Abstract
Aciculatin, et naturlig stoff hentet fra medisinsk urt
Chrysopogon aciculatus
, viser potent anti-kreft potens. Denne studien er den første til å bevise at aciculatin induserer celledød i humane kreftceller og HCT116 muse xenografter grunn G1 arrest og påfølgende apoptose. Den primære årsaken til cellesyklus arrest og celledød var p53 opphopning fulgt av økt p21 nivå, defosforylering av Rb protein, PUMA uttrykk, og induksjon av apoptotiske signaler som spalting av caspase-9, caspase-3, og PARP. Vi har vist at p53 allel-null (- /-) (p53-KO) HCT116-celler var mer resistente overfor aciculatin enn celler med vill-type p53 (+ /+). Det samme resultatet ble oppnådd ved å slå ned p53 med siRNA i p53 villtype-celler, noe som indikerer at p53 spiller en avgjørende rolle i aciculatin-indusert apoptose. Selv om DNA-skade er den mest vanlige arrangement fører til p53-aktivering, har vi funnet bare svake tegn på DNA-skade etter aciculatin behandling. Interessant, aciculatin-indusert nedregulering av MDM2, en viktig negativ regulator av p53, p53 bidratt til opphopning. Den anti-kreft-aktivitet og viktigheten av p53 etter aciculatin behandling ble også bekreftet i HCT116 xenograft-modeller. Samlet tyder disse resultatene på at aciculatin behandling induserer cellesyklus og apoptose via hemming av MDM2 uttrykk, og dermed indusere p53 opphopning uten betydelig skade på DNA og genom toksisitet
Citation. Lai CY, Tsai AC, Chen MC, Chang LH, Sun HL, Chang YL, et al. (2012) Aciculatin induserer p53-Dependent apoptose via MDM2 Nedbryting i humane kreftceller
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 7 (8): e42192. doi: 10,1371 /journal.pone.0042192
Redaktør: Marie-Josée Boucher, Universitetet i Sherbrooke, Canada
mottatt: 26 januar 2012; Godkjent: 04.07.2012; Publisert: 13 august 2012
Copyright: © Lai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science Council of republikken Kina (NSC 99-2628-B-002-024-My3 og NSC 99-2320-B-400-008-My3) (https://web1.nsc.gov. tw /). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Discovery og utvikling av anti-kreft narkotika er en endeløs utfordring for biokjemikere og pharmacologists over hele verden. Naturlige produkter er rikelig kilder til nye og cytotoksiske strukturer som har potensial til å være lovende blyforbindelser for antineoplastiske medikamenter.
Aciculatin er en naturlig forbindelse isolert fra medisinsk urt,
Chrysopogon aciculatus
, som er mye brukt til behandling av hevelser, forkjølelse, feber og diaré. Aciculatin ble først rapportert i 1991 som viser DNA-bindende aktivitet og cytotoksisitet
in vitro product: [1], [2]. En ny studie viste at aciculatin utøver tvilling hemmende effekt på induserbar nitrogenoksid syntase (iNOS) og cyklooksygenase-2 (COX-2) på grunn av regulering av NF-kappaB og c-Jun N-terminal kinase (JNK) /p38-trasé [ ,,,0],3]. Men den eksakte mekanismen som aciculatin utøver sin svulst hemmende effekt er fortsatt uklart.
Tumor suppressor p53 spiller en avgjørende rolle i å vekke svar på celle påkjenninger som hypoksi, DNA-skade, og onkogen aktivering. Under normale forhold er p53 hurtig nedbrutt av E3-ubiquitin-ligase murine dobbelt minutt 2 (MDM2); er halveringstiden av p53 er således kort og dets proteinnivå er vanskelig å oppdage [4]. Når cellene blir utsatt for de nevnte påkjenninger, er p53-degradering slått av. Akkumulert p53 danner deretter tetramerer og bindes til spesifikke DNA-domener, noe som fører til transkripsjonen regulering av genene. De vanligste effektene er DNA-reparasjon, cellesyklus arrest, senescence, og apoptose. Nedstrøms cellulære responser til p53 kunne undertrykke ukontrollert vekst, og om nødvendig, fjerne ødelagte celler [5]. Denne strategien har vært brukt i kortsiktig kreft terapi for å indusere p53-avhengig apoptose ved å bruke, for eksempel, DNA-skadestoffer. Imidlertid er bivirkningene av denne behandlingen er alvorlige på grunn av genotoksistet. Dessuten, selv om nesten 50% av humane kreftformer har villtype p53, noe oppregulert trasé blokk p53-funksjon, for eksempel p14ARF mangel og MDM2 amplifikasjon [6]. Derfor midler som kan indusere eller gjenopprette villtype p53-funksjon og korrigere unormal vei med lavere bivirkninger er ideelle kandidater for nye kreftmedisiner [7], [8].
