Abstract
ovarialcancer (EOC) er vanligvis oppdaget etter omfattende metastaser har utviklet seg i bukhulen. Ovarial overflate utsettes for peritoneal fluidtrykk og skjærkrefter på grunn av de kontinuerlige peristaltiske bevegelser av mage- og tarmsystemet, noe som skaper en mekanisk mikro-miljø for cellene. En
in vitro
eksperimentell modell ble utviklet for å eksponere EOC celler stabile strømningsinduserte veggen skjærspenninger (WSS). EOC-celler ble dyrket fra OVCAR-3 cellelinjen på utarmede amniotiske membraner i spesielle brønner. Veggskjærspenninger på 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm
2 ble påført på overflaten av cellene under betingelser som etterligner den fysiologiske miljø, etterfulgt av fluorescerende flekker av aktin og
β
-tubulin fibre. Cytoskjelettet respons på WSS inkludert celleforlengelse, stress fibre dannelse og generering av mikrotubuli. Mer cytoskeletal komponenter ble produsert av cellene og anordnet i et tettere og mer organisert struktur inne i cytoplasmaet. Dette tyder på at WSS kan ha en betydelig rolle i den mekaniske reguleringen av EOC peritoneal spre
Citation. Avraham-Chakim L, Elad D, Zaretsky U, Kloog Y, Jaffa A, Grisaru D (2013) fluid Flow Induced Wall Shear Stress og ovarialcancer Peritoneal Sprer. PLoS ONE 8 (4): e60965. doi: 10,1371 /journal.pone.0060965
Redaktør: Gil Ast, Tel Aviv University, Israel
mottatt: 18 desember 2012; Godkjent: 05.03.2013; Publisert: 10 april 2013
Copyright: © 2013 Avraham-Chakim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis finansiert av et stipend fra Israel Cancer Association. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) er femte største årsaken til kreft dødsfall blant kvinner, og har den høyeste dødsfall-til-sak-forhold av alle gynekologiske kreftformer. Utviklingen av EOC begynner ved overflaten epitel og etterfølges av aggressiv proliferasjon av EOC celler i eggstokken. Metastaser av EOC blir dannet tidlig i sykdomsprosessen ved spredning av EOC-celler hovedsakelig i bukhulen. Ovarial overflate stadig utsettes for peritoneal fluidtrykk og skjærkrefter på grunn av tarmen peristaltiske bevegelser. Denne mekaniske mikro-miljø ble antatt å være et fremtredende faktor som kontrollerer mønstre av tumorutbredelse [1], [2].
mekaniske stimuli som veggskjærspenninger (WSS) ble vist å påvirke mange cellulære prosesser slike som celleproliferasjon, cytoskjelettet ombygging, adhesjon og migrering i forskjellige celletyper, og stort sett studert med endotelceller [3]. Eksperimenter utført med dyrkede cancerceller (for eksempel, kolon, ovarie, blære, øsofageal, melanom) viste at mekaniske stimuli som trykk eller fluidstrømnings påvirke kreftcellenes adhesjon [2], [4], [5], [6], [ ,,,0],7], [8], migrasjon [4], [9], cadherins og integriner uttrykk [10], [11], invasjon kapasitet [11], [12], morfologi [12], [13] og levedyktighet [14 ]. Mange studier undersøkt effekten av blodstrømmen på adhesjonsegenskapene av sirkulerende metastatiske celler [4], [5], [7], [10], [11], [12], [13], [14]. Men det er verken
in vivo
eller
in vitro
studier om effekten av væskestrøm indusert WSS på EOC celler.
De nøyaktige mekanismer som EOC celler trenger inn eggstokken og spredning i bukhinnen ennå ikke er fullt ut oppdaget. På den annen side er det vel akseptert at cytoskjelettet er den viktigste cellulære struktur som kan fordele mekaniske krefter gjennom hele cellen for opprettholdelse av cellestruktur og integritet. Følgelig, i denne studien utforsket endringene i cytoskjelettet av humane EOC-cellene i respons til fluidstrømning indusert WSS under betingelser som simulerer fysiologiske miljø i bukhulen.
