Abstract
De fleste nye narkotika godkjenninger for kreft er basert på eksisterende terapeutiske mål. En tilnærming til identifisering av nye mål er å utføre high-throughput RNA interferens (RNAi) cellulær levedyktighet skjermer. Vi beskriver en ny tilnærming som kombinerer RNAi screening i flere cellelinjer med genekspresjon og genomisk profilering for å identifisere nye kreft mål. Vi utførte parallelle RNAi skjermer i flere kreftcellelinjer for å identifisere gener som er avgjørende for levedyktigheten i enkelte cellelinjer, men ikke andre, noe som tyder på at disse genene utgjør sentrale drivere av cellular overlevelse i spesifikke kreftceller. Denne tilnærmingen ble verifisert ved identifisering av
PIK3CA
, stanse av noe som var selektivt hang ikke med på MCF7- cellelinje, som havner et aktiverende onkogen
PIK3CA
mutasjon. Vi har kombinert vår funksjonell RNAi tilnærming med genekspresjon og genomisk analyse, som muliggjør identifikasjon av flere nye kinaser, inkludert
WEE1
, som er essensielle for levedyktighet bare i cellelinjer som har et forhøyet nivå av ekspresjon av dette kinase. Videre har vi identifisert en undergruppe av brystsvulster som sterkt uttrykker WEE1 som tyder på at WEE1 kan være en roman terapeutisk mål i brystkreft. I konklusjonen, representerer denne strategien en roman og effektiv strategi for identifisering av funksjonelt viktige terapeutiske mål i kreft
Citation. Iorns E, Herre CJ, Grigoriadis A, McDonald S, Fenwick K, MacKay A, et al . (2009) Integrert Funksjonell, Gene Expression og Genomisk analyse for identifikasjon av kreft mål. PLoS ONE 4 (4): e5120. doi: 10,1371 /journal.pone.0005120
Redaktør: Toru Ouchi, Northwestern University, USA
mottatt: 12 januar 2009; Godkjent: 06.03.2009; Publisert: 09.04.2009
Copyright: © 2009 Iorns et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Vi takker gjennombrudd Breast Cancer og New Zealand høyere utdanning Commission for å finansiere denne studien. Vi erkjenner også NHS midler til NIHR Biomedical Research Centre. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Sentralt til utforming av nye terapeutiske strategier for kreft er identifisering av gener som er kritisk for overlevelsen av tumorceller, men som i stor grad er overflødig i normale celler [1]. Korrelere molekylære endringer med tumorgenesen har gitt en rute til identifisering av potensielle narkotika mål og gir begrunnelsen bak arbeidet med å karakterisere genetisk variasjon og genuttrykk i svulster. Imidlertid korrelerende naturen av disse data betyr at det ofte ikke er mulig å bestemme hvorvidt observasjonene er forårsakende eller kun en effekt av sykdomstilstanden [2].
RNA interferens (RNAi) er et naturlig forekommende mekanisme som regulerer genuttrykk ved post-transkripsjonsnivået. I pattedyrceller, korte interfererende RNA (sirnas) mediere nedbrytningen av komplementære budbringer RNA (mRNA) transkripter i en sekvensavhengig måte [3]. Denne sekvensen-spesifisitet av RNAi kan benyttes eksperimentelt til taushet spesifikke gener ved transfeksjon av siRNAs i pattedyrceller. Denne teknologien har blitt utvidet til RNAi biblioteker omfatter reagenser som er rettet mot et bredt spekter av vitnemål, slik at rollen av flere gener i celle prosess for å bli vurdert på en saklig måte [4], [5]. RNAi skjermer har blitt brukt for å identifisere gener som er viktige for cancercelle fenotyper, inkludert cellelevedyktighet [6], [7].
Vi viser at RNAi skjermer kan anvendes for å identifisere gener som er differensielt kreves for levedyktigheten av cancer cellelinjer og, som bevis på dette prinsippet, identifisere den kjente onkogen
PIK3CA
som avgjørende for levedyktigheten i MCF7 celler med en aktive
PIK3CA
mutasjon. Vi viser at å kombinere funksjonell RNAi analyse med genekspresjon og genomisk analyse gir en ny strategi for identifisering av sentrale drivere av spesifikke kreftceller, som er potensielle romanen narkotika mål.
