PLoS ONE: Gener påvirket av ikke-Muscle isoformen av myosinlettkjedefosfatase Kinase Impact Menneskelig Cancer Prognosis

Abstract

Den multifunksjonelle ikke-muskel isoform av myosin lett kjede kinase (nmMLCK) er kritisk til den raske dynamisk koordinering av cytoskjelettet som er involvert i cancer celleproliferasjon og migrasjon. Vi identifiserte 45 nmMLCK-påvirket gener ved bioinformatiske filtrering av genom-wide uttrykk i villtype og nmMLCK knockout (KO) mus eksponert for prekliniske modeller for murine akutt inflammatorisk lungeskade, patologi som er godt etablert for å inkludere nmMLCK som en viktig deltaker. For å avgjøre hvorvidt disse nmMLCK-påvirket genene var relevante for kreft hos mennesker, ble 45 mus gener matchet til 38 forskjellige menneskelige ortologer (M38 signatur) (GeneCards HD) og gjennomgikk Kaplan-Meier overlevelsesanalyse i trening og validerings kohorter. Disse studiene viste at i treningsgruppene var M38 signatur vellykket identifisert kreftpasienter med dårlig total overlevelse ved brystkreft (

0,001), tykktarmskreft (

0,001), glioma (

0,001), og lungekreft (

0,001). I validerings kohorter, demonstrerte M38 signatur betydelig redusert total overlevelse for high-score pasienter med brystkreft (

= 0,002), tykktarmskreft (

= 0,035), gliom (

= 0,023), og lungekreft (

= 0,023). Sammenhengen mellom M38 risikoscore og total overlevelse ble bekreftet av univariate Cox proporsjonal fareanalyse av total overlevelse i både trening og validerings kohorter. Denne studien, som gir en roman prognostisk kreft genet signaturen stammer fra en murine modell av nmMLCK-assosiert lungebetennelse, støtter sterkt nmMLCK-involvert trasé i tumorvekst og progresjon i menneskelige kreft og nmMLCK som en attraktiv kandidat molekylære mål i både inflammatoriske og neoplastiske prosesser .

Citation: Zhou T, Wang T, Garcia JGN (2014) Gener påvirket av ikke-Muscle isoformen av myosinlettkjedefosfatase Kinase Impact Menneskelig Cancer Prognoser. PLoS ONE 9 (4): e94325. doi: 10,1371 /journal.pone.0094325

Redaktør: Patrick A. Singleton, University of Chicago, Department of Medicine, USA

mottatt: 11 februar 2014; Godkjent: 14 mars 2014; Publisert: 08.04.2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants HL91899 og HL58064 (JGNG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Cancer celleproliferasjon og migrasjon krever rask dynamisk regulering av cytoskjelettet, som styres av rekke av cytoskjelett regulatoriske proteiner, hvori myosin lettkjede-kinase (MLCK) er en kritisk deltaker [1], [2]. I tillegg er endotelcelle paracellulære ekstravasasjon og diapedese av tumorceller et viktig skritt for ondartet tumormetastase og betydelig påvirket aktiviteten av MLCK [3], [4]. Selv om det fortsatt er undervurdert, begynte MLCK å bli betraktet som en ny funksjonelt protein i kreft patogenesen (initiering, proliferasjon, migrering og metastase) [5], [6], [7]. Dette gjelder spesielt med den mer allment uttrykt ikke-muskel isoform (nmMLCK). Ikke-muskel myosin lettkjede-kinase eller nmMLCK er sentralt involvert i å drive omleiring av cytoskjelettet som regulerer vaskulær endotelial barrierefunksjon, angiogenese, endotelial celle apoptose, og leukocyttisk diapedese [8].

In vivo-studier

implisert nmMLCK som et attraktivt mål for lindring de negative virkningene av dysregulerte lungeinflammasjon, inklusive ekstravasasjon av inflammatoriske leukocytter [9], [10], i likhet med fremgangsmåten i kreftcellen metastase til lungevev [ ,,,0],11]. Sletting eller stanse av nmMLCK produsert bedre beskyttelse mot akutt lungeskade (ALI) og ventilator-indusert lungeskade (Vili) og betydelig redusert alveolar og vaskulær permeabilitet og lungebetennelse [9].

