelse med immunhistokjemi data der proapoptotiske DR4 og DR5 proteinene ble oppregulert.
neste bekreftet immunhistokjemi og vestlige blot data ved å undersøke uttrykk for DRs av ELISA (Fig. 3C, panel til høyre). Behandling av mus med resveratrol og TRAIL alene oppregulert uttrykk for døds reseptorer (DR4 og DR5). Til sammenligning var kombinasjonen av resveratrol pluss TRAIL indusert flere DR4 og DR5 uttrykk enn monoterapi alene. Disse dataene er i overensstemmelse med immunhistokjemi og western blot data der proapoptotiske DR4 og DR5 proteinene ble oppregulert av resveratrol og TRAIL. Oppregulering av DRs kan forsterke apoptose-induserende potensialet i TRAIL.
In vivo
regulering av Bcl-2 familiemedlemmer og cellesyklusregulerende proteiner av resveratrol og /eller TRAIL
Siden BCL-2 familiemedlemmer spille en viktig rolle i apoptose, søkte vi å undersøke uttrykket av Bax og BCL-2 i tumorvev avledet fra resveratrol og /eller sti-behandlede mus (fig. 4A, venstre panel). Behandling av mus med resveratrol og TRAIL alene resulterte i oppregulering av Bax, og hemming av Bcl-2-ekspresjon. Til sammenligning, er kombinasjonen av resveratrol pluss TRAIL var mer effektive i oppregulering Bax og inhibering av Bcl-2. Vi neste bekreftet Western blot data ved å undersøke uttrykk av disse proteinene ved immunhistokjemi (Fig. 4A, midtre og høyre paneler). Behandling av mus med resveratrol oppregulert ekspresjonen av Bax og inhiberte ekspresjon av Bcl-2. Til sammenligning behandling av mus med en kombinasjon av resveratrol pluss TRAIL hadde flere effekter på oppregulering av Bax og inhibering av Bcl-2 enn enkelt middel alene.
(A), Western blot analyse ble utført for å måle uttrykk for Bax og BCL-2 i tumorvev avledet fra kontroll, resveratrol og /eller sti behandlede mus på uke 6 (venstre panel). Immunhistokjemi ble utført for å måle uttrykk for Bax og BCL-2 i tumorvev avledet fra kontroll og narkotika behandlet mus på uke 6 (midtre panelet). Kvantifisering av Bax og BCL-2 positive celler i kreftceller (høyre panel). (B), ble Western blot-analyse utført for å måle de uttrykk for p27
/KIP1 og cyklin D1 i tumorvev avledet fra kontroll- og medikamentbehandlede mus på uke 6 (venstre panel). Immunhistokjemi ble utført for å måle uttrykk for p27
/KIP1 og cyclin D1 i tumorvev avledet fra kontroll og narkotika behandlet mus på uke 6 (midtre panelet). Kvantifisering av p27
/KIP1 og cyclin D1 positive celler i tumor vev (panel høyre).
Vi neste undersøkte effekten av resveratrol og /eller TRAIL på uttrykk for p27
/KIP1 og cyclin D1 i tumorvev ved Western blotting og immunhistokjemi (fig. 4B). Behandling av mus med resveratrol resulterte i induksjon av cellesyklus inhibitor p27
/KIP1 og hemming av cyklin D1 ekspresjon (Fig. 4B). Til sammenligning TRAIL hadde ingen signifikant effekt på p27 ekspresjonen, men svakt hemmet ekspresjon av cyclin D1 sammenlignet med kontrollgruppen. Imidlertid er kombinasjonen av resveratrol og TRAIL viste oppregulering av p27, og hemming av cyklin D1 sammenlignet med monoterapi alene. Vi neste bekreftet Western blot data med immunhistokjemi data ved å undersøke uttrykk av disse proteinene (Fig. 4B, midtre og høyre panel). TRAIL har ingen signifikant effekt på ekspresjonen av p27, men svakt hemmet ekspresjon av cyclin D1. Til sammenligning resveratrol induserte uttrykket av p27, og inhiberte ekspresjon av cyclin D1. Disse dataene antyder at resveratrol kan regulere cellesyklus med opp-regulerer uttrykket av p27 og hemme uttrykket av cyclin D1.
