Abstract
KRAS
er mutert i ~40% av tykk- og endetarmskreft (CRC), og det er begrenset effektive behandlinger for avanserte
KRAS
mutant CRC. Derfor er det avgjørende at nedstrøms formidlere av onkogene KRAS fortsette å bli undersøkt. Vi identifiserte p190RhoGAP som blir fosforylert i DLD1 CRC cellelinje, som uttrykker en heterozygot
KRAS
G13D allel, og ikke i DKO4 der mutant allel har blitt slettet av somatisk rekombinasjon. Vi fant ut at en allestedsnærværende bindende partner av p190RhoGAP, p120RasGAP (RasGAP), er uttrykt i mye lavere nivåer i DKO4 celler sammenlignet med DLD1, og dette uttrykket er regulert av KRAS. Redning av RasGAP ekspresjon i DKO4 reddet Rho bane aktivering og delvis reddet tumorgenisitet i DKO4 celler, hvilket indikerer at kombinasjonen av mutante KRAS og RasGAP uttrykk er avgjørende for disse fenotyper. Vi konkluderer med at RasGAP er en viktig effektor av mutant KRAS i CRC
Citation. Organ SL, Hai J, Radulovich N, Marshall CB, Leung L, Sasazuki T, et al. (2014) p120RasGAP Er en Mellommann Rho Pathway Aktivering og tumorgenisiteten i DLD1 Colorectal Cancer Cell Line. PLoS ONE 9 (1): e86103. doi: 10,1371 /journal.pone.0086103
Redaktør: Juliet Spencer, University of San Francisco, USA
mottatt: 28 oktober 2013, Godkjent: 05.12.2013; Publisert: 21 januar 2014
Copyright: © 2014 Organ et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes i deler av tilskudd fra den kanadiske Institutes of Health Research MOP-64345 (MST), Cancer Research Society of Canada (MI), og Ontario Ministry of Health og langsiktig omsorg. SLO støttes av CIHR Banting og Best Doktorgrads Award. MI holder Canada Research Chair in Cancer Structural Biology. MST er M. Qasim Choksi Chair i Lung Cancer translasjonell forskning. Den uhn NMR anlegget er støttet av Canada Foundation for innovasjon. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i Nord-Amerika, tykktarmskreft (CRC) er den tredje mest utbredte formen for kreft hos både menn og kvinner. I 2013 er det anslått at over 100.000 nye tilfeller vil bli diagnostisert i USA, noe som resulterer i over 50.000 dødsfall [1]. Selv om frekvensen av død av tykktarmskreft er redusert med 3% i løpet av de siste ti årene [1], metastatisk sykdom, mest fremtredende til leveren, vil utvikle seg i 30% til 40% av CRC pasienter, og 50% vil dø av CRC gjentakelse [2]. Kirurgisk reseksjon er standard for behandling av tidlig stadium CRC, men begrenset effektive behandlinger er tilgjengelig for avanserte pasienter [3]. Utviklingen av CRC innebærer en flertrinnsprosess med opphopning av både genetiske og epigenetiske endringer, herunder endringer i KRAS pathway [4].
KRAS
aktive mutasjoner forekommer hos ca. 40-50% av CRC, med de vanligste mutasjonene blir funnet i kodon 12 (~80%) og kodon 13 (-20%).
, de nyeste godkjente behandlinger for CRC er med målrettet epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), som cetuximab og panitumumab, i kombinasjon med kjemoterapi. Men bare pasienter med villtype
KRAS
utlede signifikant klinisk nytte av denne behandlingen, som de med
KRAS
mutasjoner viser ikke en signifikant overlevelsesgevinst [5]. Derfor er dagens undersøkelser rettet mot å finne frem til nye nedstrøms effektorer av mutant
KRAS
som kan brukes i kombinasjon for å inhibere signalisering fra denne bane.
