Abstract
lysosome trafficking spiller en betydelig rolle i tumorinvasjon, en viktig begivenhet for utvikling av metastaser. Tidligere studier fra vårt laboratorium har vist at antero (ytre) bevegelse av lysosomer til celleoverflaten som reaksjon på visse tumor-mikromiljøet stimulus, slik som hepatocytt-vekstfaktor (HGF) eller sure ekstracellulære pH (PHE), øker cathepsin B sekresjon og tumor celle invasjon. Antero lysosome trafficking avhenger av natrium-proton leren aktivitet og kan reverseres ved å blokkere disse ion pumper med Troglitazone eller EIPA. Siden disse stoffene ikke kan føres inn i klinikken på grunn av toksisitet, har vi utviklet et høyt innhold av analyse for å oppdage medikamenter som blokkerer perifer lysosome menneskehandel med sikte på å identifisere nye legemidler som hemmer tumorcelle invasjon. En automatisert høy-innhold avbildningssystem (Cellomics) ble anvendt for å måle posisjonen til lysosomer i forhold til kjernen. Av totalt 2210 repurposed og naturlig produkt narkotika skjermet ble 18 «treff» identifisert. En av forbindelsene som er identifisert som en antero lysosomet handel inhibitor var niclosamide, et markedsført humant anti-helminthic medikament. Videre studier viste at niclosamide blokkert surt Phe, HGF, og epidermal vekstfaktor (EGF) indusert antero lysosome omfordeling, protease sekresjon, motilitet og invasjon av DU145 kastrere resistente prostata kreft celler ved klinisk relevante konsentrasjoner. I et forsøk på å identifisere den mekanismen som niclosamide hindret antero lysosomet bevegelse, har vi funnet at dette stoffet viste ingen signifikant effekt på nivået av ATP, mikrotubuli eller actin filamenter, og hadde minimal effekt på MAPK PI3K og veier. Niclosamide kollapset intralysosomal pH uten forstyrrelse av lysosome membranen, mens bafilomycin, en agent som svekker lysosome forsuring, ble også funnet å indusere JLA i vår modell. Samlet utgjør disse data tyder på at niclosamide fremmer juxtanuclear lysosome aggregering (JLA) via modulering av veier som er involvert i lysosome forsuring. I konklusjonen, har vi utviklet en validert reproduserbar høyt innhold analyse for å screene for legemidler som hemmer lysosome menneskehandel og redusere tumorinvasjon og vi oppsummerer handlingen av en av disse stoffene
Citation. Sirkul ML, Dykes SS, Carroll J, Kelly K, Galiano F, Greer A, et al. (2016) A Novel høyt innhold Imaging-basert skjerm Identifiserer Anti-Helminthic Niclosamide som hemmer av lysosome Antero Trafficking og Prostate Cancer Cell invasjon. PLoS ONE 11 (1): e0146931. doi: 10,1371 /journal.pone.0146931
Redaktør: Sidney Yu, Den kinesiske universitetet i Hong Kong, Hongkong
mottatt: 20 juli 2015; Godkjent: 23 desember 2015; Publisert: 19 januar 2016
Copyright: © 2016 sirkul et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
finansiering:. Denne forskningen ble finansiert delvis ved tilskudd fra Pfizer, og finansiering fra Feist-WEILLER Cancer Center. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt
Forkortelser: ( EGF), epidermal vekstfaktor; (HGF), hepatocytter Growth Factor; (Phe), ekstracellulære pH; (JLA), Juxtanuclear lysosome aggregering; (LMP), lysosome membran permeabilization; (ECM), ekstracellulær matrix; (RILP), Rab samspill lysosomal protein; (Tro), Troglitazone; (EIPA), 5- (N-etyl-N-isopropyl) -amiloride; (LAMP1), lysosomet tilhørende membranprotein-1; (MAPK), mitogen aktivert protein kinase
Innledning
lysosomer er multifunksjonelle intracellulære organeller som inneholder hydrolytic enzymer som bryter ned makromolekyler og cellulære komponenter [1]. Lysosomer ble klassisk antatt å eneste funksjon i cellulær rengjøring, men nyere bevis tyder på at disse organeller også bidra til patologien av mange klinisk relevante sykdommer, inkludert maligne. Lysosomer er involvert i tumordannelse gjennom mange ulike mekanismer, inkludert feilregulert autofagi, avvikende lysosomal menneskehandel og eksocytose, og økt lysosome membran permeabilization (LMP) [2,3]. På grunn av den store variasjonen av lysosome-mediert funksjoner som spiller en rolle i tumor overlevelse, har lysosomer nylig vært å få oppmerksomhet som et attraktivt mål for kreftbehandling.