MDM2 oncoprotein er en E3 ubiquitin ligase som styrer p53-nivå i cellene. MDM2 er en negativ regulator mediere ubiquitin degradering av p53; MDM2 også hemmer transkripsjonen aktivitet av p53 og letter sitt atom eksport [9]. Overekspresjon av MDM2 som svekker p53 funksjonen har blitt funnet i mange humane tumorer. Videre interagerer MDM2 med forskjellige tumor suppressor proteiner, inkludert Rb, p21, p19 /14
ARF, E2F1, p73 og MTBP [10], [11], [12], [13], [14].
i denne studien, vi forsøkte å identifisere anti-tumor mekanisme aciculatin med
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter med HCT116 humane kolorektal kreftceller. Resultatene gir bevis på viktigheten av p53 og nedstrøms mål i aciculatin-indusert cellesyklus arrest og caspase-avhengig apoptose. Effektene av aciculatin på MDM2 reduksjon og tilhørende p53 opphopning er også beskrevet. Samme resultater ble også bekreftet ved hjelp av A549, en p53 villtype ikke-småcellet lungekreft cellelinjen. Sammen er disse funnene tyder på at aciculatin er et lovende naturlig produkt for kreftbehandling.
Materialer og metoder
Material
Aciculatin ble ekstrahert og renset fra
Chrysopogon aciculatus
av professor CC Chen, Institutt for bioteknologi, Hungkuang University, Taiwan, med renhet over 98%. RPMI 1640, føtalt bovint serum (FBS), penicillin, streptomycin, og alle andre vev kultur reagenser ble erholdt fra Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Forbedret chemiluminescence deteksjon kit var fra Amersham. Trizol reagent var fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); tilfeldig primer og M-MLV RT ble kjøpt fra Promega (Madison, WI USA.); pro-Taq var fra Protech (Taipei, Taiwan). HRP polymer konjugatreagens SuperPictureTM var fra Zymed LABORATORIES INC (San Francisco, CA, USA).; Nuceolin antistoff, propidiumjodid (PI), 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid, sulforhodamin B, og alle de andre kjemiske reagenser ble oppnådd fra Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA)
Cell kultur
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinje HCT116 og human ikke-småcellet lungekreft cellelinje A549 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC,. Manassas, VA , USA). p53-KO (p53 knockout) HCT116-celler ble vennlig levert av Dr. B. Vogelstein (Johns Hopkins). Begge ble dyrket i RPMI 1640 med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (v /v) og penicillin (100 enheter /ml) /streptomycin (100 ug /ml). Celler ble opprettholdt i en fuktet inkubator ved 37 ° C i 5% CO
2/95% luft.
MTT-analysen
celler ble inkubert med bærer (0,1% DMSO) eller forbindelser i 48 timer. Vasket en gang og inkubert med 0,5 mg /mL, 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid ved 37 ° C i 1 time. Etter inkubering ble cellene lysert med DMSO og absorbansen ble oppnådd ved anvendelse av en ELISA-leser (550 nm). Resultater ble beregnet som: cellelevedyktighet (%) = Gjennomsnittlig O.D. brønner /gjennomsnittlig O.D. av kontrollbrønnene.