Aktiviteten av villtype RAS blir nøye kontrollert av familier av GTP-ASE aktive proteiner (hull), som inaktiverer RAS ved å lette hydrolyse av bundet GTP, og GTP utveksle faktorer (GEFs), som letter frigjøringen av BNP, slik at RAS igjen kan binde GTP [6]. Av den store familie av RasGAPs som nå er kjent, er en av de tidligste identifisert og mest omfattende studerte p120RasGAP, eller simpelthen RasGAP, produktet av
RASA1
-genet [7], [8]. Forstyrrelse av
RASA1
genet i mus resulterer i embryonale dødelighet på E10.5, på grunn av avvikende hjerte systemutvikling [9]. Transgene mus embryoer opprettet fra RNAi-mediert
RASA1
knockdown i ES-celler viste at alvorlighetsgraden av vaskulære skader korrelerte med nivået på rest RasGAP uttrykk, og mosaikk embryoer utvikler lokaliserte feil [10]. I samsvar med disse musestudier, mutasjoner i
RASA1
genet har blitt koblet med familiær kapillær malformasjon syndromer som kan presentere et bredt spekter av fenotyper, mest som kjent som en «portvin flekken» [11] , [12], [13], [14], [15]. Nyere proteomikk analyse av disse hudlesjoner viste konsekvent redusert uttrykk for RasGAP i forhold til omkringliggende normalt vev [16]. Dette tyder sammen at
RASA1
spiller en avgjørende rolle i angiogenese og vaskulær utvikling. Imidlertid har selv om protein modulering av RasGAP blitt funnet i flere neoplasmer, inkludert kronisk myelogen leukemi [17], astrocytom [18], trophoblastic tumorer [19], prostatakreft [20], leverkreft [21], og basalcellekarsinom [22 ], protein nivåer har ikke nødvendigvis blitt funnet å være korrelert med RAS-aktivitet eller kreft alvorlighetsgrad [22], [23]. Derfor forblir rolle RasGAP i kreft avklares.
SH2-SH3-SH2 domene konfigurasjonen i den N-terminale regionen RasGAP har lenge foreslått for forskere som RasGAP kan spille en rolle som et signal adapter protein, ved å bidra til, så vel som å være uavhengig av, dets aktivitet GAP [7], [24]. Viktigere, ble disse domenene funnet å binde til tyrosin-fosforylert p190RhoGAP (her referert til som RhoGAP) som reaksjon på oppstrøms kinase-aktivitet og celleadhesjon [25], [26], [27]. Dette funnet ga den første mekanistisk bevis for en sammenheng mellom RAS aktivering og Rho sti signalering. Vår gruppe har nylig funnet ut at RhoGAP blir tyrosin fosforylert nedstrøms c-MET signalering i DLD1 mutant
KRAS
CRC cellelinje [28]. Vi søkte derfor å finne ut hvilken rolle aktive KRAS i RhoGAP-RasGAP interaksjon, og effekten av dette samspillet i CRC tumorceller.
eksperimentelle prosedyrer
Cell kultur
DLD1 (ATCC, Manassas, VA) er en tykktarmskreft cellelinje som er heterozygot for G13D
KRAS
mutasjon. DKO4 celler ble avledet fra DLD1 ved avbrudd av mutant
KRAS
allel ved somatisk rekombinasjon [29]. Begge cellelinjer ble rutinemessig dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles Media (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS).
Modulering av gen-ekspresjon
RASA1 overekspresjon lentiviral-vektoren ble konstruert ved å bruke Gateway rekombinasjon System (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, California). Entry vektor som inneholder enten CMV promoter eller RASA1 ORF (OpenBiosystems, ThermoScientific, Ottawa, ON) ble saman med pLenti-CMV-GFP-MÅL vektor (Addgene plasmid 19732) skape pLentiCMV og pLentiRASA1. HEK293T-celler ble transfektert med disse pLenti vektorer og lentiviral emballasje vektorer som tidligere beskrevet [30]. Virale supernatanter ble oppsamlet, filtrert, og anvendt for å infisere målceller i nærvær av 4 ug /ml polybrene (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 72 timer etter transduksjon, ble cellene sortert for GFP uttrykk. For KRAS mutant overekspresjon, ble retrovirus generert ved trans Phoenix ekotropisk emballasje celler med retroviral vektor pBabepuro inneholder enten villtype KRAS-4B, mutant
KRAS
konstruksjoner, eller tom vektor bruker Fugene 6 transfeksjon reagens (Promega, Madison, WI). Retrovirale supernatanter ble oppsamlet som ovenfor, og cellene ble selektert med 0,5 ug /ml puromycin (ICN Biomedicals, Irvine, CA) til det ikke-transfekterte kontrollceller ble igjen i live.