Resultater
Parallel RNAi skjermer for å identifisere kinaser viktige for cellenes levedyktighet
å funksjonelt identifisere viktige gener uttrykt i kreftceller, brukte vi en RNAi screening tilnærming. Ved hjelp av en rekke ulike humane kreftcellelinjer og en kort interfering RNA (siRNA) bibliotek targeting 779 kinaser, utførte vi fem parallelle levedyktighet skjermer bruker MCF7- (ER positiv, luminal brystkreft), CAL51 (ER negative, mikro ustabil brystkreft), A549 (lungekreft), NCI-H226 (lungekreft) og HeLa (livmorhalskreft) cellelinjer (Figur 1a og tabell S1). Vi valgte å målrette kinaser som disse proteinene er relativt mottagelig for farmakologisk inhibering og har vist seg å være viktige førere av mange forskjellige kreftformer. I korte trekk ble celler sådd ut i 96-brønners plater og transfektert med siRNA fra biblioteket. Her har vi brukt en SMARTpool bibliotek, hvor hver brønn av 96 godt plate inneholdt en pool av fire forskjellige siRNAs (en SMARTpool) rettet mot ett gen. Etter syv dager kontinuerlig kultur, ble cellelevedyktigheten i hver brønn estimert ved anvendelse av en analyse som måler luminescerende cellulære ATP-nivåer. For å kunne sammenligne tap av levedyktighet effekter i forskjellige cellelinjer, normalisert vi cellenes levedyktighet data fra hver cellelinje til medianen av alle effekter i den cellelinjen som representerer hver SMARTpool virkning som en Z-stillingen [8] hvor Z = 0 representerer ingen effekt på levedyktighet og Z-score mindre enn -3 representert betydelige tap av levedyktighet effekter. Resultatene fra de fem cellelevedyktighet skjermer tilnærmet normalfordelinger, slik at sammenligning av de enkelte siRNA effekter på tvers av cellelinjer (figur 1b).
a. Scatter plott av Z score fra celle levedyktighet skjermer utført parallelt i MCF7-, CAL51, HeLa, A549 og NCI-H226 kreft cellelinjer. Svarte diamanter – individuelle siRNA SMARTpools målretting 779 kinase gener per cellelinje. Z scores≤-3 representerer betydelige tap av levedyktighet effekter. b. Distribusjons plott av Z score fra de parallelle siRNA skjermer. Z scores≤-3 representerer betydelige tap av levedyktighet effekter. c. Kinaser kan klassifiseres på basis av effekten av å stanse på cellelevedyktighet på tvers av alle fem kreftcellelinjer. sirnas som ikke hadde noen signifikant effekt på cellelevedyktighet i en hvilken som helst av cellelinjene undersøkt sannsynlig mål unødvendige kinaser (eller siRNA var ikke funksjonell). sirnas som fører til betydelig tap av cellelevedyktighet i alle cellelinjene undersøkt sannsynlig mål kinaser som er essensielle for levedyktigheten i de fleste tumortyper eller de som er essensielle for levedyktigheten til både normale og tumorceller. sirnas som bare fører til betydelig dødelighet i noen, men ikke alle cellelinjer sannsynlig mål kinaser som kanskje ikke er kritisk for levedyktigheten til alle celler, men representerer tumor-spesifikke effekter. d. Parallelle RNAi skjermer identifisere et kjent onkogen,
PIK3CA
. Celleviabilitet effekter av
PIK3CA
målretting er vist i fem cellelinjer. MCF7 celler ble selektivt følsomme for målretting av
PIK3CA
som demonstrert av en Z score på ≤-3. sirnas som forårsaker betydelig dødelighet i noen, men ikke alle cellelinjer som er egnet til å målrette kinaser som ikke er avgjørende for levedyktigheten av alle celler, men representerer tumorspesifikke effekter. I noen tilfeller kan dette forklares med forekomst av en aktivert onkogen som er tilfellet med MCF7 celler, som rommer en aktive
PIK3CA
mutasjon.