FACScan flow-cytometri
Etter behandling med bærer (0,1% DMSO) eller forbindelser for de angitte tidsforløp, ble cellene høstet ved trypsinering, for cellesyklusanalyse, ble cellene fiksert med 70% (v /v) alkohol ved 4 ° C over natten. Etter sentrifugering ble cellene inkubert i 0,1 mol /l fosfat-sitronsyrebuffer [0,2 mol /l NaHPO
4, 0,1 mol /l sitronsyre (pH 7,8)] i 20 minutter ved romtemperatur. Deretter ble cellene sentrifugert og resuspendert med 0,5 ml PI-løsning inneholdende Triton X-100 (0,1%, v /v), RNase (100 ug /ml), og PI (80 ug /ml). DNA-innholdet ble analysert med FACScan og Cellquest-programvare (Becton Dickinson). For annexin V-FITC og PI dobbel farging, FITC Annexin V apoptose Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ble utført. Cellene ble sentrifugert og inkubert med disse reagensene umiddelbart. Etter inkubering i 15 minutter ble de fluorescerende merkede cellene deretter analysert med FACScan og Cellquest-programvare.
TUNEL
Celler sås i 8-brønns glide kamre ble sultet over natten og behandlet med bærer (0,1 % DMSO) eller aciculatin i 24 timer. Cellene og vevssnitt tumor ble fiksert i 4% paraformaldehyd og vasket to ganger med PBS. De apoptotiske celler ble identifisert
in situ
bruker terminal deoksynukleotidyltransferase å overføre biotin-deoxyuridine triphosphatase (TUNEL, Roch Diagnostics, Mannheim, Tyskland) til fri 3′-OH av spaltet DNA. Spaltingsseter ble merket med biotin og visualisert ved omsetning med fluorescein-konjugert avidin (avidin-fluoresceinisotiocyanat). Photomicrographs ble innhentet av Leica TCS SP2 confocal spektral mikroskop.
Western blot analyse
Western blotting for total cellelysat og kjernekraft ekstraksjon ble utført som tidligere rapportert [15], [16] med anti- p53, anti-pRb og anti-caspase-8 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA); anti-α-tubulin, anti-actin, anti-p21, anti-p27, anti-poly (ADP-ribose) polymerase, anti-fosforylert H2AX (Ser139), anti-MDM2, anti-Puma, HRP-konjugert anti-mus og anti-kanin IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); anti-caspase-3 (IMGENEX, San Diego, CA, USA); anti-caspase-9 og fosfor-ser15-p53 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)
RNA ekstraksjon og revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR)
Total. RNA ble ekstrahert med Trizol reagens av produsentens protokoll (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Revers transkripsjon ble utført med 5 ug mRNA og tilfeldig primer ved 65 ° C i 5 minutter, deretter blandet med Moloney murin leukemivirus revers transkriptase (RT) for å reagere ved 37 ° C i 1 time for å oppnå cDNA. Genamplifikasjon ble fulgt med RT-polymerase kjedereaksjon (PCR). Primersekvensene som brukes til forsterkning var som følger: GAPDH, 5′-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3 «/5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3′; p53, 5»-CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC-3 «/5′-CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC-3′; MDM2, 5»-GGGAGATATGTTGTGAAAGAAGC3 «- /5»-CCCTGCCTGATACACAGTAACTT. Standard forsterkningsparametre ble anvendt med følgende fremgangsmåter: For p53, 94 ° C i 3 minutter, 35 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 sekunder, annealing ved 60 ° C i 45 s, og forlengelse ved 72 ° C i 1 min , endelig, 72 ° C i 10 min. For GAPDH og MDM2, 95 ° C i 10 min; 35 sykluser (MDM2: 40 sykluser) med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing ved 60 ° C i 5 s, og forlengelse ved 72 ° C i 12 s; etterfulgt av en endelig forlengelse ved 75 ° C i 15 sek. PCR-produktene ble analysert på 1,5% agarosegel i nærvær av 1 ug /ml etidiumbromid.
Transient transfeksjon
HCT116-celler ble sådd ut i 3,5-cm skåler over natten, og deretter transfektert med TP53 siRNA eller MDM2 plasmid hjelp Lipofectamine 2000 i henhold til produsentens protokoll. TP53 siRNA og lipofektamin 2000 er fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) og MDM2 plasmid (nr 16233) er fra Addgene (Cambridge, MA, USA). Etter 6 timers transfeksjon og re-serum, ble cellene sultet og deretter behandlet med bærer (0,1% DMSO) eller aciculatin i de angitte tidsrom. Cellelysater ble samlet for Western blot analyse.