Immunutfelling og Western blotting
celler ble lysert i en 1% Triton-X-100 buffer (1% Triton X-100, 10% glycerol, 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM natriumpyrofosfat, 100 mM NaF, 10 mM Na
4P
2o
4, 1 mM EDTA, 1 mM natriumortovanadat pluss en komplett mini EDTA-fri proteasehemmer tablett (Roche, Laval, QC), lov til å hvile på is i 10 minutter og deretter fjernet ved sentrifugering ved 14.000 g ved 4 ° C i 30 minutter. protein~~POS=TRUNC konsentrasjonen~~POS=HEADCOMP standardisering ble utført ved anvendelse av Bradford-proteinanalysen reagens (Bio-Rad, Hercules, CA). for immunoutfellinger, ble proteinkonsentrasjonen utjevnet mellom prøvene, og lysater ble kombinert med 2-5 ul av antistoff og tillatt å gynge over natten ved 4 ° C. 30 pl av Protein G PLUS-agarosekuler (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ble kombinert med lysatene og rystet i 1 time ved 4 ° C. Immunoutfelte proteinene ble så vasket 3 ganger med lyseringsbuffer, eluert med 20 ul av 2xSDS prøvebuffer og kokt i 5 minutter. Fullcelle lyates ble normalisert for proteinkonsentrasjon, kombinert med 6xSDS prøvebuffer og kokt i 5 minutter i tillegg. Lysatene ble deretter applisert på en 4-20% gradient SDS polyakrylamid gel (Bio-Rad) og kjørt ved 120 V. Gelene ble overført til PVDF-membraner før den blir blokkert med enten 5% tørr skummet melk i TBST eller 5% BSA i TBST for 1 time ved romtemperatur og deretter probet over natten med passende antistoff. Westernfilmer ble undersøkt med passende sekundært antistoff, reagerte med ECL prime (GE Healthcare, Piscataway, NJ) og utsatt for XRAY film for riktig mengde tid. Antistoffer ble brukt som anvist. RasGAP klone B4F8 og anti-fosfotyrosin klone 4G10 (EMD Millipore, Billerica, MA), p190A-RhoGAP (Cell Signaling, Danvers, MA), GAPDH og KRAS 4B klone F234 (Santa Cruz Biotechnology)
Kvantitativ real-Time PCR
Total RNA (1-2 mikrogram) ble isolert fra cellelinjer og vev ved hjelp av en Qiagen RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og ble reverstranskribert hjelp med Super III revers transkriptase (Invitrogen, Life Technologies, Burlington, ON). En 10 ng ekvivalent av cDNA ble anvendt for hver kvantitativ PCR (qPCR) assay utført med Stratagene Mx3000p Sequence Detection System ved hjelp av SYBR grønn 2 x masterblanding. Primere som brukes er:
GAPDH F – CCCCCACCACACTG, etter
GAPDH R – GCCCCTCCCCTCTTCAAG
RPS13 F – GTTCTGTTCGAAAGCATTG
RPS13 R – AATATCGAGCCAAACGGTGAA
RASA1 F – GGACGAAGGTGACTCTCTGGAT
RASA1 R – GGAGGAGCGGTCAACGGTAT
KRASF – CAGGCTCAGGACTTAGCAAGAAG
KRASR-TGTTTTCGAATTTCTCGAACTAATGTA
Forut PCR produkt sekvenser ble verifisert ved hjelp av BLAST for anerkjennelse av target og ikke-target-sekvenser. Resultatene ble analysert ved hjelp av delta-deltaet Ct metode, normalisering mot gjennomsnittet av to housekeeping gener.
Cell-baserte analyser
Cell telling.
5 × 10
3-celler ble sådd ut i sin helhet serum media, in triplo, i 5 dager for å telle i en 24-brønners plate. Begynnende ved 72 timer etter utplating, er 3 brønner av hver cellelinje trypsinert og telt ved bruk av et Beckman Coulter Z2 celleteller (Beckman-Coulter, Brea, CA).
Celleadhesjon-analyse.