Vi tenkte at sirnas forårsaker betydelig tap av cellelevedyktighet (Z≤-3) i alle cellelinjer analysert sannsynlig representert kinaser som er essensielle for levedyktigheten i de fleste tumortyper eller mer sannsynlig avgjørende for levedyktigheten av både normale og tumorceller. Tilsvarende sirnas som ikke hadde noen signifikant effekt på levedyktigheten i noen av cellelinjene var enten ikke funksjonell eller målrettet ikke-essensielle kinaser. Til slutt, hypotese vi at sirnas som bare forårsaket betydelig dødelighet i noen, men ikke alle, cellelinjer, identifiserte kinaser som representerer tumor-spesifikke effekter potensielt identifisere nye terapeutiske mål (Figur 1c). For å bestemme innholdet av effekten, ble sirnas klassifisert ved å sammenligne Z score mellom cellelinjer (tabell 1).
Identifikasjon av
PIK3CA
gir bevis på prinsipp for tilnærming
Vår innledende analyse indikerte at
PIK3CA
lyddemping var trolig representere en cellelinje bestemt effekt. Stanse av
PIK3CA
var selektivt dødelig for MCF7 celler (Z score på -3,80), men ikke HeLa, CAL51, A549 eller H226 (Figur 1d og tabell 1). MCF7-celler er kjent for å huse en aktive
PIK3CA
mutasjon (E545K) på hvilke disse cellene er avhengige for å overleve [9], [10]. Videre presiseringer og gain-of-funksjon mutasjoner av
PIK3CA
har vært assosiert med kreft i eggstokkene [11], livmorhalskreft [12] og brystkreft [10]. Avhengigheten av MCF7-celler på en
PIK3CA
aktiverende mutasjon, kan være et onkogen avhengighet effekt som kan utnyttes terapeutisk [13]. I tilfelle av genet avhengighet, tumorceller blir fysiologisk avhengig av den fortsatte funksjon av aktiverte onkogener eller overuttrykt som derfor opplagt kandidat terapeutiske mål. For eksempel er effekten av imatinib (Glivec) i behandlingen av leukemier bærer BCR-ABL-fusjons [14] gir en klinisk eksempel på oncogen avhengighet og hvordan det kan utnyttes terapeutisk. Identifiseringen av
PIK3CA
validert vår tilnærming til å identifisere kinaser som er avgjørende for svulst celle overlevelse.
Korrelasjonen av celle levedyktighet med genekspresjon
Selv om celle-spesifikke genet effekter identifisert i RNAi skjermen kan være på grunn av aktiverende mutasjoner, for eksempel i
PIK3CA
, er det sannsynlig at andre kan oppstå på grunn av oppkjøpet av et økt nivå av genuttrykk. For å undersøke dette, utførte vi genom-wide genuttrykk profilering på cellelinje panelet med menneske-6 v2 Illumina BeadChips [15] og sammenlignet dette til RNAi skjermdata (tabell S2). Ekspresjon profilering ble utført in triplo og kinaser med betydelige forskjeller i genekspresjon mellom cellelinjer identifisert ved analyse av varians. For genene hvor minst en siRNA betydelig redusert celleviabilitet (Tabell1), undersøkte vi sammenhengen mellom mobilnettet levedyktighet følgende siRNA transfeksjon og genuttrykk. Denne analysen identifisert fire gener der mobilnettet levedyktighet omvendt korrelerte med genekspresjon;
ADCK2
,
NAGK
,
TLR6 Hotell og
WEE1 plakater (figur 2 og tabell 1). Hver av disse korrelasjoner antydet at forhøyet ekspresjon av genet det er snakk om, kan være avgjørende for tumor overlevelse og kan derfor representere en ny terapeutisk mål.
a-d. Z score fra siRNA-skjermer, er Z scores≤-3 markert med en rød stiplet boks. e-h. Normaliserte uttrykk nivåer beregnet fra Illumina uttrykk profilering. Høy uttrykk korrelert med følsomhet for siRNA, markert med en rød stiplet boks. Feilfelt representerer standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Betydningen av forskjeller i genene ekspresjonen mellom cellelinjer ble undersøkt ved en-veis ANOVA og p verdien som vises for hver cellelinjer. i-l. sammenligning av Z-verdiene med normalisert uttrykk nivåer. Den stiplede linjen representerer Z = -3 terskel for betydelig tap av levedyktighet effekter (p 0,0015). For de fire genene er vist, et forhøyet nivå av ekspresjon er forenlig med tap av levedyktighet etter siRNA transfeksjon. Se tabell 1 for Pearson korrelasjon av Z vs uttrykk.