Immunohistochemistry analyse
De formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) tumorvev skiver ble deparaffinized i xylen og rehydrert i en gradert serie av etanol. Senk vevssnitt med 3% hydrogenperoksid for å slukke endogen peroksidaseaktivitet. Å avsløre antigen, ble vevssnitt oppvarmet i 95 ° C Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA-oppløsning, 0,05% Tween 20, pH 9,0) i 30 min. Skivene ble blokkert med 4% fettfri melk i 40 minutter og inkubert med angitte antistoff i 1 time ved romtemperatur. HRP-polymer-konjugat reagens A (SuperPictureTM) ble påført på skiver og reagens B for senere peroksidase catalyzation som visualiserer plassering av antigenet. Mayers Hematoxylin løsningen var for kontra. Resultatene ble tatt til fange av Zeiss Axioskop-2 mikroskop.
Tumor xenograft modeller
Mann alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus ble implantert subkutant med HCT116 tumorceller. Når tumorene nådde gjennomsnittlig volum på 90 mm
3, ble musene delt i to grupper (
n
= 5) og agenten behandling ble igangsatt. Vehicle (Cremophor EL /etanol, 01:01, 0,2 ml /mus) eller aciculatin (30 mg /kg) ble administrert intraperitonealt (i.p.) for fem ganger hver uke. Lengden (
L
) og bredde (
W
) av svulsten ble målt hver 3 til 4 dager, og svulsten volum ble beregnet som
LW
2/2. Protokollene av
in vivo
studien ble godkjent av Animal Care og bruk komité ved National Taiwan University.
Statistisk analyse
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av angitt antall for egne eksperimenter. Statistisk analyse av data ble utført med enveis ANOVA etterfulgt av
t
test, og
p
. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
Aciculatin induserer G0 /G1 arrest og påfølgende apoptotisk celledød i humane kreftceller
Aciculatin er en roman C-glykosid flavonoider avledet fra
C. aciculatus
ekstrakt (figur 1A) sikret tett karbon-karbonbinding gjør en C-glykosid mer stabil enn en O-glykosid i det sure miljøet eller tilstedeværelse av glycosidases
in vitro Hotell og
i vivo
. Vi brukte en sulforhodamin B assay (SRB) for å vise at aciculatin forårsaket veksthemning, ikke bare i HCT116 human kolorektal kreft cellelinje (GI
50 = 2,81 uM), men også i andre kreftcellelinjer (tabell S1). Cytotoksisiteten av aciculatin i HCT116-celler ble bestemt ved mitokondrie 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) bromid reduksjon analysen med en IC
50 til 5,88 uM (figur 1B) . For å bestemme cellesyklusfordeling, ble synkroniserte celler behandlet med aciculatin og analysert med FACScan flowcytometri og propidiumjodid (PI) farging. Resultatene viste at aciculatin kan indusere G0 /G1 rest og etterfølgende oppsamling av sub-G1 faseceller i en tidsavhengig måte. De økte G1 proporsjoner etter behandling ved de angitte tidspunkter er vist i kurven diagrammet (figur 1C). Vi neste undersøkt induksjonen av apoptose ved hjelp av aciculatin TUNEL assay. Figur 1D viser at DNA-fragmentering øket etter 24 timer på 7,5 uM aciculatin behandling. Prosentandelene av TUNEL-positive celler i denne analysen ble beregnet og kvantifiseringen av data er vist. Disse dataene indikerer at aciculatin kan betydelig indusere apoptose i HCT116 cellene
A, Oppbygging av aciculatin. 8- (2,6-dideoxy-
β Anmeldelser –
Ribo Anmeldelser – exopyranosyl) -5-hydroksy-2- (4-hydroksyfenyl) -7-metoksy-4H-1-benzopyran-4-on sesquihydrat. B, HCT116-celler ble inkubert med de angitte konsentrasjoner av aciculatin (5-10 uM) i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble deretter bestemt ved MTT-analyse. C, HCT116-celler ble sultet over natten, og deretter inkubert med bærer (0,1% DMSO) eller aciculatin (10 uM) i det angitte tidsrom. DNA-innholdet ble deretter analysert ved PI flekker ved hjelp av en FACScan flowcytometrisk analyse. Kurven Figuren viser at aciculatin økte G1 populasjon av celler i en tidsavhengig måte. Gjennomsnitt ± SE verdier fra 3 uavhengige eksperimenter. *