Nylig rapporterte vi at endothelial betennelse er en viktig formidler av tumorvekst og progresjon [12], understøttes av det faktum at en molekylær signatur reflekterende av endotel-inflammatoriske genekspresjon er prediktive for klinisk resultat i mange typer av kreft hos mennesker [12]. Som nmMLCK spiller en sentral rolle i regulering av endothelial cytoskjelettet og endothelial betennelse, ville vi hypotese at nmMLCK relatert cellulære signal delta aktivt i tumorprogresjon og metastasering, selv om lite er kjent om effekten av nmMLCK på patogenesen av svulsten og dens innflytelse på prognosen av kreft hos mennesker.

i denne studien, vi ønsker å bruke nmMLCK-forbundet genet nettverk (nmMLCK-deregulert gensettene) for å etablere en ny metodikk for humane kreftprognoser, ved hjelp av en databiologi tilnærming.

formålet med denne studien er todelt. Den første var å identifisere genene potensielt regulert av nmMLCK. Den andre var å utvikle en prognostiske kreft gen signaturen utledet fra nmMLCK-assosierte gener. Ved hjelp av en eksperimentell murine modell av lungeskade indusert av mekanisk ventilasjon med økt tidevolum (den Vili modell), karakterisert vi de beste differensielt uttrykte gener mellom Vili utfordret villtype (WT) mus og nmMLCK knockout (KO) mus. Muse genene mediert av nmMLCK ekspresjon ble identifisert. Vi matchet nmMLCK-medierte muse gener til sine menneskelige ortologer, som dannet grunnlaget for en multivariat molekylær prediktor for total overlevelse i flere humane kreftformer, blant annet lungekreft, brystkreft, tykktarmskreft, og glioma. Dette molekylær signatur spådd utfallet uavhengig av, men samarbeide med, standard kliniske og patologiske prognostiske faktorer, inkludert pasientens alder, spredning til lymfeknuter, tumorstørrelse, svulst klasse, og så videre.

Materialer og metoder

Gene uttrykk data

Microarray data på lunge RNA fra WT kontroll, Vili utsatte WT, og Vili eksponerte nmMLCK KO mus ble hentet fra NCBI GEO database (GSE14525) [9]. Vi brukte dette datasettet til å filtrere ut nmMLCK-mediert muse gener.

genuttrykk datasett som representerer kreft hos mennesker ble lastet ned fra offentlig tilgjengelige repositories. Disse datasettene ble valgt basert på tilgjengeligheten av kliniske overlevelsesdata og den store størrelsen på prøvene. For hver tumor type, ble trening og validerings kohorter konstruert. Datasettet for brystkreft (n = 295) var tilgjengelig fra https://bioinformatics.nki.nl/data.php (Nederland Cancer Institute, Computational Cancer Biology data Repository) [13]. De brystkreftpasienter ble tilfeldig delt inn i to deler (1/2 for trening og 1/2 for validering). For tykktarmskreft, lastet vi to datasett fra en enkelt studie [14]. En datasettet ble brukt som trening kohort (n = 177; GSE17536) og den andre ble brukt til validering (n = 55; GSE17537). For glioma, ble forskjellige datasett fra to forskjellige studier oppnådd for opplæring (n = 77; GSE4271) [15] og validering (n = 50; https://www.broadinstitute.org/cgi-bin/ca?ncer/datasets. cgi) [16]. Endelig fikk vi tre datasett (n = 359) for lungekreft som var tilgjengelig fra en enkelt studie [17]. To datasett ble kombinert som trening kohort (n = 161) og den andre ble brukt som validering kohort (n = 178). Cel-filer for studiet er tilgjengelig på https://caarraydb.nci.nih.gov/caarray/publicExperimentDetailAction.do?expId=1015945236141280.