Toll-like receptor 6, (TLR6) er kjent for å aktivere kjernefysiske faktor kappa-B signalering, en kandidat terapeutisk mål i kreft [16] og aktivering av TLR reaksjonsveien er nylig blitt foreslått å ha en rolle i tumorgenesen [17]. Funksjonen til
ADCK2 plakater (aarF domene som inneholder kinase 2) er mindre godt etablert. NAGK (N-acetylglukosamin-kinase) omdanner endogen N-acetylglukosamin (GlcNAc), en hovedkomponent av komplekse karbohydrater, fra lysosomal degradering eller næringskilder i GlcNAc 6-fosfat, som en del av en katalytisk bergingsveien. Funksjonen til WEE1 er diskutert nedenfor.
Korrelasjon av genekspresjon med genomisk analyse
Vi undersøkte hvorvidt den forholdsvis forhøyet ekspresjon av de fire genene identifisert i vår RNAi skjerm kunne forklares ved endringer i genet kopitall (dvs. kopitall gevinster og /eller genamplifisering). Genkopitallet ble undersøkt ved hjelp av mikromatrisebasert komparativ genomisk hybridisering (aCGH) analyse og overlagt på RNAi og genuttrykk data (figur 3, Figur S1 og S3 tabell). Denne kombinerte analyse viste at i noen cellelinjer, forhøyet ekspresjon av
ADCK2
,
NAGK
eller
WEE1
var assosiert med en økning i genkopitallet, potensielt identifiserer en årsak av forhøyet uttrykk. MCF7 celler var svært sensitive til
ADCK2
siRNA og dette ble gjenspeilet ved oppregulering av transkripsjon og økningen i genkopitallet på
ADCK2
. Likeledes vil en økning i genkopitallet var i overensstemmelse med forhøyet uttrykk og siRNA følsomhet for
NAGK
i A549-celler. Til slutt, sensitiviteten av HeLa-celler for å
WEE1
siRNA var konsistent med oppregulering av dette genet og genomiske forsterkning (figur 3 og figur S1).
spredningsdiagrammer som illustrerer forholdet mellom genkopitallet og genuttrykk. Vertikal stiplede linjer representerer terskelen for kopinummer gevinster (AWS forholdstall 0,12).
Ytterligere karakterisering av WEE1
WEE1 har en veldefinert rolle i cellesyklus sjekkpunkt kontroll, med WEE1 aktivitet begrense pro-mitotiske effekter av CDC2 (aka CDK1) [18]. Følgelig er tap av WEE1 kinase aktivitet og dens ødeleggelse et krav for å komme inn mitose [19], noe som tyder på at WEE1 aktivitet faktisk kan begrense tumorcellevekst. Gitt at våre RNAi data antydet at WEE1 er, i noen sammenhenger, avgjørende for levedyktigheten av kreftceller som overuttrykker det undersøkte vi rollen til denne kinase ytterligere. Vi først bekreftet at WEE1 protein ble overuttrykt i HeLa og CAL51 celler som støtter vår RNA-analyse (figur 4a). For å bekrefte korrelasjonen av følsomhet for siRNA og WEE1 uttrykk, ble WEE1 brakt til taushet av en uavhengig pool av siRNAs utformet for å redusere off-target effekter (Wee1 ONTARGETplus). CAL51 og HeLa cellelinjer var betydelig mer følsomme for lyddemping av WEE1 enn cellelinjer som ikke overuttrykker WEE1 (figur 4b og figur S2). Små molekyler har blitt utviklet for å hemme WEE1 på grunnlag av at inhibering av denne kinasen kan føre til oppheving av G
2 /M sjekkpunkt. Mange kreftceller oppviser en defekt G
en kontrollpost som resulterer i en avhengighet av G
2 /M sjekkpunkt under cellereplikasjon, og som sådan, inhibering av G
2 /M kontrollpunktet kan være dødelig i denne forbindelse [20]. Vi brukte et lite molekyl WEE1 inhibitor (PHCD [21]), for å bekrefte den selektive sensitivitet av CAL51 og HeLa-cellelinjer til WEE1 hemning (figur 4c). Vi undersøkte også flere cellelinjer for WEE1 ekspresjon og sensitivitet til WEE1 målretting med prostata carcinoma cellelinjer PC3 og DU145, og den ikke-tumorigen bryst epitelcellelinje MCF10A. Ingen av disse cellelinjer uttrykte høye nivåer av WEE1 (figur 4a), og, som forventet, var ingen følsom for WEE1 målretting (figur 4b og 4c).