P
0,05 og ***
P
0,001, sammenlignet med ikke-behandlede celler. D, HCT116 cellene ble behandlet med kjøretøy (0,1% DMSO) eller aciculatin (7,5 mm) og dobbelt farget med TUNEL og DAPI. Økt grønn fluorescens indikerte at cellene gjennomgikk apoptose etter aciculatin behandling (TUNEL, panel til høyre). Kjernene ble farget med DAPI (venstre panel). Stolpediagrammet viser andelene av Tunel positive celler i hver behandlings normalisert til DAPI. ***
P
. 0,001
Aciculatin induserer cellesyklus og apoptose gjennom oppregulering av p21
WAF1 /CIP1 og induksjon av caspase aktivitet
Vi neste undersøkt effekten av aciculatin på G0 /G1 arrest cellesyklusregulerende proteiner. Den cyclin-avhengig kinase hemmere p21 og p27 er avgjørende regulatorer av G0 /G1 arrest. Som vist i figur 2A, ble p21 signifikant oppregulert og retinoblastom protein (Rb) ble defosforylert uten noen tilsynelatende endring i p27 etter 4 timers aciculatin behandling. Begge iboende (kaspase-9) og ytre (caspase-8) apoptotiske reaksjonsveier ble detektert etter 8 timer med behandling, og den nedstrøms apoptotiske effektor caspase-3, ble også aktivert (figur 2B). Konsentrasjonsavhengig økning i apoptose ble også identifisert 24 timer etter aciculatin behandling (figur 2C). Disse resultater viser at aciculatin behandling kan utløse HCT116 cellesyklus-stans i G0 /G1 fase og deretter indusere apoptose.
A, HCT116-celler behandlet med aciculatin (10 uM) i de angitte perioder, og deretter høstet for deteksjon av G0 /G1 arrest relaterte proteiner (p21, pRb og p27) ved immunoblotting. B, HCT116-celler behandlet med aciculatin (10 uM) i de angitte perioder og deretter høstet for deteksjon av caspaseaktivering og PARP-spaltning. C, HCT116-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av aciculatin (5, 7,5 og 10 uM) i 24 timer. Etter aciculatin behandling, ble apoptotiske proteiner oppdaget for hver konsentrasjoner behandling. Stjernen markerer en uspesifikk band.
Aciculatin økt ekspresjon av p53 protein og nedstrøms effektorer via en proteasome-mediert degradering vei
Fenomenene våre tidligere data avslørt er antas å være assosiert med tumor suppressor protein p53. Således ble ekspresjon av p53 undersøkt ved en rekke tidspunkter. Som vist i figur 3A, aciculatin vesentlig indusert p53-ekspresjon i en tidsavhengig måte. P53 nedstrøms produkt MDM2, som også er en viktig regulator av ubiquitin-formidlet p53-degradering, ble funnet å være oppregulert etter akkumuleringen av p53. Interessant var det en nedgang i MDM2 løpet av de første par timene av aciculatin behandling. Vi deretter bekreftet sammenhengen mellom aciculatin og DNA-skader. Våre data indikerer at aciculatin bare svakt økt fosfo-ser15-p53, som er nedstrøms virkningen av DNA-skade. DNA dobbel tråd pause markør fosforylert histon 2AX (γ-H2AX) dukket opp før de senere stadier av aciculatin behandling. I tillegg, for å sjekke DNA enkle og doble trådbrudd, ble encellede gelelektroforese analyse (COMET analyse) utføres. Resultatene viste at det ikke er noen åpenbare DNA-skade etter 6 timers behandling med 10 uM aciculatin med en ny DNA-skader middel QS-ZYX-1-61 (utgitt av vår gruppe som tidligere) som positiv kontroll [17]. (Figur S1). Disse resultatene tyder på at DNA-skade er ikke en åpenbar tidlig virkning av aciculatin behandling. Vi enn bekreftet dette p53-avhengig effekt i en annen p53 villtype kreftceller A549. Aciculatin også utløses p53 opphopning, tidlig uttømming MDM2 (3 timer) og påfølgende apoptose banen, herunder