Statistical analyse

SAM (Betydningen Analyse av mikromatriser) [18], implementert i

samr

bibliotek av R Statistiske Package [19], ble brukt til å sammenligne logge

2-forvandlet genet uttrykket nivåer mellom WT kontroll, Vili utsatte WT, og Vili utsatte nmMLCK KO mus. False funnrate (FDR) ble kontrollert ved hjelp av q-verdi metoden [20]. Transkripsjoner med en fold-endring større enn 2 og FDR mindre enn 10% ble ansett uttrykt forskjellig. Vi søkte for noen beriket Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) [21] fysiologiske trasé mellom differensial gener i forhold til den endelige analysen sett med NIH /DAVID [22], [23]. Hierarkisk clustering via komplett kobling regel med Euklidsk avstand metrisk ble brukt til å visualisere genuttrykk forskjeller, ved hjelp av

gplots

bibliotek av R Statistiske Package [19].

For hver kreft trening /validering datasett, vi normalisert genuttrykket nivået i omfanget av [-1, 1] av Poe (sannsynlighet for uttrykk) algoritme [24], [25] implementert i

metaArray

bibliotek av R Statistiske Package [19]. Basert på genekspresjon og kliniske utfall data fra treningsdatasettet, kan vi tildele en Wald statistikk generert av univariate Cox proporsjonal-hazard regresjon til hvert gen som en vekt. En risiko poengsum ble beregnet for hver pasient ved bruk av en lineær kombinasjon av vektede genekspresjon som følger: Her

er risikoen score på pasienten;

er antall differensielt uttrykte gener;

betegner vekten av genet

;

betegner uttrykket nivået av genet

; og

er gjennomsnitt og standardavvik på genuttrykket verdier for genet

tvers av alle prøvene, henholdsvis. Pasientene ble deretter delt inn i high-score og lav poengsum grupper med medianen av risikoen poengsum som terskelverdi. En høy score indikert et dårlig resultat. Vekten av hvert gen ble løst, basert på treningsgruppene, og deretter testet i validerings gruppene [12]. Total overlevelse ble analysert av Kaplan-Meier metoden. Forskjeller i overlevelse ble testet for statistisk signifikans ved log-rank test.

-verdier på mindre enn 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans.

overlevelse

bibliotek av R Statistiske Package [19] ble brukt til å utføre overlevelse analyse på risikoscore.

Resultater

nmMLCK-mediert muse gener

på den angitte signifikansnivået (fold-endring 2 og FDR 10%), 365 gener ble funnet være forskjellig uttrykt mellom Vili eksponerte WT og nmMLCK KO mus, hvorav 117 gener ble oppregulert mens 248 gener var nedregulert i nmMLCK KO mus (Tabell S1). Flere veier var betydelig anriket blant disse differensielt uttrykte gener (

0,05), så som vaskulær glatt muskelkontraksjon, chemokine signalveien, kalsium signalveien, ErbB-signalveien, fokal adhesjon og så videre (figur 1A ).

(A) Beriket trasé blant differensielt uttrykte gener mellom WT Vili eksponerte og Vili eksponert nmMLCK KO mus. Den røde linjen viser cutoff av betydning (

0,05). (B) Beriket trasé blant de 45 nmMLCK-mediert gener. Den røde linjen viser cutoff av betydning (

0,05). (C) Heatmap uttrykk for WT kontroll, WT Vili eksponert, og Vili utsatte nmMLCK KO mus. Red representerer økt genekspresjon; Blå representerer nedregulering.

For å filtrere ut de beste genene potensielt assosiert med nmMLCK, vi også sammenlignet genuttrykket mellom WT kontroll og Vili-eksponerte WT mus. 981 gener ble funnet å bli uttrykt forskjellig (fold-endring 2 og FDR 10%) mellom disse to grupper (Tabell S2). Blant disse genene, beholdt vi genene med motsatt retning av differensial uttrykk sammenligne Tabell S1 og S2. Med andre ord, ble bare de gener med svekkede vili-formidlet gen-ekspresjon i nmMLCK KO mus vurdert her. Dette trinnet ga 53 mus gener. Til slutt, ekskluderte vi genene forskjellig uttrykt mellom WT kontroll og Vili eksponerte nmMLCK KO mus. Totalt beholdt vi 45 mus gener for videre studier. Pathway analyse viser en signifikant kobling av dette genet satt til ErbB signalveien, Glioma, døgnrytme (figur 1B), noe som antyder at nmMLCK signalering bidrar til utvikling og malignitet av svulster. Expression heatmap indikerer at uttrykket profilen av 45 mus gener ble utvunnet på omtrent normale nivåer av uttrykk i nmMLCK KO mus eksponert for Vili (figur 1C). Vi anses disse 45 mus gener som nmMLCK-mediert genet sett (tabell 1).