In vivo
regulering av MMP-2 og MMP-9 uttrykk ved resveratrol og /eller sti
Forhøyede uttrykk for matriksmetalloproteinaser (MMP) er assosiert med økt metastatisk potensial i mange kreftceller [35], [36], [37]. Vi søkte derfor å undersøke effekten av resveratrol på MMP-2 og MMP-9 uttrykk i tumorvev avledet fra xenopodet naken mus ved immunhistokjemi og Western blot analyse. Behandling av mus med xenogrfated resveratrol resulterte i inhibering av MMP-2 og MMP-9 uttrykk enn de av kontrollen eller TRAIL-behandlede gruppe (Fig. 5A og B). Kombinasjonen av resveratrol og TRAIL var mer effektive i å hemme MMP-2 og MMP-9 uttrykk enn monoterapi alene. Vi neste bekreftet immunhistokjemi data ved å undersøke uttrykket av disse proteiner ved Western blot analyse (Fig. 5C). TRAIL har ingen signifikant effekt på uttrykk for MMP-2 og MMP-9. Til sammenligning resveratrol eller resveratrol pluss TRAIL hemmet uttrykk for MMP-2 og MMP-9. Disse dataene tyder på at resveratrol og /eller TRAIL kan hemme prostata cancer metastase ved å hemme MMP-2 og MMP-9.
(A), Immunhistokjemi ble utført for å måle de uttrykk for MMP-2 og MMP-9 i tumorvev avledet fra kontroll, resveratrol og /eller TRAILtreated mus på uke 6. (B), Kvantifisering av MMP-2 og MMP-9-positive celler i tumorvev. (C), ble Uttrykk for MMP-2, MMP-9 og β-aktin i tumorvev, målt på uke 6 ved Western blot-analyse.
In vivo
regulering av angiogenese ved resveratrol og /eller TRAIL
Enten regresjon i tumorvekst med resveratrol og /eller TRAIL var på grunn av inhibering av angiogenese, analyserte vi markører for angiogenese ved immunhistokjemi i tumorvev, som stammer fra kontroll og behandlede mus (fig . 6). Vi først undersøkte effekten av resveratrol og /eller TRAIL behandling av antall blodårer i tumorvev ved å utnytte tre forskjellige metoder (Fig. 6A). Blodårer ble undersøkt ved farging av tumorvev ved H E, anti-CD31-antistoff, og anti-vWF-antistoff. Behandling av mus med resveratrol eller TRAIL forårsaket en inhibering i antall blodkar. Til sammenligning, ved behandling av musene med en kombinasjon av resveratrol pluss TRAIL ytterligere hemmet antall blodkar.