a. Western blot analyse av lysatene fremstilt av HeLa, CAL51, MCF7-, A549, NCI-H226, PC3, DU145 og MCF10A celler. Et antistoff som gjenkjenner WEE1 ble brukt sammen med β-tubulin som en lasting kontroll. WEE1 uttrykk er betydelig økt i HeLa og CAL51 celler i forhold til MCF7-, A549, NCI-H226, PC3, DU145 og MCF10A celler. b. Venstre panel: Celleviabilitet analysen i celler transfektert med WEE1 ONTARGETplus SMARTpool, eller ONTARGETplus siControl. WEE1 lyddemping var selektivt dødelig for WEE1 overekspresjon HeLa og CAL51 celler. Feilfelt representerer SEM fra tredoble trans. Høyre panel: Western blot analyse av lysatene fremstilt fra CAL51 celler transfektert med WEE1 ONTARGETplus SMARTpool eller ONTARGETplus siControl. Et antistoff som gjenkjenner WEE1 ble brukt sammen med β-tubulin som en lasting kontroll. WEE1 ONTARGETplus SMARTpool betydelig redusert WEE1 protein uttrykk i forhold til siControl transfekterte celler. c. Celleviabilitet analyse i celler behandlet med WEE1 inhibitor. WEE1 hemming var selektivt dødelig for WEE1 overekspresjon HeLa og CAL51 celler. Feilfelt representerer SEM fra tredoble cellen behandlinger. d. Panel på venstre side: Western blot-analyse av lysatene fremstilt fra celler behandlet med 5 uM WEE1 inhibitor for 0, 6, 24 og 48 timer. Et antistoff som gjenkjenner PARP ble brukt sammen med β-tubulin som en lasting kontroll. Etter 24 timer WEE1 hemming indusert PARP cleavage (Clvd PARP) i WEE1 overekspresjon HeLa og CAL51 celler, men induserte ikke PARP spalting i MCF7 og NCI-H226-celler som uttrykker WEE1 på normale nivåer. Høyre panel: Caspase 3,7-aktivitet i celler behandlet med 5 uM WEE1 inhibitor i 24 timer. WEE1 hemming indusert caspase 3,7 aktivering i WEE1 overekspresjon HeLa og CAL51 celler, men fremkalte ikke caspase 3,7 aktivering i MCF7 og NCI-H226-celler som uttrykker WEE1 på normale nivåer. Feilfelt representerer SEM fra tredoble cellen behandlinger. e. hånd panel Venstre: Western blot analyse av lysatene fremstilt fra celler transfektert med WEE1 ONTARGETplus SMARTpool eller ONTARGETplus siControl. Et antistoff som gjenkjenner PARP ble brukt sammen med β-tubulin som en lasting kontroll. Stanse av WEE1 indusert PARP spalting i WEE1 overekspresjon HeLa og CAL51 celler, men induserte ikke PARP spalting i MCF7 og NCI-H226-celler som uttrykker WEE1 på normale nivåer. Høyre panel: Caspase 3,7 aktivitet i celler transfektert med WEE1 ONTARGETplus SMARTpool eller ONTARGETplus siControl. Stanse av WEE1 indusert caspase 3,7 aktivering i WEE1 overekspresjon HeLa og CAL51 celler, men fremkalte ikke caspase 3,7 aktivering i MCF7 og NCI-H226-celler som uttrykker WEE1 på normale nivåer. Feilfelt representerer SEM fra tredoble transfections.
Til sammen våre resultater gir holdepunkter for at cellelinjer som viser høyere nivåer av WEE1 uttrykk er følsomme for WEE1 hemming. For å undersøke mekanismen av følsomhet i disse cellelinjene, undersøkte vi nivåer av apoptose følgende WEE1 inhibering. Kjemisk hemming av WEE1 forårsaket apoptose bare i cellelinjer med høyere nivåer av WEE1 uttrykk (figur 4d), en observasjon også bekreftet ved bruk av WEE1 siRNA (figur 4e).