Materialer og metoder
Vi har utviklet en
in vitro
modell av humane EOC-celler ved dyrking av OVCAR-3 cellelinjen på en ribbet fostermembran (AM) ved hjelp av spesielle brønner som kan demonteres for å tillate Installasjon av brønnens bunn med cultued EOC celler i et strømningskammer for fluid eksperimenter hvor WSS induseres på toppen av cellene.
Cell Culture
EOC-celler ble dyrket fra cellelinjen OVCAR-3 (American Type Culture Collection (ATCC), Virginia, USA). De ble dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640-medium supplert med føtalt bovint serum (FBS), 5% natriumbikarbonat-løsning, 1M Hepes-buffer, 25% glukoseløsning, 100 mM natrium-pyruvat-oppløsning, 10 000 U /ml penicillin G og 10 mg /ml streptomycin-sulfat sammen med 1250 U /ml nystatin, og 4 mg /ml bovint insullin. Cellene ble først dyrket i plastflasker, og ved å nå 70-90% samløpet (vanligvis etter 2-3 dager) ble trypsinert (Trypsin EDTA 0,25%, løsning A).
For flømmingseksperimenter vi dyrket det EOC celler på ribbet AM, som ble høstet fra sikt placentas og ribbet fra laget av epitelceller, slik som beskrevet i en tidligere studie [15]. Den ribbet AM er en tykk ekstra cellemembranen laget av en avaskulært stroma som inneholder kollagen og fibronectin. Den har stort celleadhesjon potensial, gode mekaniske egenskaper, og det er således et egnet substrat for dyrking av celler EOC for eksponering for fluidstrøm indusert WSS. Bruken av AMer fra menneskelige placentas ble godkjent av etisk komité av Tel Aviv Sourasky Medical Center (# 06/376) og giverne gitt et skriftlig informert samtykke. AM ble installert i spesialdesignede brønner som kan demonteres i sub-enheter for installasjon av dyrkede celler i en teststrøm kammer, og deretter, re-montert for ytterligere inkubasjon eller biologiske tester [16]. EOC-celler dyrket på den ribbet AM avslørte den samme kulturen utseende av en konfluent lag som det faste kultur i plastflasker, som vist i fig. 1. Etter at den kultiverte lag av EOC cellene nådde konfluens på AM (dvs. i løpet av 5 dager), ble brønnen demontert i underenheter for å muliggjøre installasjon av brønnbunnen med de dyrkede celler i strømningskammeret.
(A) I en kolbe plast, 3 dager etter såing. (B) På en fostermembran i spesielle brønner og 4 dager etter såing (50 K-celler per brønn). Fase kontrast lys mikroskop. Forstørrelse:. X10
In vitro Bruk av Wall skjærspenning på dyrkede celler
En spesiell flyt kammeret ble utviklet for direkte anvendelse av strømning indusert WSS på et monolag av dyrkede EOC celler . Kammeret var en 17 cm lang rektangulær ledning med et tverrsnitt på 28 mm x 1 mm er forbundet med en pumpe i et lukket kretsløp (fig. 2a). Strømningskammeret er utformet for å holde brønn 3 bunner med dyrkede celler for å redusere lengden av et enkelt eksperiment og for å ha flere biologiske prøver for statistisk analyse med et par repetisjoner. Pumpen kan generere stabile strømningshastigheter opp til et maksimum på 2,52 l /min (ColeParmer, EW-07012-20) med et ensartet felt av skjærkrefter på cellenes overflate. Den vekstmedium av cellene ble anvendt som væske i systemet. Dens dynamisk viskositet ble antatt lik som vann,
μ
= 0,0007 N⋅s /m
2. Plassen under brønn bunner inne i strømningskammeret ble fylt med statisk kulturmedium som var i kontakt med den nedre planet til AM i brønnen bunnet gjennom eksperimentene. Forsøkene ble utført i inkubator ved miljøforhold på 5% CO2 og 37 ° C (Fig.2b).