(A), venstre panel, tumor vevssnitt avledet fra kontroll, resveratrol og /eller TRAIL-behandlede mus videre uke 6 ble farget med H E og antall blodårer ble talt ved 400 X forstørrelse. Hver kolonne representerer gjennomsnittet ± SD. * Eller ** = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. Midtpanelet, blodkar kvantifisering i tumorer avledet på uke 6. tumorsnitt fra kontroll- og medikamentbehandlede mus ble farget med anti-CD31-antistoff, og antall CD31-positive blodårer ble tellet. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD. * Eller ** = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. Høyre panel, ble tumorsnitt fra kontroll- og medikamentbehandlede mus ble oppnådd på uke 6 farget med anti-von Willebrand faktor (vWF) antistoff for å vurdere blodårer. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD. * Eller ** = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (B), venstre panel, immunohistokjemi ble utført for å måle ekspresjonen av VEGF i tumorvev avledet fra kontroll- og medikamentbehandlede mus i uke 6. Høyre panel, kvantifisering av VEGF-positive celler i tumorvev. Høyre panel, kvantifisering av VEGF-positive celler. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD. * Eller ** = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. Nedre panel, ble uttrykk for VEGF og β-aktin i tumorvev avledet på uke 6 målt ved Western blot analyse. (C), VEGF-reseptor-2 (VEGF-R2) -positive sirkulerende endotelceller hos mus på uke 6. blodcellene fra perifert blod er festet til sleiden ble farget med anti-VEGF-R2-antistoff, og antallet av VEGF-R2 positive celler ble tellet under et mikroskop. Resultatene er vist som gjennomsnitt ± SD. * Eller ** = signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05
Vi neste undersøkt uttrykk for VEGF av immunhistokjemi og Western blot analyse (figur 6). Undersøkelse av tumorvev ved immunhistokjemi viste at kontrollmusene hadde økt VEGF-positive endotelceller sammenlignet med resveratrol eller TRAIL behandlet mus (Fig. 6B, venstre og høyre panel). Kombinasjonen av resveratrol pluss TRAIL viste signifikant mindre VEGF farging enn monoterapi alene. Vi bekreftet ved immunhistokjemi data for VEGF-ekspresjon ved å undersøke protein-nivåer ved Western blot-analyse (Fig. 6B, nedre panel). Behandling av mus med resveratrol og TRAIL alene hemmet VEGF uttrykk. Til sammenligning resveratrol pluss TRAIL hemmet ekspresjon av VEGF.
Vi har vist at antallet sirkulerende vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor 2 (VEGF-R2)-positive endotelialceller korrelerer direkte med økningen i tumor angiogenese og kan tjene som
in vivo
indikatorer på tumor angiogenese [31], [38]. Som forventet, hadde kontrollmusene øket sirkulerende VEGF-R2-positive endotelceller sammenlignet med resveratrol behandlede mus (Fig. 6C). Resveratrol pluss TRAIL-behandlede gruppen viste signifikant mindre VEGFR2-positive celler enn at resveratrol eller TRAIL behandlede gruppen. Disse dataene sterkt viser at resveratrol kan hemme tumorvekst ved å hemme angiogenese, og kan også fremme antitumor aktivitet av TRAIL
in vivo
.
In vivo
regulering av transkripsjon faktor FKHRL1
AKT er blitt vist å fosforylere FKHRL1, og inhiberingen av fosforyleringen FKHRL1 bevirker dets atomtranslokasjon, forsterket DNA-bindende og transkripsjonen aktivitet [39]. Vi neste undersøkt om antitumor aktivitet av resveratrol og /eller TRAIL utøves gjennom aktivering av FKHRL1 (Fig. 7). Resveratrol og TRAIL hemmet fosforylering av FKHRL1; Men resveratrol var mer effektiv enn TRAIL. Kombinasjonen av resveratrol og TRAIL hadde mer effekt i å hemme fosforylering av FKHRL1 enn monoterapi alene. Vi undersøkte neste fosforyleringen av FKHRL1 i tumorvev ved immunhistokjemi (Fig. 7B og C). Resveratrol og TRAIL inhiberte de cytoplasmiske nivåer av fosforylert FKHRL1 som vist i fig. 7B og kvantifisert i fig. 7C. Kombinasjonen av resveratrol pluss TRAIL hatt mer effekt i begrenser cytoplamic nivåer av fosforylert FKHRL1 enn monoterapi alene. Disse dataene antyder at resveratrol og TRAIL kan hemme fosforyleringen av FKHRL1, som kan resulterer i sitt kjernefysiske translokasjon og aktivisering.