spaltes caspase-9 og spaltet PARP i A549. For å undersøke proteinnivået av transkripsjonsfaktoren p53 akkumulert i kjernen av aciculatin ble de kjernefysiske fraksjonene ble ekstrahert og analysert. Figur 3B viser at p53 ble øket i kjernen i en tidsavhengig måte etter aciculatin behandling. For å bestemme mekanismen for aciculatin-fremkalt akkumulering p53, vi først bestemt mRNA-nivået av p53. Figur 3C viser at det ikke var noen fremtredende forandring i p53 mRNA-nivå. Under normale omstendigheter har p53-protein en svært kort halveringstid (ca. 15-30 min) på grunn av hurtig proteasomet degradering. Derfor bestemt vi enten aciculatin øker halveringstiden til p53. Når cykloheksimid ble brukt til å hemme proteinsyntese, observerte vi at aciculatin-indusert p53 ble stabilisert og hadde en lengre halveringstid (figur 3D). Videre introduserte vi proteasominhibitor MG132 å blokkere nedbrytningen veien. Figur 3E viser at protein nivået av p53 ikke ble økt med aciculatin behandling etter MG132 forbehandling i HCT116 og A549-celler. Disse resultatene viste at proteosomet-mediert nedbrytning veien er viktig for aciculatin-indusert p53 akkumulering.
A, HCT116 og A549-celler ble behandlet med aciculatin (10 uM) i de angitte perioder, og deretter høstet for deteksjon av p53 -relaterte proteiner. Nivåene av p53, fosfo-ser15-p53, γ-H2AX, og p53 nedstrøms mål MDM2 ble deretter bestemt i HCT116-celler. Nivåene av p53, MDM2, γ-H2AX, kløyvde caspase-9 og PARP ble bestemt i A549 celler. Stjernen markerer et ikke-spesifikke bånd. B, Nuclear utvinning av HCT116-celler ble utført etter aciculatin behandling på angitte tidspunkter. Aciculatin-indusert kjernefysiske akkumulering av p53 ble vist å være tidsavhengig. C, HCT116-celler behandlet med aciculatin (10 uM) ved forskjellige tidspunkter, etterfulgt av ekstraksjon av total RNA. P53-mRNA ble samtidig forsterket med GAPDH. D, HCT116-celler ble forbehandlet med aciculatin (10 uM) i 3 timer, etterfulgt av behandling med cykloheksimid (20 ug /ml) med eller uten aciculatin (10 uM) i de angitte perioder. E, HCT116 og A549 celler ble behandlet med 10 mm MG132 og 10 mikrometer aciculatin i 6 timer og deretter høstet for p53 deteksjon av immunoblotting.
Aciculatin avtar MDM2 på en transkripsjonsnivået, som er kritisk for p53 opphopning
i vår forrige undersøkelse, har ingen åpenbare DNA skade signaler blitt funnet. Dette kan bety at denne veien er ikke den eneste mekanisme som bidrar til p53 akkumulering. MDM2 medierer p53 ubiquitinering, som fører til proteasomal degradering av p53. MDM2 styrer også sin egen degradering av auto-ubiquitylation [18]. I denne studien ble MDM2 utarming funnet i de tidlige stadiene av aciculatin behandling (figur 3A). Dermed neste evaluert vi mekanismen av MDM2 ablasjon å avgjøre om denne minsk var involvert i aciculatin-indusert p53 akkumulering. Etter samtidig behandling med aciculatin og MG132, en proteasominhibitor, det MDM2 proteinnivået fortsatt falt bemerkelsesverdig i HCT116 og A549 celler (Figur 4A). Disse resultatene indikerer at andre proteasomer-uavhengig regulatoriske reaksjonsveier er aktive. Vi undersøkte deretter mRNA-nivået, og fant at MDM2 mRNA begynte å avta etter en time av aciculatin behandling. Samme resultat kan oppnås i p53-KO HCT116, hvilket antyder at aciculatin indusert MDM2 uttømming er ikke et p53-beslektet virkning (figur 4B). For å identifisere betydningen av MDM2 i p53 akkumulering, undersøkte vi aciculatin-indusert p53 akkumulering etter over-uttrykke MDM2 i HCT116 cellene. Etter aciculatin behandling, over-uttrykk for MDM2 reverseres p53 nivå (Figur 4C). Samlet indikerer disse resultater at aciculatin kan indusere akkumulering av p53 gjennom MDM2 mRNA uttømming.