Klinisk betydning av WEE1
Våre data antyder at WEE1 overekspresjon kan være avgjørende for tumorcellelevedyktighet. Derfor forhørte vi uttrykk for WEE1 i offentlig tilgjengelige datasett som detalj uttrykk profiler av humane brysttumorcellelinjer og svulster [22], [23]. Denne analysen viste at WEE1 uttrykk korrelerer med
WEE1
genkopitallet (Spearman p = 0,039) og viser en trend (t-test p = 0,06, Mann-Whitney Test p = 0,07) for høyere uttrykk i cellelinjer med en luminal fenotype (data ikke vist). På grunnlag av disse dataene, undersøkte vi WEE1 uttrykk ved immunhistokjemi (IHC). Ekspresjon av WEE1 vurdert ved IHC på formalinfikserte, parafininnstøpte cellelinje pellets korrelert med ekspresjonen målt ved Western blotting, noe som gir bevis for spesifisiteten til WEE1 antistoff (figur 5a). Vi undersøkte deretter et godt annotert serie av brystsvulster [24], [25], og funnet ut at 35% viste nivåer av WEE1 uttrykk som ligner de til CAL51 celler, som er sensitive for hemning WEE1 (figur 5b). Videre har høye nivåer av WEE1 ekspresjon ble funnet fortrinnsvis i bryst kreft med en luminal fenotype, som definert av Nielsen et al. [26], i samsvar med analysen av brystkreftcellelinjer. I sammenheng med de tidligere data implicating WEE1 som en kreft mål, disse immunhistokjemiske data tyder på at bruk av WEE1 inhibitorer kan være hensiktsmessig i en vesentlig delmengde av brystkreftpasienter.
a. WEE1 immunhistokjemisk farging i formalinfikserte, parafininnstøpte brystkreftcellelinjer og invasiv brystkreft. Legg merke til de lave nivåer av WEE1 uttrykk i H226 celler og en basal-lignende brystkreft og høye nivåer av WEE1 uttrykk i CAL51 celler og luminal og HER2 brystkreft. (Harris haematoxylin /DAB farging, opprinnelig forstørrelse × 200). b. Høye nivåer av WEE1 uttrykk er fortrinnsvis uttrykt i luminal brystkreft. Tilfeller ble bedømt i henhold til den Allred scoring system [36] som beskrevet i materialer og metoder. For hver svulst skriver andelen svulster med høy WEE1 uttrykket vises. Høy WEE1 ekspresjon viste en statistisk signifikant direkte sammenheng med uttrykk av østrogen og progesteronreseptorer og cyklin D1, og en betydelig invers korrelasjon med tumorstørrelse, histologisk karakter og ekspresjon av epidermal vekstfaktor-reseptor (EGFR), cytokeratin (Ck) 14, Ck 5 /6, Ck 17, MIB-en merking indeks og caveolins 1 og 2. Ingen korrelasjoner mellom WEE1 immunhistokjemisk uttrykk og tilstedeværelse av Lympho-vaskulær invasjon, lymfeknutemetastase, HER2 uttrykk eller genamplifisering, p53 uttrykk, og
CCND1
og
MYC
genamplifikasjon ble funnet [24], [37] (data ikke vist). Alle saker ble klassifisert i luminal, HER2 og basal-lignende grupper i henhold til immunhistokjemiske panel beskrevet av Nielsen et al. [26].
Diskusjoner
De fleste nye narkotika godkjenninger for kreftbehandling er basert på eksisterende mål. I stedet for å reflektere et fravær av mål, er dette kanskje indikerer kostnadene og tiden som er involvert i å identifisere nye terapeutiske tilnærminger. Parallell RNAi screening kan tillate en enkel, høy gjennomstrømning, tilnærming til funksjonell identifisering av mål, og andre har også brukt parallell RNAi screening for å identifisere potensielle drivere i tumorgenesen og kandidat mål [27]. Vår identifisering av
PIK3CA
, en kjent onkogen og terapeutisk mål, ved hjelp av parallelle RNAi skjermer gir sterke indisier for denne tilnærmingen. Videre kan forbedringer i RNAi teknologi gjør parallell RNAi screening av en mye enklere og kostnadseffektiv prosess [28], [29]. Parallelle RNAi skjermer, når kombinert med ledsager tilnærminger, for eksempel uttrykk profilering, genomisk profilering og høy gjennomstrømming histopatologiske og immunhistokjemisk analyse har potensial til å identifisere potensielle mål som er verdig videre undersøkelser. I tilfelle av WEE1, har en kombinasjon av RNAi screening, transkripsjon profilering, genomisk profilering og histologisk analyse førte til identifikasjon av en pasient subsett (luminal brystkreft), hvor inhibering av denne kinase kan bli utforsket som en potensiell terapeutisk strategi. Innlemming denne tilnærmingen til det konvensjonelle stoffet målet identifikasjonsprosessen har potensial til å effektivisere utviklingen av nye behandlingsformer.