(A), Hemming av FKHRL1 fosforylering av resveratrol. Western blot-analyse ble utført for å måle ekspresjonen av fosfo-FKHRL1 i tumorvev, som stammer fra kontroll og /eller medikament-behandlede mus på uke 6. (B), Immunhistokjemisk undersøkelse av fosfo-FKHRL1. Immunhistokjemi ble utført for å måle ekspresjonen av fosfo-FKHRL1 i tumorvev, som stammer fra kontroll, resveratrol og /eller TRAIL-behandlede mus på uke 6. (C) Kvantifisering av FKHRL-positive celler i tumorvev. (D), FKHRL1-DNA-bindingsaktivitet. Atom ekstrakter ble preparert fra tumorvev avledet fra kontroll og medikamentbehandlede mus. Gelshift analysen ble utført for å måle den FKHRL1-DNA-bindende aktivitet som beskrevet i Materialer og Metoder.
ved siden undersøkte FKHRL1-DNA-bindende aktivitet av gelshift analysen (fig. 7D). Atom ekstrakter ble preparert fra tumorvev avledet fra resveratrol og /eller sti behandlet mus. Gelshift data viste at TRAIL og resveratrol forbedret FKHRL1-DNA bindende aktiviteter. Kombinasjonen av resveratrol og TRAIL hadde signifikant mer FKHRL1-DNA bindingsaktivitet enn monoterapi alene. Samlet er disse data tyder på at resveratrol og TRAIL kan hemme fosforylering av FKHRL1 som fører til økt kjernefysisk translokasjon og DNA bindende aktiviteter.
Diskusjoner
Vi har nylig vist at resveratrol induserer apoptose i Trail- sensitive PC-3 celler, og sensitizes TRAIL-resistente LNCaP celler
in vitro
gjennom aktivering av flere signalveier [14], [15]. Resveratrol-indusert apoptose i inngrep mitokondrier, som ble vist ved et fall i mitokondriemembranpotensialet og aktivering av kaspase-3 og kaspase-9 i begge prostatakreft PC-3 og LNCaP-celler [14], [15]. Resveratrol indusert uttrykk for proapoptotiske proteiner (Bax, Bak, PUMA, Noxa og BIM), død reseptorer (TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5), og hemmet uttrykk for anti-apoptotiske proteiner (Bcl-2 og Bcl-X
L) og tilgangspunkter (XIAP og survivin). I vår siste undersøkelse, resveratrol regulert uttrykk for TRAIL, DR4, DR5, Bim, p27
/KIP1 og cyclin D1 gjennom FOXO transkripsjonsfaktorer
in vitro
, og hemming av FKHRL1, FKHR og AFX av RNAi blokkert disse påvirker av resveratrol [40]. I denne studien har vi validert våre
in vitro
funn og påvist at resveratrol og TRAIL alene hemmet veksten av PC-3 xenografter, metastase og angiogenese gjennom aktivering av FOXO transkripsjonsfaktorer. Interessant, kombinasjonen av resveratrol og TRAIL hadde større virkning på hemming av tumorvekst, metastase og angiogenese enn noen av midlene alene.
In vitro
resveratrol downregulated uttrykket av Bcl-2 og Bcl -X
L og oppregulert uttrykk for p53, Bax, Bak, PUMA, Noxa, og Bim på mRNA og proteinnivåer i prostatakreftceller [41]. Vi har også vist at resveratrol oppregulert uttrykket, fosforylering, og acetylering av p53 i androgen-avhengige LNCaP-celler [41]. Evnen til resveratrol for å regulere gentranskripsjon var også tydelig som det forårsaket acetylering av histon H3 og H4 i LNCaP-celler [41]. Videre behandling av LNCaP celler med resveratrol resulterte i translokasjon av Bax og p53 til mitokondriene, produksjon av reaktive oksygenforbindelser, fall i mitokondriemembranen potensial, frigjøring av mitokondrielle proteiner (cytokrom c, Smac /DIABLO og Omi /HtrA2), og aktivisering av caspase-3 fører til apoptose [41]. Videre hemmet fullstendig sletting av Bax og Bak gener resveratrol-indusert cytokrom c og Smac /DIABLO utgivelse i mus embryonale fibroblaster [42]. I den foreliggende undersøkelse, behandling av xenopodet mus med resveratrol resulterte i nedregulering av Bcl-2 og oppregulering av Bax. Kombinasjonen av resveratrol pluss TRAIL var mer effektive i å regulere BCL-2 familiemedlemmer enn monoterapi alene. Våre tidligere publiserte
in vitro
data er i tråd med gjeldende
in vivo
studier som viser at resveratrol kan engasjere celle indre vei av apoptose ved å regulere uttrykket av Bcl-2 familien av proteiner.