Strømningskammeret kan holde 3 godt bunner. (B) Tegning av komponentene i strømnings-kammeret og brønnen bunner.
Forsøksprotokoll
Størrelsen av WSS i bukhulen blir vurdert som svært lav, men ukjent. Nye beregnings simuleringer av mage-tarm-modeller spådde WSS verdier i størrelsesorden 0,14 dyn /cm
2-11 dyn /cm
2 [16]. Derfor søkte vi på de dyrkede EOC cellene jevn uniform WSS på 0,5 dyn /cm
2, 1,0 dyn /cm
2 og 1,5 dyn /cm
2 for varighet på 30 minutter. Vi antok feltet av WSS å skyldes laminær strømning hvor Reynoldstallet 2000, og følgelig beregnet strømningsrate i den lukkede krets ved hjelp av en metode som er beskrevet for [17]
En tilsvarende mengde. 50.000 EOC-celler per brønn, ble dyrket på AM i alle kulturer brukt i denne studien. Alle forsøkene ble utført med godt differensierte EOC-celler som er blitt dyrket i 2-5 dager. Kontrollkulturer for hvert av forsøkene ble sådd ut og inkubert på lignende måte som stresset kulturer, og disse ble definert som kulturer under statiske betingelser, mens alle andre betingelser forblir de samme. Hvert eksperiment ble gjentatt 3 ganger med 3 godt bunner med dyrkede EOC celler for statistisk analyse.
Farging av cytoskjelettet Fibers
Immunohistokjemiske fluorescerende flekker av β-tubulin og F-aktin ble utført i rekkefølge for å identifisere morfologiske og strukturelle endringer i cytoskjelettet av cellene. Fiksering av cellene ble utført ved inkubering av brønn bunner med cellene i en 4% paraformaldehydløsning i 10 minutter ved romtemperatur (RT) etter fjerning av mediet. Deretter ble cellemembran perforering utført ved å inkubere cellene i esel blokk, en fortynning 5% av eselserum (Jackson Immunoresearch, Suffolk, UK) i PBST (PBS med 0,05% Tween 20), i 4-5 timer på en vippe ( 60 rpm) ved romtemperatur.
p-tubulin fibre ble farget ved å inkubere cellene i et 1:500 fortynning av muse-monoklonalt anti-β-tubulin primære antistoff, klon 2,1 (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) i esel blokk, i 1 time på et vippe (60 rpm) ved romtemperatur, og deretter inkubering over natten ved 4 ° c. Følgende morgen, ble cellene vasket 3 ganger i 45 minutter med fortynningsmiddel blokk (en 01:03 fortynning av esel blokk: PBST) og ble inkubert med det sekundære antistoff – esel Rhodamine anti-mus sekundære antistoff (Jackson Immunoresearch, Suffolk, Storbritannia ) – til en 1:400 fortynning i fortynningsmiddel blokk. Cellene ble inkubert med det sekundære antistoff i 4 timer, på et rocker ved romtemperatur, og deretter vasket igjen 3 ganger i 45 minutter med fortynningsmiddel blokken. Actin spennings fibre ble farget etter inkubasjon i 1:1000 fortynning av FITC-merket Phalloidin (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) i PBS i 20 minutter på en vippe ved romtemperatur og deretter vasket to ganger med PBS.
etter at flekkene var fullført, ble membranene fjernet og plassert på mikroskopobjektglass. Dekkglass ble montert på glassplater ved hjelp av en eneste dråpe DAPI + montering gel (Santa Cruz Biotechnology, Inc via Enco, Petah-Tikva, Israel) som også farget cellekjernen. Cellene ble undersøkt under et Leica SP5 og Zeiss 410 confocal mikroskoper som bruker en X40 forstørrelses vann objektiv.