Materialer og metoder
Cellelinjer, forbindelser, plasmider og siRNA
MCF7 CAL51, HeLa, A549, NCI-H226, PC3, DU145 og MCF10A celler ble oppnådd fra ATCC (USA) og vedlikeholdes i henhold til leverandørens anvisninger. WEE1 inhibitor (681637) ble oppnådd fra Calbiochem (UK). MCF7 og HeLa celler ble transfektert med SMARTpool sirnas hjelp Dharmafect 3 transfeksjon reagenser; A549 og NCI-H226-celler ble transfektert med SMARTpool sirnas hjelp Dharmafect en transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Dharmacon). CAL51 celler ble transfektert med SMARTpool sirnas hjelp Oligofectamine transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen). DU145 cellene ble transfektert med SMARTpool sirnas hjelp Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen). Den kinase siRNA-bibliotek (siARRAY – målretting 779 kjente og antatte humane protein kinase-gener) ble oppnådd i ti 96-brønners plater fra Dharmacon (USA). Hver brønn i dette biblioteket inneholdt en SMARTpool av fire forskjellige siRNA arter rettet mot ulike sekvenser av målet karakterutskriften. Hver plate ble supplert med siCONTROL (ti brønner, Dharmacon (USA)). Den WEE1 ONTARGETplus SMARTpool og ONTARGETplus siControl ble hentet fra Dharmacon (USA)
Antistoffer
Antistoffer rettet mot følgende epitoper ble brukt. WEE1 (4936, Cell Signaling, UK), PARP (9542, Cell Signaling, UK) og β-tubulin (T4026, Sigma, UK). Alle sekundære antistoffer anvendt for Western blot-analyse ble HRP-konjugert.
siRNA skjerm metode
celler sådd ut i 96-brønners plater ble transfektert 24 timer senere med siRNA (sluttkonsentrasjon 100 nM), i henhold til produsentens bruksanvisning. Hver siRNA plate ble supplert med 10 brønner av siControl. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene trypsinisert og delt inn i tre identiske kopi platene. Media var opp igjen etter 48 timer og 96 timer, og celle levedyktighet ble vurdert etter syv dager ved hjelp CellTiter Glo Lysende celleviabilitet Assay (Promega, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Data fra hver cellelinje ble behandlet som følger: luminescens lesning for hver brønn på en plate var log
2 transformert og uttrykt i forhold til median luminescens verdien av alle brønnene på samme plate (plate sentrering). Disse data ble deretter normalisert i henhold til medianen av hele skjermdata, ved bruk av median-absoluttavvik (MAD) for å beregne den sanne avvik innenfor hvert skjermbilde [30]. Denne normaliseringen representeres effekten av hver SMARTpool i hver cellelinje som en Z-stillingen [30] og tillatt effekten fra hver SMARTpool på levedyktighet som skal sammenlignes på tvers av cellelinjen panelet. AZ score≤-3 ble tatt som den betydning terskelen for redusert cellelevedyktighet, som representerer tre Mads fra medianen og tilnærmet tre standardavvik.