FOXO transkripsjonsfaktorer er tumor suppressors som er inaktivert i de fleste kreft hos mennesker, på grunn av den overaktivering av PI3K /AKT vei [43]. FOXO proteiner kan regulere en rekke gener som påvirker celleproliferasjon, overlevelse, metabolisme og som svar på stress [19], [20], [44]. FOXO transkripsjonsfaktorer er regulert ved syntese, acetylering, fosforylering og ubiquitinering på tre ulike nivåer: subcellulære lokalisering, stabilitet og transkripsjonen aktivitet [19], [20], [44]. Ved aktivering av PI3K /AKT signalering, FOXOs gjennomgå AKT-mediert fosforylering, som fremmer binding til 14-3-3, kjernekraft eksport gjennom CRM1 og cytoplasmatiske håndtering. Under spenningsforholdene eller i fravær av vekst eller overlevelse faktorer, når den PI3K /AKT-reaksjonsveien er sperret, FOXO proteiner translocate til cellekjernen, hvor deres transkripsjonelle funksjoner kan utføres [45]. En andre regulerings lag er FOXO acetylering av p300, CBP (CREB-bindende protein) og Pcaf (P300 /CBP-assosierte faktorer) som reaksjon på oksidativt stress eller DNA-bindende [46], [47], [48], fulgt av deacetylering av klasse i og II histon deacetylases [48], [49], [50], blant annet SIRT1, NAD
+ – avhengige deacetylase kodet for av ortolog av gjær lang levetid gen SiR2 [51]. Vi har nylig vist at inhibering av PI3K /AKT sti forbedret FOXO-DNA-bindende og transkripsjonen aktivitet [40], [52]. Videre fosforylering mangel mutant av FOXO forbedret resveratrol-indusert FOXO transkripsjonen aktivitet og apoptose. Post-translasjonell modifikasjon av FOXO proteiner er en viktig mekanisme som regulerer evnen til forskjellige transkripsjonsfaktorer for å aktivere forskjellige gensettene, som er involvert i cellesyklus-inhibering [53], apoptose [54], forsvaret mot oksidativt stress og DNA-reparasjon [55]. Den forbedrede DNA-bindingsaktivitet tjener også til å begrense tilgjengeligheten av FOXO proteiner for fosforylering av AKT [46]. I denne studien har vi vist at resveratrol indusert apoptose i prostatakreftceller gjennom aktivering av FOXO transkripsjonsfaktorer. Tilsvarende i en annen studie har vi vist at hemming av FOXO transkripsjonsfaktorer ved shRNA blokkert resveratrol-indusert oppregulering av Bim, TRAIL, DR4, DR5, p27
/Kip1 og apoptose, og resveratrol-indusert hemming av cyclin D1 i prostatakreft celler
in vitro product: [40]. Våre data antyder at resveratrol induserer cellesyklus og apoptose ved regulering av FOXO transkripsjonsfaktorer i prostatakreftceller.
FOXO transkripsjonsfaktorer har vist seg å være konstitutivt aktivert i forskjellige humane kreftformer, inkludert prostata kreft [39] , [56]. FOXOs er vist for å bidra til utvikling og /eller progresjon av kreft ved å regulere ekspresjon av gener som er involvert i cellevekst, differensiering, apoptose, angiogenese og metastase [39], [56].