A, HCT116 og A549-celler ble ko-behandlet med 10 uM MG132 og 10 uM aciculatin i 6 timer (HCT116) og 3 h (A549) og deretter høstet for deteksjon av MDM2 ved immunblotting. B, HCT116 og p53-KO HCT116-celler ble behandlet med aciculatin (10 uM) ved forskjellige tidspunkter, etterfulgt av ekstraksjon av total RNA. Den MDM2 mRNA ble samtidig forsterket med GAPDH. C, Den MDM2 plasmidet ble innført i HCT116-celler for å indusere over-ekspresjon av MDM2-protein; Cellene ble deretter behandlet med aciculatin i 3 timer. Protein nivåer av p53 og MDM2 ble oppdaget av western blotting.
Rollen til p53 i aciculatin-mediert cellesyklus og apoptose
Deretter rettet vi identifisere rollen p53 i aciculatin-indusert HCT116 cellesyklus og apoptose. Først sammenlignet vi cytotoksisiteten til aciculatin i en HCT116 p53-WT (vill-type) og p53-KO (knockout) system. Som vist i figur 5A, har vi funnet en signifikant forskjell i IC
50 mellom disse 2 cellelinjer; WT-celler (IC
50 verdi, 5.88 uM) var mer følsomme for aciculatin enn de p53-KO-celler (IC
50 verdi, 9.13 uM). Videre er andelen aciculatin-indusert G0 /G1 arrest i WT cellene var omtrent tre ganger høyere enn det som i p53-KO celler etter 18 timer av aciculatin behandling (figur 5B). Vi deretter brukt western blotting å undersøke p53 og apoptotiske proteiner i p53-WT og p53-KO HCT116 cellene under aciculatin behandling. Figur 5C viser at p53-KO-celler uttrykte lavere nivåer av kaspase-3 og spaltet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Induksjon av sub-G1 ble også undersøkt etter aciculatin behandling og resultatene tyder på at p53-KO cellene mer motstandsdyktig mot aciculatin-indusert sub-G1 tilvekst (nedre stolpediagram). Den p53 direkte transkripsjons mål, p21 og PUMA (p53 oppregulert modulator av apoptose) er knyttet til vekst og apoptose. Begge ble oppregulert etter 24 timer og 48 timer av aciculatin behandling på en konsentrasjonsavhengig måte. (Figur 5D). Figur 5D viser også knockdown av p53-proteinnivået ved siRNA i p53 villtype-celler HCT116 og A549; dette resulterte i signifikant inhibering av p53-ekspresjon etter aciculatin behandling, en effekt som varte i opptil 24 timer. Dette p53 uttømming førte til opphevelse av aciculatin-indusert p21 og defosforylering av Rb; også de apoptotiske proteiner PUMA, caspase-9, caspase-3 og PARP. Etter at cellene var dobbelt farget med annexin V-FITC og PI for apoptose og nekrose, og resultatene viste at p53 knock-down HCT116 og A549-celler var begge mer motstandsdyktig mot aciculatin indusert apoptose enn villtype-celler (figur 5E). Basert på disse dataene, foreslår vi at p53 er en sentral formidler av aciculatin-indusert apoptose.