Prognostic molekylær signatur

nmMLCK er potensielt involvert i patogenesen av kreft [3], [4 ], [26]. For å avgjøre om nmMLCK-mediert gener som stammer fra nmMLCK KO mus modell var relevante for kreft hos mennesker, matchet vi de 45 nmMLCK-medierte muse gener til 38 forskjellige menneskelige ortologer (M38 signatur) i henhold til definisjonen av GeneCards [27], [28] (Tabell 2). Vi antok at M38 signatur ville være forutsigbare for tumorresultat hos kreftpasienter.

Vi konstruerte en risiko scoring system som kombinerte genuttrykk av M38 med risiko for død i treningsdatasettet. Høy resultater pasienter ble definert som de som har en risiko ballen er større enn eller lik gruppen median stillingen. I uavhengige validerings kohorter, testet vi muligheten av risiko score for å stratifisere pasienter inn prognostiske grupper. Vi utførte Kaplan-Meier overlevelsesanalyse sammenligne high-score og lav poengsum grupper og bestemmes statistisk signifikans ved log-rank tester. Som forventet, M38 signaturen var i stand til å identifisere pasienter med dårlig total overlevelse ved brystkreft (

0,001), tykktarmskreft (

0,001), gliom (

0,001), og lungekreft (

0,001) i trenings kohorter (figur S1). I validerings kohortene, Kaplan-Meier overlevelsesanalyse sammenligne pasientgrupper viste en signifikant redusert total overlevelse for high-score pasienter med brystkreft (

= 0,002), tykktarmskreft (

= 0,035), gliom (

= 0,023), og lungekreft (

= 0,023) (figur 2). Sammenhengen mellom M38 risikoscore og total overlevelse ble også bekreftet av univariate Cox proporsjonal fareanalyse av total overlevelse i både trening og validerings kohorter (Tabell 3). I validerings kohortene, high-score pasienter hadde en økt risiko for død på 3,10 ganger i brystkreft, 2.96-fold i tykktarmskreft, 2.23-fold i glioma, og 1,60 ganger hos lungekreft.

Kaplan-Meier overlevelseskurver for pasientgrupper som er identifisert av M38 risikoscore. Røde kurvene er for høy poengsum pasienter mens blå kurvene er for lav poengsum pasienter. Høy resultater pasienter er definert som slike som har en M38 risiko ballen er større enn eller lik gruppen median stillingen.

-verdier indikerer signifikante forskjeller i total overlevelse målt ved log-rank tester.

Independence of M38 fra andre clinicopathologic faktorer

Vi undersøkte resultatene av M38 signatur i sammenligning med clinicopathologic variabler knyttet til prognose i humane kreftformer. En multivariat Cox analyse av total overlevelse indikerte at M38 status forble en betydelig kovariat i forhold til standard clinicopathologic faktorene i de fire typer av humane kreftformer, så som pasientens alder, lymfeknute status, tumorstørrelse, tumor karakter, og så videre (tabell 4). Vi neste stratifisert pasientene i henhold til de faktorene vesentlige på multivariat analyse.

For brystkreft, ble pasientene stratifisert etter alder, tumor klasse, og østrogen reseptor (ER) status, henholdsvis. For pasienter med alder 40 og ≥40, høy poengsum som hadde en betydelig økt risiko for død av 6,36 ganger (

0,001) og 2,80 ganger (

= 0,001), henholdsvis. For pasienter med tumor grad 2 og ≥2, høy poengsum pasienter hadde en økt risiko for død av 2,63 ganger (

= 0,410) og 2,65 ganger (

0,001), henholdsvis. For pasienter med negativ og positiv ER status, høy poengsum pasientene hadde en betydelig økt risiko for død på 2,25 ganger (

= 0,025) og 4,00 ganger (

0,001), henholdsvis.