Analyse av cytoskjelettet strukturelle forandringer
Observasjon av confocal bilder etter utsette EOC kulturer til WSS avslørt celle forlengelse fra kantet og avrundet til ellipsoidiske. I likhet med andre studier [13], karakterisert v e d at det er ellipsoidal form av sideforholdet som definerer rasjon mellom de lange og korte diameter på en ellipse. Bruke bildebehandlingsprogrammer på confocal mikroskoper vi målte disse diameter som var vertikal til hverandre på cellene bilder (Fig. 3). Aspektforholdet ble beregnet for beregning av nivået av celleforlengelse med 1,0 representerer en sirkel.
Estimering av mikrotubuler og stress fibre dannelse ble gjort ved observasjon. Tre nivåer av stress fibre eller mikrotubuli dannelsen ble definert, i henhold til deres opptreden i de oppkjøpte bilder (fig 4.): «Low Level» indikerer at aktin eller β-tubulin ble farget fremtredende på kortikale ring av cellen og nesten ingenting i cellen sentrum (fig. 4AA, 4BA). «Middels nivå» indikerer at det meste fremspring, microspikes og fragmenter av actin- eller β-tubulin var synlig (fig. 4AB, 4BB). «High Level» indikerer at mesteparten av cellens sentrale området inneholdt spennings fibre eller mikrotubuler, med nesten ingen fiberfragmenter og lite flekker i de perifere områder av cellen (fig. 4Ac, 4bc).
(a) lavt nivå, for det meste kortikal aktin og nesten ingen spenningsfibre, (b) Mellomprodukt nivå, er noen fibre som dannes, for det meste i cellefremspring, og (c) Høy grad, de fleste av cellens midtområde er rikelig med spennings fibre. (B) Tre forskjellige nivåer av mikrotubuli dannelse: (a) Lav-nivå, for det meste β-tubulin-fragmenter og nesten ingen cytoplasmiske mikrotubuli, (b) Mellomprodukt nivå, ble enkelte mikrotubuli som dannes inne i cellen, og (c) på høyt nivå, en tett nettverk av mikrotubuli ble generert inne i cellene.
Statistical Analysis
en vei og toveis variansanalyse (ANOVA, SPSS 11.5.1) etterfulgt av en Tukey test var brukes til å utføre multiple sammenligninger mellom de resultater som ble oppnådd etter eksponering av EOC-cellene til forskjellige skjærspenninger. For resultatene av stress fibre og mikrotubuli dannelsen ble utført en chi-kvadrat test og betydningen av en lineær-by-lineær sammenheng ble testet.
Resultater
Denne studien viste de morfologiske endringene av de cytoskeletal fibrene i EOC celler dyrket på ribbet AM etter eksponering for fluidstrømning WSS. Confocal bilder viste transformasjon av cellene form fra polygonale og avrundede former til ellipsoidiske figurer etter 30 min eksponering for WSS (Fig. 5A). Den lange og korte diameter på 541 celler (dvs. 136, 64, 223 og 118 celler for WSS på 0,0 (kontroll), 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm
2, henholdsvis) ble målt og tilhørende sideforhold var beregnet. Det gjennomsnittlige sideforhold er økt med 12,4%, 19,2% og 27,8% sammenlignet med kontrollen i forhold til celler eksponert for WSS på 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm
2, henholdsvis. For statistisk analyse brukte vi logaritmen av disse tallverdier, og dermed gjør for å analysere resultatene med en normalfordeling (Fig. 5B). Aspektforholdet økt betydelig i forhold til kontrollgruppen som WSS økt (p 0,001). En vesentlig forskjell finnes også mellom 0,5 dyn /cm
2 og 1,5 dyn /cm
2 grupper, og mellom 1,0 dyne /cm
2 og 1,5 dyn /cm
2 grupper ( p 0,05). Men det er ingen signifikant forskjell mellom 0,5 dyn /cm
2 og en dyne /cm
2 grupper selv.