1 x 10
5-celler ble sådd ut på en 24-brønners skål belagt med 0,01% PureCol kollagen (Sigma-Aldrich) i 15 minutter. Brønnene ble farget med 0,2% krystallfiolett og lysert med 0,1% Triton X-100. Lysatet ble lest ved 590 nm på en Tecan XFlour4 plateleser (Mannedorf, Sveits).
Cell motilitet analyse.
7 × 10
4 celler ble sådd ut i 70 mL av full serum~~POS=TRUNC i hver side av en μ-tallerken cellekulturinnsats (Ibidi, Planegg, Tyskland) i en 24-brønners cellekulturplate og tillatt å vokse i 72 timer eller inntil et konfluent monolag ble nådd. Innsatsen ble fjernet og media ble endret for serumfritt DMEM. Fase kontrast ble kjøpt på Zeiss Axio Observer ble brukt til å ta et bilde på 32 x forstørrelse på dette punktet (tid 0) og hver 24. time etterpå. Bildeanalyse ble utført som beskrevet tidligere [31]. Bilde-Pro Plus programvare (MediaCybernetics, Rockville, MD) ble brukt til å analysere sårhelende analyser. Bruke kant og segmentering filtre, områder med store pixel intensitetsvariasjoner (celler) vises lys, mens glatte områder av bildet (sår) virker mørke. Den filtrerte bildet ble deretter omdannet til et binært bilde ved påføring av en piksel terskel og sårområdet ble bestemt ved å telle summen av bildeelementer er tilordnet. Piksel sum ble deretter uttrykt som prosent lukking av sår, hvor null piksler i såret representerer 100% nedleggelse.
immunfluorescens
Glass kammer lysbilder (BD Biosciences, San Jose, CA) ble belagt over natten ved 4 ° C med 0,01% kollagen i PBS. Trypsanised celler ble resuspendert i DMEM + 5% BSA, platet ut på objektglass og tillatt å holde seg over natten. Objektglassene ble deretter vasket en gang med PBS og fiksert med paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur. Celler ble permeabilisert med 0,01% Tween-20 i PBS i 20 minutter, blokkert med 3% BSA i PBS og farget med 1:300 rhodamin phalloidin i 1 time ved romtemperatur. Dekkglass ble påført med Vectashield innehold DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) for nukleær farging. Bildene som presenteres her ble tatt på 43 x forstørrelse med en olje nedsenking linse på en Zeiss LSM 700 konfokalmikroskop.
CRC prøvetaking
Pasient vevsprøver ble innhentet fra uhn hurtigfrosset vev bank etter godkjennelse fra uhn forskningsetikk styret. Alle vev ble hentet innen 30 min av reseksjon og snap-frosset i flytende nitrogen så vel som blir formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE), og kvaliteten har blitt bekreftet av histologi. Vev inkludert 63 primære kolorektal kreft og 30 metastatisk kolorektal kreft. Metastatiske svulster var fra leveren (22 tilfeller) og lunge (8 tilfeller) metastasectomy prøver.
RASA1 mutasjonsanalyse
cDNA ble isolert fra pasient vev cellelinjer som beskrevet ovenfor fra total RNA.
RASA1
cDNA ble først amplifisert med 6 sett av primere for å dekke lengden av genet, og sekvensering ble utført på det amplifiserte DNA med de samme tilsvarende primere, som er som følger:
F1 – CTCAGCCTGGGGAGCTGAAGG
R1 – TGGAGGAGCGGTCAACGGTATG (bp 2-649)
F2 – GGCCTCGGGACAGTGGACGA
R2 – GGGCCTCACAAGAAAACTGCAGAC (bp 563-1252)
F3-AGGTGGGCCGGGAAGAAGATCC
R3-TCCAATCCTCTGCTTGTTCTGGAGT (bp 1131-1823)
F4-TGGCAGGCCAAACTGTTTTCAGA
R4-TGCTGGCCAGTAGTGTTCGGT (bp 1723-2381)
F5-CCGAACACTACTGGCCAGCATCC
R5 – TGACACCTTCCATGTAGGGCTCC (bp 2362-2987)
F6-CGACTCATCTGTCCTGCCATCCT
R6 – CTGGGGCGAAGGCTGCTACC (bp 2825-3277)
For PCR forsterkning, 0,3 ul hver av forover og revers primere (50 pM) ble tilsatt til 6 ul cDNA (20 ng /ul), 12,5 ul av 2x Taq velger DNA polymerase, 0,2 pl 25 mM dNTP og ultrarent vann (Sigma-Aldrich) for å et totalt volum 25 ul for hver reaksjon. Syklusbetingelsene var: 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 39 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 45 «, annealing ved 64 ° C til 45», og forlengelse ved 72 ° C i 1 minutt, en 10 minutters inkubasjon ved 72 ° C etterfulgt av et 4 ° C. 5 ul av PCR-produktet ble kontrollert på en 2% agarosegel. PCR-produktet ble ryddet opp med ExoSAP-IT (Affymatrix, Santa Clara, CA).