For tykktarmskreft, ble pasientene gruppert etter alder og klinisk stadium, henholdsvis. For pasienter med alder 60 og ≥60, høy poengsum som hadde en betydelig økt risiko for død på 2,29 ganger (

= 0,025) og 2,88 ganger (

0,001), henholdsvis. For pasienter med stadium 3og ≥3, høy poengsum som hadde en betydelig økt risiko for død på 3,50 ganger (

= 0,015) og 1,71 ganger (

= 0,024), henholdsvis.

Pasienter med glioma ble gruppert etter alder. For pasienter med alder 45 og ≥45, høy poengsum som hadde en betydelig økt risiko for død av 3,46 ganger (

= 0,004) og 2,00 ganger (

= 0,045), henholdsvis.

lungekreftpasienter ble fordelt etter alder, lymfeknute status og tumorstørrelse, henholdsvis. For pasienter med alder 65 og ≥65, høy poengsum som hadde en betydelig økt risiko for død på 2,35 ganger (

0,001) og 1,97 ganger (

0,001), henholdsvis. For pasienter med og uten spredning til lymfeknuter, høy poengsum pasientene hadde en betydelig økt risiko for død av 1,62 ganger (

= 0,012) og 1,73 ganger (

= 0,014 ), respektivt. For pasienter med tumorstørrelse T3 og ≥T3, høy poengsum pasienter hadde en økt risiko for død på 2,20 ganger (

0,001) og 1,63 ganger (

= 0,180), henholdsvis.

Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste også en betydelig redusert total overlevelse for high-score pasienter i hver undergruppe gruppert etter hvert clinicopathologic faktor (figur S2-S5). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at uttrykket av M38 signatur er assosiert med kliniske resultater og er en uavhengig prognostisk faktor.

Diskusjoner

Denne studien bekrefter en intern kobling mellom nmMLCK-mekle signalering og klinisk kreft dødelighet med ny bevis: først, definert vi en gruppe av nmMLCK drevne gener med en murin modell av lunge inflammatorisk skade under hvilke virkningene av nmMLCK forsterkes. Sekund. Dette nmMLCK-sentralisert molekylær signatur reflekterende av lungebetennelses genuttrykk er svært intelligent av dårlig klinisk utfall i fire typer kreft hos mennesker

MLCK (gen-kode:

Mylk

). Er en Ca

2 + /calmodulin-avhengig kinase som fosforylerer myosin lette kjeder (MLCs) for å fremme myosin samspill med cytoskeletal aktin filamenter [29]. Det spiller en nøkkelrolle i cytoskjelett omorganisering og kontraktile aktiviteter både ikke-muskelvev [30] og glatte muskler [31]. Den ikke-muskelen isoform, nmMLCK, har vist seg å være en viktig deltager i den inflammatoriske respons basert dens evne til å regulere vaskulært endotel integritet og leukocytt-innstrømning fra sirkulasjonen inn i lungen broncoalveolar plass [9]. I likhet med patogenesen i endotelceller i ALI, cancer celleproliferasjon og migrasjon krever rask dynamisk regulering av cytoskjelettet, som er kontrollert av en gruppe av cytoskjelett regulatoriske proteiner, hvori nmMLCK tjener som en viktig og sentral deltaker [1], [2] . I tillegg er trans-cellulær ekstravasasjon det viktig skritt for ondartet tumor metastase, godt kontrollert av aktiviteten av MLCK [3], [4]. Selv om det fortsatt er undervurdert, begynte MLCK å bli betraktet som en ny funksjonelt protein i kreft patogenesen (initiering, proliferasjon, migrering og metastase) [5], [6], [7]. Dette gjelder spesielt med den mer allment uttrykt ikke-muskel isoform (nmMLCK).