Pilene peker mot representerer celler. (A) kontrollkultur, (b) 0,5 dyn /cm
2 kultur, (c) 1,0 dyn /cm
2 kultur, og (d) 1,5 dyn /cm
2 kulturer. (B) Variasjon av den logaritmiske verdi av størrelsesforholdet som definerer nivået av celleforlengelse med nivået av den påførte skjærspenning (± standardavvik).
Dannelse av en tykk trådformet nettverk av spenning fibrene ble observert i celler eksponert mot skjærspenninger, sammenlignet med kontrollkulturer hvori aktin var til stede hovedsakelig i de perifere områder av cellen. Det ble observert dannelse av stress fibre i 640 celler; 235, 78, 142 og 185 celler for WSS fra 0,0 (kontroll), 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm
2, henholdsvis. Representative bilder av aktin flekk i EOC cellekulturer som har vært utsatt for de forskjellige WSS i 30 minutter sammenlignet med statiske kulturer er presentert i fig. 6A. Mer stress Fibrene ble dannet inne i cellene cytoplasma som WSS økte (Fig. 6B). Generelt er prosentandelen av celler som viste et lavt nivå av stress fibre dannelse redusert i forhold til kontrollgruppen som WSS økes (dvs. fra 80% i den statiske gruppen sammenlignet med 28,1% i den 1,5 dyn /cm
2-gruppe) . Prosentandelen av celler med et mellomliggende nivå av stress fibre formasjon økt sammenlignet med kontrollgruppen som WSS økes (dvs. fra 18,3% i den statiske gruppen til 49,2% i den 1,5 dyn /cm
2-gruppe). Prosentandelen av celler med en høy grad av belastning fibre dannelse generelt øker i stressede gruppene sammenlignet med kontrollgruppen (dvs. fra 1,7% i den statiske gruppen til 22,7% i den 1,5 dyn /cm
2-gruppe). Chi-kvadrat-testen viste at lineær-for-lineær krets for disse resultatene var statistisk signifikant (p 0,001), noe som betyr at det var en lineær sammenheng mellom størrelsen av WSS og nivået av stress fibre dannelse og at nivået av stress fibre dannelse var avhengig av størrelsen av skjærspenningen.
(a) kontrollkulturen (uten WSS), (b) cellene eksponert for WSS på 0,5 dyn /cm
2, (c) celler eksponert for WSS av 1,0 dyn /cm
2, og (d) celler eksponert for WSS på 1,5 dyn /cm
2. (B) Den prosentandelen av celler i hvert av tre nivåer av stress-fibre formasjon, for forskjellige nivåer av skjærspenning. (C) Den logaritmisk midlere sideforhold på cellen forlengelse for hvert nivå av stress fibre dannelse (± 2 · standard feil).
Vi har også utforsket forholdet mellom stress fiber dannelse og celle forlengelse. For dette statistisk analyse, på kort og lang diameter på 221 celler (dvs., 110, 13, 62 og 36 celler for WSS fra 0,0 (kontroll), 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm
2, henholdsvis, ble målt og tilhørende sideforhold ble beregnet for hvert nivå av stress fibre formasjon, ignorerer skjærspenningen (fig. 6C). en vesentlig forskjell ble funnet mellom sideforholdet på det lave nivået gruppe av stress fibre dannelse (merket «a») og middels og høyt nivå grupper av stress fiberdannelse (merket «b»), et b (p 0,05). Når det gjelder skjærspenning også, samspillet mellom skjær stress og stress fibre dannelse (i forhold til deres effekt på sideforhold) ble ikke funnet statistisk signifikant (p .. 0,05) Dette resultatet tyder på at virkningen av spennings fibre dannelse på sideforholdene av de langstrakte cellene var uavhengig av graden av skjærspenning
En tett og organisert nettverk av cytoskeletal mikrotubuli ble generert etter eksponering av cellene mot skjærspenninger, sammenlignet med tubulin-fragmenter og lateral farging i kontrollkulturer. Vi observerte dannelsen av mikrotubuli i 494 celler; 156, 33, 111 og 194 celler for WSS fra 0,0 (kontroll), 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm
2, henholdsvis. Representative bilder av mikrotubuli flekk i EOC cellekulturer som har vært utsatt for de forskjellige WSS i 30 minutter i forhold til statiske kulturer er vist i fig. 7A. Det er tydelig at flere mikrotubuli ble dannet i cytoplasmaet til celler som WSS økes (fig. 7B). Generelt er prosentandelen av celler som viste et lavt nivå av mikrotubuli dannelse redusert i forhold til kontrollgruppen som WSS økes (dvs. fra 84% i statiske kulturer til 20,6% i den 1,5 dyn /cm
2-gruppe). Det var ingen konsistent oppførsel for det mellomliggende nivå, som prosentandelen av celler som viser et mellomliggende nivå av mikrotubuli formasjon innledningsvis øker mellom den statiske og 0,5 dyn /cm
2 grupper (dvs. 16% og 63,6%, henholdsvis), og ble deretter svakt redusert i 1,0 og 1,5 dyn /cm
2 grupper (dvs. 55% og 54,6%, henholdsvis). Prosentandelen av celler som viste et høyt nivå av mikrotubuli dannelse økte fra 0% i den statiske og 0,5 dyn /cm
2 grupper på nesten 10% i 1,0 dyn /cm
2-gruppe og over 24% i 1.5 dyn /cm
2 gruppe. Chi-kvadrat-test fastslått at lineær-for-lineær krets for disse resultatene er statistisk signifikante (p 0,001), noe som betyr at en lineær sammenheng mellom størrelsen av skjærspenning og nivået av mikrotubuli dannelse og at nivået av mikrotubuli dannelse er avhengig av størrelsen av skjærspenningen.
(a) kontrollkulturen (uten WSS), (b) cellene eksponert for WSS på 0,5 dyn /cm
2, (c) celler eksponert for WSS av 1,0 dyn /cm
2, og (d) celler eksponert for WSS på 1,5 dyn /cm
2. (B) prosentandelen av celler i hvert av tre nivåer av mikrotubuli formasjon, for forskjellige nivåer av skjærspenning. (C) Den logaritmisk midlere sideforhold på cellen forlengelse for hvert nivå av mikrotubuli dannelse (± 2 · standard feil).
Forbindelsen mellom mikrotubuli dannelse og celleforlengelse ble også evaluert. For denne analyse, på kort og lang diameter på 191 celler (det vil si, 82, 8, 58 og 43 celler for WSS fra 0,0 (kontroll), 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm
2, henholdsvis, ble målt og deres tilsvarende sideforhold ble beregnet for hvert nivå av mikrotubuli formasjon, ignorerer den skjærspenning (fig. 7C). en signifikant forskjell ble funnet mellom de sideforholdene lavt nivå gruppen av mikrotubuli formasjonen (betegnet «a») og den mellomliggende og høy level grupper av mikrotubuli dannelsen (merket «B»), et b (p 0,05). Når det gjelder skjærspenning også, samspillet mellom skjærspenning og mikrotubuli dannelse (i forhold til deres effekt på sideforhold) ble funnet statistisk signifikant (p 0,05). Implikasjonen var at effekten av mikrotubuli formasjon på sideforholdene til de langstrakte celler avhengig av nivået av skjærspenning
Diskusjoner
Eggstokkreft er den. vanligste dødsårsaken blant gynekologiske kreftformer og er vanligvis diagnostisert på et avansert stadium [18]. Overflate EOC cellene eksponeres for peritoneal fluidtrykk og skjærkrefter på grunn av den peristaltiske bevegelser av mage- tarmsystemet, noe som skaper en mekanisk mikromiljø for cellene [2], [19]. Mekaniske stimuli som WSS er blitt vist å påvirke mange cellulære prosesser i ulike celletyper [3]. Dette arbeidet undersøkte effekten av WSS på cytoskeletal ombygging av dyrkede EOC celler. For dette formålet har vi utviklet en ny modell for EOC dyrket på den ribbet AM, som er en lett tilgjengelig collagenous membran og nærmere simulerer
in vivo
forhold der cellene vokser på ikke-stive underlag. Cellene dyrket i denne studien vokste som et monolag med den typiske brostein-lignende utseende som ligner på kulturene i plastflasker i andre studier [20].