For å validere sekvensering i genomisk DNA, ble de samme metodene som brukes som ovenfor, ved hjelp av følgende primere til å forsterke og sekvens ekson 16 :
F – CGCTGCCAGTTGAGCCGATTACA
R – CTCTGGCATCATTGTGCTACTAAGC
real-Time NMR GAP aktivitetsanalyse
Merket GTPase domene av RAS 1-171 ble uttrykt fra pET15b vektorer i
E. coli
i M9 media supplert med
15N ammoniumklorid og renset ved Ni-NTA affinitetskromatografi. Hans-koder ble fjernet ved trombinspaltning og monomere GTPases ble ytterligere renset ved gelfiltreringskromatografi (Superdex 75) [32], [33]. Prøvene ble konsentrert, og om nødvendig byttes inn i NMR-buffer (for eksempel 25 mM HEPES pH 7,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl
2, 1 mM DTT, og 10% D
2o).
for å analysere indre GTP-hydrolyse, ble en GTP-lastet prøve~~POS=HEADCOMP ble fremstilt ved inkubering av RAS-proteinet (~ 10 min ved 37 ° C eller i lengre tid ved værelsestemperatur) i nærvær av 10-ganger molart overskudd GTP og 10 mM EDTA [34 ]. Etter utvekslingen, MgCl
2 ble tilsatt til en endelig konsentrasjon på 20 mM for å stabilisere nylig bundet nukleotid, og prøven ble ført gjennom en gel-filtrering eller avsalting kolonne (PD MidiTrap ™ G-25 (GE Healthcare) ekvilibrert med NMR buffer for å fjerne overskudd av nukleotid og den eluerte prøve ble så raskt konsentrert og hurtigfrosset.
Cellene ble høstet ved skraping i et minimalt volum (150 ul i en 10 cm plate) av lyseringsbuffer som beskrevet for Western blotting, deretter fjernet ved kort sentrifugering (16.000 g i 30 sekunder) og det totale cellulære protein i supernatanten ble analysert ved anvendelse av Bradford-assay reagens (BioRad) for å standardisere mengden av protein anvendt i hver analyse. En konsentrasjon på 10-20 ug /ul totalt protein i lysatet ble oppnådd, og 35 ug i 3,5 ul ble tilsatt til det rensede GTP-bundet RAS-fragmentet.
data~~POS=TRUNC ble deretter satt i gang så hurtig som mulig. halveringstid av reaksjoner ble først beregnet ved visuell inspeksjon av spektra, da, den fraksjon av GDP-bundet GTPase tilstede ved hvert tidspunkt ble bedømt fra flere par av topper og dataene ble tilpasset til en enfaset eksponentiell funksjon for å oppnå de vekslings /hydrolysehastigheter [35].
RAS aktivitetsanalyse
Celler ble serum sultet i 24 timer og deretter analysert med hensyn på aktive RAS ved hjelp av RAS aktivering kit (Millipore) som anvist. I korthet ble cellene lysert i 1 x MLB lyseringsbuffer og like proteinmengder ble blandet med RAS-bindende domene av RAF1 sammensmeltet til glutathione-
S
-transferase og koplet til glutation-sepharosekuler. Etter gynging ved 4 ° C i 1 time, ble kulene vasket i den samme lyseringsbuffer og resuspendert i 2x SDS prøvebuffer. Western blotting fortsatte som beskrevet ovenfor.
Subkutan tumorigenicity analysen
Etikk erklæringen.
Alle manipulasjoner ble gjort for å minimere dyrs lidelser, i henhold til protokoller godkjent av Ontario Cancer Institute (OCI) Animal Care komiteen under bruk dyret protokollnummer AUP 736,9.
Alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus ble avlet på stedet og hentet fra Ontario Cancer Institute (OCI, Toronto, ON). En million celler ble injisert subkutant i den høyre skulder-regionen i 4- til 6-uker gamle hann SCID-mus (n = 5-8 per cellelinje). Når svulster var følbar de ble målt etter 3 dager før humane endepunktet ble nådd, som var enten når svulstene nådde 1,5 cm, eller når de ble sårdannelse til poenget med dyr nød. Tumorvolumet ble målt ved bruk av formelen (lengde x bredde
2) x π /6. Musene ble avlivet ved hjelp av CO
2, som er godkjent av OCI Animal Care Committee, svulster ble skåret ut, og deler var enten hurtigfrosset i flytende nitrogen for DNA og protein isolasjon eller fast i formalin for parafin innebygging og immunhistokjemisk farging. For statistisk analyse, ble en lineær blandede effekter (LME) modell for å innlemme den høye korrelasjonen forekommende blant målinger på samme mus. Alle de tumorvolummålinger ble kvadratroten transformert for å stabilisere variansen, og Wald p-verdi ble brukt for å indikere betydning.
Resultatene
Tap av RasGAP fører til tap av RhoGAP fosforylering
for ytterligere å studere rollen til RhoGAP fosforylering i DLD1 celler, undersøkte vi dets interaksjon med RasGAP, en av sine viktigste bindingspartnere. Samtidig ønsket vi å vite om tap av mutant
KRAS
i DKO4 isogen derivat cellelinje vil ha en effekt på dette samspillet. Vi fant ut at RhoGAP bare kunne fosforyleres i DLD1 celler, ikke i DKO4, mens totale nivåer av RhoGAP forblir uendret. Dette fosforylert RhoGAP co-immunopresipitert med RasGAP (figur 1A). I tillegg har vi funnet at ekspresjon av RasGAP var ikke påvisbar i DKO4 cellelinje (figur 1A). Det har blitt rapportert at RasGAP fosforylering oppstår ofte på nedstrømssiden av reseptor-tyrosinkinase-signalisering [18], [36], [37], [38], [39]. Men vi fant ut at den store tyrosin fosforylert band som vises etter immunoprecipitation av RasGAP var faktisk på ~190 kDa, mest sannsynlig representerer RhoGAP (figur 1A), noe som indikerer at RasGAP seg selv er ikke svært fosforylert i disse cellene.
A) RhoGAP og RasGAP ble immunopresipitert fra DLD1 og DKO4 celler. Immunutfelninger ble utsatt for Western blotting og analysert for total fosfotyrosin, RasGAP og RhoGAP. Western blotting av helcellelysater (A) og rt-QPCR (C) ble anvendt for å bestemme total protein og mRNA-nivåer henholdsvis i disse cellelinjene.
RasGAP uttrykk er tapt i DKO4 celler
Vi fant at mens DKO4 cellelinje som uttrykte liten eller ingen RasGAP protein i forhold til DLD1, mRNA nivåene av
RASA1
gen holdt seg på 50% av modercellelinjen (Figur 1, B C). Vi utførte SNP arrays for å undersøke potensielle kopi nummer endringer mellom disse isogene celle parene. Vi har funnet meget liten forskjell mellom de to cellelinjer (data ikke vist). Et lignende resultat ble nylig funnet i en serie av alternerende kloner (DKO3 og DKO1) avledet fra DLD1 modell [40]. Viktigere, ble det ikke kopitall forskjeller sett i kromosom 5q13.3, viser at nedgangen i mRNA nivå i DKO4 ikke skyldes kromosom tap.
RasGAP mutasjon i CRC
Vi så for mutasjoner som kan forklare forskjellene i RasGAP uttrykk nivå. Vi sekvensert både genomisk DNA og cDNA fra DLD1 og DKO4 celler. Vi har funnet en heterozygot punktmutasjon i det genomiske DNA av begge cellelinjer. Denne C T overgangen er en tull mutasjon, som koder for en R709 * endring (Figur 2, A B), som ligger mellom K2 og RasGAP domener av RasGAP. Når det muterte genet ble oversatt til et avkortet protein, bør en ~77 kDa båndet har vært påvisbare i Western blot ved anvendelse av en RasGAP antistoff som gjenkjenner N-terminale delen av proteinet. Men vi fikk ikke se et band av denne størrelsen i alle celle forhold.