A, p53-KO HCT116-celler ble inkubert med aciculatin (5-10 mm) i 48 timer. Cellelevedyktigheten ble deretter bestemt ved MTT-analyse. Resultatene ble sammenlignet med vill-type HCT116-celler. Gjennomsnitt ± SE fra 3 uavhengige eksperimenter. *
P
0,05 og **
P
0,01. B, p53-KO HCT116-celler ble sultet over natten og deretter inkubert med bærer (0,1% DMSO) eller aciculatin (10 uM) for forskjellige perioder. DNA Andelen ble senere analysert ved PI farging. Celle sykluser av p53-WT og p53-KO HCT116-celler etter behandling av 18 timer er vist. G1 andelene av begge cellelinjer ble sammenlignet. Gjennomsnitt ± SE verdier fra 3 uavhengige eksperimenter. *
P
0,05 og ***
P
0,001. C, p53-WT og p53-KO HCT116-celler ble inkubert med aciculatin (10 uM) i 24 timer og 48 timer og deretter høstet for påvisning av p53, kaspase-aktivering, og spaltning av PARP (øvre). p53-WT og p53-KO-celler ble behandlet med bærer (0,1% DMSO) eller aciculatin (10 uM) i 24 timer og ble deretter analysert ved PI farging. Induksjon av sub-G1 fasen av hver gruppe ble bestemt (nedre stolpediagram). **
P
0,005. D, HCT116-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av aciculatin (5, 7,5 og 10 uM). Etter 24 timer og 48 timer aciculatin behandling, Nivåene av p53, p21, ble pRb og PUMA deretter bestemt (øvre). p53 siRNA ble anvendt for å slå ned p53 nivået av HCT116 og A549-celler, som så ble behandlet med aciculatin i 24 timer. Cellene ble høstet for deteksjon av p53 og apoptotiske relaterte proteiner (lavere). E, p53 knock-down HCT116 og A549 celler ble behandlet med aciculatin (10 mm) i 40 timer og deretter dobbel farget med annexin V-FITC og PI. Prosentene av fluorescensmerkede celler ble bestemt ved flowcytometri.
Aciculatin hemmet HCT116 tumorcellevekst i mus xenograft modeller
For å undersøke
in vivo
anti -cancer aktivitet aciculatin, vi etablert HCT116-avledet xenograft modeller i alvorlige kombinert immunsvikt (SCID) mus. Både kontroll og behandlede mus ble avlivet, og HCT116-xenopodet tumorvev ble undersøkt. Som vist i figur 6A, resultatene demonstrerte at intraperitoneal administrering av aciculatin (30 mg /kg) en gang daglig i betydelig grad hemmet tumorvekst fra dag 8, uten tap av kroppsvekt; Dette tyder på at det var ingen åpen cytotoksisitet
in vivo
. Vi har også farget de HCT116-xenopodet tumorvev med Hematoxylin og Eosin (figur 6B-a, b), p53-antistoff (figur 6B-c, d) og Ki-67 (figur 6B-e, f). Resultatene viste at behandling med aciculatin betydelig økt p53 uttrykk og celleproliferasjon Ki67. Disse observasjon korrelerer med
in vitro
studier. Svulstvev skiver ble også farget med TUNEL reagent og resultatene indikerer at aciculatin-behandlede tumor gjorde gjennomgå apoptose (figur 6C).
HCT116-celler ble injisert subkutant i flankene av alvorlig kombinert immunsvikt mus. Musene ble delt i to grupper (
n
= 5), og når tumorene nådde gjennomsnittsvolumet (90 mm
3) behandlingen ble igangsatt. Musene ble avlivet på dag 12 etterpå. A, Kurvene viser gjennomsnittlig (± SE) tumor størrelser målt i hver gruppe. Forskjellene i tumorstørrelse mellom kontroll og behandlede mus var statistisk signifikant (*
P
0,05). Kroppsvekt ble målt hver dag fra dag 1 av administrasjonen. Det var ingen signifikante forskjeller etter behandling i en hvilken som helst av gruppene (data ikke vist). B, behandlede og ubehandlede tumorstykker ble undersøkt ved H E) og 200 × (for IHC) forstørrelse. C, svulstvev skiver ble vurdert av TUNEL analysesett og søylediagrammer indikerer ganger endring av sub-G1 fase. **
P
. 0,01
Diskusjoner
tumor suppressor protein p53 har vært en lovende mål for anti-kreft terapi i flere tiår. Det spiller en avgjørende rolle i cellesyklus regulering og apoptose. Her viste vi at aciculatin er en overbevisende p53 induktor og aktiverer også nedstrøms effektorer av p53. P21, en velkjent transcriptional målet for p53, er den viktigste regulator av G0 /G1 cellesyklus fase. Som vist i figur 2A og 5D, ble p21 ekspresjon øket og pRb ble hypofosforylerte etter aciculatin behandling.