Resultatene av denne studien viste at fluidstrømningsinduserte WSS stimulert celleforlengelse, stress fibre dannelse og generering av mikrotubuli i EOC-celler. Størrelsesforholdene celler eksponert for 1,5 dyn /cm
2 økt betydelig sammenlignet med den til 0,5 dyn /cm
2 og 1,0 dyn /cm
2 grupper. Forlengelse og innretting av dyrkede celler i strømningsretningen er vanlige effekter av skjærbelastning og er blitt mye studert i endotelceller [21], [22], [23]. For tiden er imidlertid ble det ikke observert noen celle innretting i retning av strømningen. Dette kan være et resultat av den relativt korte tid av cellene eksponert for WSS. Mens celler i denne studien ble utsatt for WSS i 30 minutter, ble celle innretting i forhold til en bestemt retning demonstrert i andre typer celler bare etter 24 timers eksponering for WSS [21], [22], [23], [ ,,,0],24]. Det skal bemerkes at forlengelsen av cellene ble rapportert å forekomme etter mye kortere eksponeringstid mot skjærspenninger [13], [23]. Det ovennevnte formendring reaksjon av endoteliale celler til WSS (dvs. forlengelse og orientering i strømningsretningen) ble antatt celle-spesifikk, siden det ikke ble observert i glatte muskelceller og nasale epitelceller [25], [26], [27 ]. Foreliggende Utfallet kan også være relatert til elastisiteten av foster mambrene på hvilken EOC-celler ble dyrket. Det har tidligere blitt rapportert at cellenes respons, inkludert cytoskeletal remodellering, avhengig av stivheten og elastisiteten til deres substrater [28].
En interessant fordeling av aktin flekken ble observert under eksponering for WSS. Statiske kulturer viste tette perifere band av aktin mens sentrale spennings fibrene var knappe. Men i celler eksponert for WSS en trådnett av aktin ble dannet inne i cellen som ble lineært relatert til størrelsen av skjærspenning. Disse resultatene antyder at skjærspenning påvirker aktin cytoskjelettet av EOC celler. Stress fibre formasjonen påvirker også den sideforhold, imidlertid, er denne effekten ikke er avhengig av graden av skjærspenning. Tilsvarende endringer i celleform og strukturelt ble også observert i
dyrkede
endotelceller, noe som syntes mangekantet med et par spennings fibrene under statiske betingelser, mens celler eksponert for WSS er utviklet en rekke spennings fibre og på et senere stadium også langstrakte [24], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. En tilsvarende utfallet av WSS indusert aktin-tubulin ombygging ble også observert i metastatiske esophageal kreftceller [11]. På den annen side, colon carcinoma celler utsettes for skjærspenning på 2,4 dyn /cm
2 i 45 minutter viste nedsatt dannelse av aktin spenning uten forlengelse langs strømningsretningen [35].
Den foreliggende studien demonstrerte dannelsen av cytoplasmiske mikrotubuli i stressede celler, med generering av en sentral, trådformet nettverk av mikrotubuli sammenlignet med statiske celler i hvilke fragmenter av mikrotubuli lokaliserte hovedsakelig perifert. Mikrotubuli dannelsen påvirker sideforholdene til de stresset cellene og denne effekten avhenger av graden av WSS. Et lignende resultat av tettere og mer stabiliserte mikrotubuli i cellens cytoplasma og rundt cellekjernen ble også observert i endotel-celler eksponert for en jevn WSS på 15-20 dyn /cm
2 i 24 timer fremviste [22], [36] [37]. Det er bemerkelsesverdig at jevn WSS påført på nese epitelceller indusert mikrotubuli fragmentering, mens oscillerende WSS resulterte i en mer organisert og filamentøse mikrotubuli nettverk i cytoplasma, inklusive generering av nye mikrotubuli [17], [25]. I en annen studie metastatiske esophageal kreftceller som ble eksponert for venøs skjærhastighet på 200 i 30 minutter viste hurtig polymerisering og trans-plassering av tubulin til den fremre kant av cellen i motsetning til kortikal ring lokalisering under statiske betingelser [12].