Selv om lite er kjent om mekanismene for nmMLCK i patogenesen av svulsten og dens innflytelse på prognosen av kreft hos mennesker, inflammatorisk respons som regulert av nmMLCK i lungene spiller en aktiv rolle i tumorogenesis og mange vellykkede behandlinger rettet mot kronisk betennelse direkte endre endothelial genuttrykk [32]. Murine Vili modell forsterker nmMLCK-mediert genuttrykk og fungerer som en tilfredsstillende plattform for å dissekere nmMLCK molekylær signatur i lungebetennelsesskade.

I forhold til en tidligere studie [12], brukte vi et ikke-konvensjonelle betennelse markør nmMLCK (i forhold til TNF-alfa), som er mer relatert til endotelial betennelse, som nmMLCK er selektivt uttrykt i ikke-muskelvev slik som endotel [29]. Kombinert sammen, disse to studiene bekrefter videre en sentral rolle i «endothelial-spesifikke» betennelse i kreft progresjon. Siden nmMLCK kommer også til uttrykk i andre vevstyper inkludert epitel og inflammatoriske leukocytter (samme som TNFa), forsterket molekylær signatur av nmMLCK av lungebetennelse (M38 signatur) kan også involvere andre typer vev i lungene, dvs. epitel og infiltrert nøytrofile. Potensialet bidrag M38 signatur i patogenesen i disse vev til kreft prognose kan også være viktig.

Vår neste studien vil fokusere på validering av disse kandidatgener filtrert ut i begge nmMLCK og TNFa studier og generere en mer nøyaktig kreft prognose plattform med en raffinert gen sett, noe som vil føre til utvikling av kreft risiko prediksjon /prognose genet array i kliniske studier.

Mylk

er ikke i genet listen M38, selv om 38 gener ble basert på nmMLCK knockout mus. Den mulige kompleks årsak kan være at nmMLCK (210 Kd) er en isotype av

Mylk

genprodukt, mens

Mylk

produserer også smMLCK (108 Kd), som består av 80% av

Mylk

genprodukter i lungene. nmMLCK knockout ikke forstyrrer smMLCK uttrykk, men microarray plattform skiller ikke nmMLCK fra smMLCK. Dette faktum driver vellykket filtrering av de 38 nmMLCK-mediert gener, men

Mylk

var ikke i stand til å overleve i genet listen M38. For å møte effekten av

Mylk

i kreft overlevelse prediksjon, vi re-analysert våre datasett med 39 gener (M38 gener pluss

Mylk

), men ingen åpenbar forbedring ble funnet (tabell S3) . Likevel, flere nyere studier tyder på at nmMLCK uttrykk er faktisk endret i humane kreftformer, som tykktarmskreft [33] og prostata kreft [34].

Vi brukte et poengsystem for å tildele en M38-baserte risikoscore til hver pasienter. Dette poengsystem kan også være direkte brukes til andre publiserte kreft genet signaturer. Sammenligningen mellom kreft gen signaturer kan enkelt utføres ved å sammenligne prognostisk effekt av risiko score til individuelle genetiske signaturer. I denne studien brukte vi medianen av M38 score for å dele patenter i to deler (high-score og lav poengsum pasienter) å gjøre kategorisert analyser (for eksempel Kaplan-Meier analyse og log-rank test). Klinisk, kan vi bruke null som en absolutt cutoff å stratifisere pasienter i høyrisiko og lav-risikogruppene, fordi medianen av M38 poengsum er tilnærmet lik null i hvert datasett.

Denne studien gir den første prognostisk kreft gen signatur avledet fra en murin modell av nmMLCK-assosiert lungeinflammasjon. Aktivering av nmMLCK-involvert veier bidrar til tumorvekst og progresjon i humane kreftformer. Disse funnene støtter forestillingen om at nmMLCK er en attraktiv kandidat molekylære mål i lungesykdommer.

Hjelpemiddel Informasjon

Figur S1.

Bruk av M38 signatur til opplærings datasett som representerer fire kreft hos mennesker. Kaplan-Meier overlevelseskurver for pasientgrupper som er identifisert av M38 risikoscore. Røde kurvene er for høy poengsum pasienter mens blå kurvene er for lav poengsum pasienter. Høy resultater pasienter er definert som slike som har en M38 risiko ballen er større enn eller lik gruppen median stillingen.