transkripsjon profilering
RNA ble ekstrahert fra cellelinjer med Trizol og fenol /kloroform-ekstraksjon fulgt av utfelling isopropanol. For rekkevidde cellelinje, ble tredoble ekstraksjoner og profiler utført. Biotin-merket cRNA ble fremstilt ved hjelp av en lineær forsterkning kit (IL1791; Ambion, Austin, TX, https://www.ambion.com) under anvendelse av 250 ng av kvalitetssjekket total RNA som inndata. Chip hybridiseringer, vasking, ble Cy3-streptavidin (Amersham Biosciences) farging og skanning utføres på en Illumina BeadStation 500 (San Diego, https://www.illumina.com) plattform ved hjelp reagenser og følgende protokoller levert av produsenten. Crna prøver ble hybridisert på Illumina menneske 6 v2 BeadChips, som dekker ca 47 000 RefSeq transkripsjoner. Den tilfeldige fordeling av store populasjoner av oligonukleotid-belagte kuler over de tilgjengelige stillinger i det humane-6 v2-brikken gjør det mulig, i gjennomsnitt, 30 intensitetsmålinger pr RefSeq, hvilket gav kvantitative vurderinger av genekspresjon [15]. All grunnleggende uttrykk dataanalysen ble utført ved hjelp av produsentens programvare BeadStudio 3.1. Illumina ekspresjonsprofiler ble utført in triplo, rådataene ble deretter varians stabiliserende transformert og robust spline normalisert ved hjelp av lumi pakken i Bioconductor programvare [31], [32]. Expression verdier for hver prøve var median skalert og den midlere uttrykket verdien ble etablert i løpet av de tre gjentak. Gener med vesentlig forskjell i ekspresjonen mellom cellelinjer ble identifisert ved en-veis analyse av varians (ANOVA). Dette transkripsjon profilering data er nå offentlig tilgjengelig (ArrayExpress tiltredelse: E-TABM-610)
Korrelasjonen av siRNA Z poengsum med genekspresjon
Sammenhengen mellom siRNA Z score og normalisert genekspresjon var. undersøkt for gener der siRNA forårsaket betydelig tap av levedyktighet (Z -3). Z minutter ble sammenlignet med normalisert genuttrykk bruker Pearson korrelasjonskoeffisient. Et gen ble tatt som å være signifikant korrelert hvis Pearson korrelasjonskoeffisienten var signifikant forskjellig fra null-hypotesen, korrelasjonen var omvendt, og variasjonen i genekspresjon mellom cellelinjer var signifikant forskjellig vurdert ved en-veis ANOVA.
Array CGH analysemetode
Genomisk DNA ble ekstrahert fra cellelinjer ved hjelp av QIAamp DNA Blood Mini Kit (51104, Qiagen), i henhold til produsentens instruksjoner. ble utført microarray-baserte CGH analyse på en in-house 32K flislegging banen BAC array plattform som tidligere beskrevet [33], [34]. For kopitall sammenhenger, gjennomsnittet av adaptive vekt glattet (AWS) prosenter av BACS inneholder genet av interesse ble brukt eksemplar nummer sammenhenger, og kopiere nummer tildelt som tidligere beskrevet [35]. Kort, AWS glattet log2 forhold verdier -0,12 ble kategorisert som tap, de 0,12 som gevinst, og de i mellom som uendret. Amplifikasjoner ble definert som glattet log2 forholdsverdier 0.4 [35]. Databehandling og analyse ble utført i R 2.0.1 (https://www.r-project.org/) og BioConductor 1,5 (https://www.bioconductor.org/), noe som gjør utstrakt bruk av modifiserte versjoner av pakker aCGH, marray og AWS spesielt.
Celleviabilitet assay for å måle WEE1 siRNA følsomhet
celler sådd ut i 96-brønners plater ble transfektert 24 timer senere med WEE1 ONTARGETplus SMARTpool eller ONTARGETplus siControl (endelig konsentrasjon 100 nM), i henhold til produsentens anvisninger. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble cellene trypsinisert og delt inn i tre identiske kopi platene. Media var opp igjen etter 48 timer og 96 timer, og celle levedyktighet ble vurdert etter syv dager ved hjelp CellTiter Glo Lysende celleviabilitet Assay (Promega, USA) og uttrykt i forhold til å bety luminescens i brønnene transfektert med siControl.
Cell levedyktighet assay for å måle medikamentsensitivitet
Celler ble sådd ut i 96-brønners plater og utsatt for forskjellige doser av WEE1 inhibitor (Calbiochem, Cat. No. 681637, 4- (2-fenyl) -9-hydroksypyrrolo [3, 4-c] karbazol-1,3- (2H, 6H) -dion (PHCD)) [21]. Celleviabilitet ble vurdert ved CellTiter Glo Lysende celleviabilitet Assay (Promega, USA) 48 timer senere og overlevende brøkdel for hver dose av stoffet vurderes ved å dividere luminescens verdien av stoffet behandlet av luminescens verdien av kjøretøyet.
Western en.