Integrering resultatene fra denne undersøkelsen vedrørende cytoskeletal modifikasjoner innebærer at eksponering av EOC celler til WSS kan indusere celle bevegelse. Det første trinn i celle motilitet oppstår når cellen strekker seg fremspring som filopodia og lamellipodia i retning av dens bevegelse ved hjelp av aktin polymerisering ved den fremre kant. Mange av cellene i den foreliggende studien viste dannelsen av actin fremspring, særlig i celler hvor det ble observert et mellomliggende nivå av stress fibre formasjonen (for eksempel i fig. 6A og 6C). Siden spennings fibre er viktig for den kontraktile aktivitet av en bevegelig celle, kan produksjonen av mer stress fibre av cellene indikere at cellen ble trukket frem som en del av motilitet prosessen. Stress fibrene kan også ha en viktig rolle i celle adhesjon til ekstracellulær matriks gjennom integriner som danner knutepunkter sammenvoksninger i løpet av celle bevegelse. Mikrotubuli og aktin-microtubule interaksjoner kan også ha viktige roller i cellemotilitet [38]. Celler behandlet med mikrotubuli depolymerisering agenter mister polarisert utseende og gjøre fremspring samtidig over hele omkretsen. En intakt mikrotubuli-cytoskjelettet var nødvendig for å opprettholde den polariserte fordeling av actin-avhengige fremspring på den fremre kant av en migrerende fibroblast [39].
Kreftceller dyrket i tre-dimensjonale matriser har vist langstrakte og avrundet morfologi som et resultat av mesenchymale og amoeboid vandringer, henholdsvis. I den foreliggende undersøkelse, det midlere sideforhold på langstrakte cellene viser et lavt nivå av stress fibre dannelse var vesentlig mindre enn den for celler som viser middels og høye nivåer av stress fibre formasjonen. Disse resultatene kan tyde på at EOC cellene bruker en mesenchymale modus av cellemigrering som et resultat av eksponering for WSS, og blir derfor forlenget. Langstrakte cellene har utstående membran ved forkanten og danner integrin-avhengig adhesjon med substratet [40]. I tillegg inhibering av aktin, og tubulin polymerisasjon undertrykker kreftcellemigrering, som støtter det faktum at polymeriseringen av aktin, og tubulin er avgjørende for celle motilitet [41]. Men en fersk studie viste at interferens med aktin dynamikk er mer effektive i å hemme menneskelig eggstokkreft cellemotilitet enn forstyrrelse av microtubule funksjon [42]. Dette bevis støtter vår antagelse om at WSS indusere cellemotilitet i EOC celler. Denne effekten av WSS kan ha en viktig kobling til prosessene i sheading og metastatisk spredning av epitelial eggstokkreft. Kreftbehandling rettet mot mikrotubuli og aktin filament Polymerisasjon dynamikk kan være en nyttig måte å hemme cellekinetikk og den resulterende peritoneal metastatisk spredning.
I konklusjonen, gir denne undersøkelsen for første gang data på cytoskjelett endringer i EOC celler utsettes for fluidstrøm indusert WSS, noe som er ventet i bukhulen. Cytoskjelettet respons på WSS var klar og signifikant, særlig ved høyere størrelsene av WSS, og inkludert celleforlengelse, stress fibre dannelse og generering av mikrotubuli som er essensielle cellulære komponenter for cellebevegelse. Disse resultatene tyder på at den mekaniske miljøet i EOC ha en viktig rolle i spredning og spredning, og bør også vurderes for å utvikle terapeutiske verktøy for å forebygge kreft i eggstokkene peritoneal metastasering.