A) kromatogram som viser relative intensiteter av hvert basepar etter Sanger-sekvensering i både genomisk og cDNA avledet fra cellelinjer. B) Illustrasjon av plassering av mutasjonen på RasGAP proteinnivå. C) RASA1 uttrykk data fra alle cellelinjer i Broad Institute Cancer Cell linje Encyclopedia. Stolper representerer middelverdien.
Interessant cDNA-sekvensering i DLD1 og DKO4 cellelinjer viste at DLD1 cellelinjen hadde nesten helt mistet ekspresjon av det muterte genet, som uttrykker bare villtype, mens den DKO4 cellelinjen opprettholdt 50% av hver av de villtype og mutant
RASA1
genprodukt (figur 2A).
Vi så for tilstedeværelsen av C2330T mutasjon i primærtumor og metastaser vev fra CRC pasienter, men var ikke i stand til å identifisere denne mutasjonen i noen av våre prøver. Men vi var i stand til å finne denne mutasjonen i tre cellelinjer fra Broad Institute Cancer Cell linje Encyclopedia (https://www.broadinstitute.org/ccle) [41]: de kolorektal kreft cellelinjer HRT18 og HCT15, samt urinveiene cancercellelinje 639 V. Dette innebærer at selv om mutasjonen er sjelden, er det til stede i visse typer kreft. Denne mutasjonen er heller ikke finnes i den menneskelige SNP database, noe som tyder på at det ikke er funnet i befolkningen for øvrig.
For ytterligere å undersøke vår hypotese om at det muterte
RASA1
transkripsjon er ustabilt og muligens degradert, vi sammenlignet mRNA-ekspresjonsnivåene av
RASA1
i de tre cellelinjer som inneholder C2330T mutasjonen til resten av cancercellelinjer i cellelinjen Encyclopedia. Disse tre cellelinjene uttrykker betydelig mindre
RASA1
enn de fleste andre kreftcellelinjer i databasen (figur 2C). Selv om det ikke er avgjørende, synes dette å indikere at denne avkorting mutasjonen kan resultere i redusert mRNA-genekspresjon.
Disse funnene tyder på flere nivåer for regulering av RasGAP, alt muligens som et resultat av tapet av aktive KRAS i DKO4. Først fullstendig mangel på mutant p120RasGAP mRNA i DLD1 cellelinje som detektert ved sekvensering indikerer at enten den mutante allel ikke blir transkribert til mRNA i denne cellelinjen, eller at den mutante mRNA er meget ustabilt og brytes ned umiddelbart etter blir transkribert. Interessant, selv om den mutante mRNA var tilstede i DKO4 cellelinje, den 50% reduksjon i total
RASA1
mRNA-nivåer som detekteres av sanntids qPCR tyder på at denne mutant mRNA blir også redusert, men muligens ikke så raskt eller så effektivt som i DLD1
i alt viser det seg at tap av aktive KRAS i DKO4 reduserer trykket på cellen for å stabilisere RasGAP uttrykk både på mRNA og proteinnivå.; Men den mekanismen som proteinnivåer RasGAP er regulert i disse cellelinjene i fortsatt ukjent.
Regulering av RasGAP mRNA uttrykk av mutant KRAS
For å klargjøre den rollen som tap av mutant
KRAS
i DKO4 spiller i uttrykket av RasGAP, vi stabilt uttrykt den pBabepuro (PBP) tom vektor, vektor som inneholder full lengde villtype
KRAS
eller vektor som inneholder
KRAS
med punktmutasjoner i kodon 12 (G12V eller G12D) eller kodon 13 (G13D), i DKO4 celler. Vi antok at G13D-mutasjon vil ha den største effekt i å stabilisere og redde RasGAP uttrykk i DKO4, på grunn av denne mutasjon er den som opprinnelig forekom i denne cellelinje. Men etter gjentatte forsøk, har vi bare i stand til å overuttrykker
KRAS
G12V muterte genet i denne cellelinjen (figur 3A). Overekspresjon av G12V ble ledsaget av en generell økning i GTP-KRAS, som forventet (Figur 3C). Interessant, transient transfeksjon av disse konstruerer viste at KRAS var i stand til å bli overuttrykt opp til 7 dager etter transfeksjon med alle mutanter, noe som indikerer at langvarig uttrykk for KRAS konstruerer annet enn G12V ble ikke opprettholdt i DKO4. Overekspresjon av
KRAS
G12V forårsaket en betydelig økning i
RASA1
mRNA; men denne økningen ble ikke sett på proteinnivå (figur 3, B 0,001, * p 0,05
For ytterligere å undersøke hvilken rolle aktive KRAS i RasGAP uttrykk, vi forbigående transfekterte DLD1 celler med 11. separate shRNAs mot
KRAS
. Vi fant en signifikant korrelasjon mellom mengden av
KRAS
knockdown og nedgangen i
RASA1
mRNA uttrykk sammenliknet med ikke-spesifikk shRNA kontroll (figur 3D). Disse endringer ble ikke observert på proteinnivå (figur 3E). For å sikre at KRAS shRNA knockdown gjorde forårsake noen betydelige endringer i ikke-spesifikke gener viser figur S1 A nivåer av to housekeeping gener som ikke er berørt av knockdown. Fig S1B viser Western blot fra hvilken figur 3E ble utledet.
Til sammen tyder disse resultater på at tap av aktive KRAS spilte en rolle delvis i stabiliteten og /eller ekspresjon av
RASA1
mRNA, selv flere mekanismer er til stede som regulerer protein uttrykk i denne cellelinjen.
RasGAP overekspresjon redder RasGAP aktivitet
for å finne ut om noen av fenotyper tilskrives tap av aktive KRAS i DLD1 isogen cellen linjer kunne forklares ved tap av RasGAP proteinekspresjon, overuttrykt vi RasGAP i DKO4 cellelinje (figur 4A). Til tross for vår evne til å få . 100 ganger mRNA overekspresjon av RasGAP i DKO4 cellelinje, de resulterende protein nivåer var lik endogen uttrykk i DLD1 celler (Figur 4D)
A) mRNA uttrykk for RasGAP etter overekspresjon i DKO4 celler sammenlignet med GFP vektor kontroll. B) Real-time NMR analyse av RasGAP aktivitet, viser at frekvensen av GTP hydrolyse (B) og GAP aktivitet over tid (C). Hver kurve i (C) er avledet fra et enkelt representativt forsøk. Feilfelt i (B) betegne standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). D) RAS aktivitetsanalyse som viser nivåer av aktive KRAS etter RasGAP overekspresjon. Tallene representerer densitometry verdier fra denne blot, som er representative for tre biologiske replikater. E) RhoGAP ble immunopresipitert fra cellelinjer, utsatt for Western blotting, deretter analysert for total fosfotyrosin, RasGAP og RhoGAP.
For å finne ut om overekspresjon av RasGAP hadde noen effekt på KRAS aktivitet, en RAS aktivitetsanalyse ble utført ved hjelp av Raf-RBD-knyttet agarose perler til immunpresipitere aktiv KRAS (figur 4D). Som det har blitt vist tidligere [40], KRAS samlet var mindre aktiv i DKO4 cellene sammenlignet med de DLD1 cellene. Vi så en liten, men signifikant reduksjon i KRAS aktivitet i DKO4 celler etter
RasGAP
overekspresjon, noe som indikerer at RasGAP er i stand til å regulere villtype KRAS i DKO4. For ytterligere å klargjøre rollen til RasGAP i disse cellene, anvendte vi en sanntids-NMR basert analyse for å bestemme RasGAP aktivitet. Vi har funnet at nivåene av RasGAP aktivitet var overensstemmende med RasGAP proteinekspresjon (figur 4, B & C). Ekstrakter av DLD1 celler akselerert RAS GTP hydrolyse ~1.8 fold, mens DKO4 ekstrakter, matchet for totalt proteininnhold fremkalte en beskjeden 1,2 ganger hydrolyse renteøkning. Disse resultatene var i samsvar med nærværet av basal-aktivitet fra andre RasGAPs. RasGAP overekspresjon i DKO4 hevet denne frekvensen tilbake til ~1.8 fold.