Dannelse av metastatiske kolonier som følge av en invasiv primære svulsten er ledende årsak til kreft dødsfall. Dessverre er det ingen tilgjengelige legemidler som hemmer denne prosessen. Derfor er økt forståelse av invasjonen presserende behov for å utvikle effektive behandlinger for å forebygge tumorprogresjon. Våre tidligere undersøkelser viser at lysosomet handelen spiller en viktig rolle i regulering av kreftcelle invasjon, hvorved tumorceller med lysosomer som ligger nær plasmamembranen utskiller flere proteaser og er mer omfattende enn celler med lysosomer gruppert i det perinukleære region [4-7]. Spesielt har vi vist at flere vanlige funksjoner av fast tumor mikromiljøet, hepatisk vekstfaktor (HGF), og sure ekstracellulære (PHE) trigger lysosomet utadrettet bevegelse, ledsaget av øket cathepsin B sekresjon og tumorcelle-invasjon.
faktisk er cathepsin B en lysosomal cystein protease som spiller en rolle i protein omsetningen innen lysosomer [8]. I ondartede celler, er uttrykk for cathepsin B høyt opp regulert i forhold til normalt vev, og enzymet finnes innen aktin rike invasive utstikkere betegnes invadopodia [9,10]. Bevis støtter den oppfatning at lysosomale proteaser, inkludert cathepsin B, blir utskilt i det ekstracellulære miljøet, hvor disse proteaser deltar i degraderingen av den ekstracellulære matriks (ECM), er en nødvendig hendelse i kreftcellen invasjon [9,10].
lysosomer flytte sammen mikrotubuli og aktin filamenter via assosiasjon med molekylære motor proteiner, inkludert dyneins, kinesin og myosin [11-13]. Dessuten flere GTPases inkludert RhoA, Rab7, og Rab27 rekruttere motor proteiner til lysosomer, og dermed gi streng regulering av lysosome motilitet hele cellen [14-16]. Spesielt, er den minus-ende-rettet bevegelse av lysosomer langs mikrotubuli avhengig Rab7 og Rab samspill lysosomal protein (RILP), som rekruttere dynein motorer til lysosomer og fremmer retrograd transport [12]. I denne forbindelse, inhibere antero lysosomet handel ved overekspresjon av RILP resulterer i reduserte nivåer av utskilt cathepsin B og tumorcelle-invasjon [4]. Interessant, Troglitazone (Tro) og 5- (N-etyl-N-isopropyl) -amiloride (EIPA), natrium protonLere hemmere, fremme retrograd smugling av perifere lysosomer i prostatakreftceller, noe som resulterer i redusert protease sekresjon og tumorcelle invasjon [ ,,,0],4]. EIPA og Tro-mediert juxtanuclear lysosome aggregering (JLA) er Rab7 /RILP avhengig.
En annen faktor som kan bidra til lysosome trafficking er vacuolar typen proton-ATPase pumpe (V-ATPase). Dette store enzymatiske kompleks omformer energi av ATP-hydrolyse i bevegelsen av protoner på tvers av lysosomal membran. I tillegg til å generere lysosomal forsuring, er V-ATPase også innblandet i andre cellulære funksjoner inkludert vesikulær menneskehandel. Faktisk har c-subenheten vist seg å samhandle med Arf6, en liten GTPase som dirigerer membran trafficking og cytoskeletal dynamikk [17]. I osteoklaster, ATP6AP1 (en underenhet av V-ATPase også kjent som Ac45) samhandler med den lille GTPase Rab7, som regulerer vesikulær menneskehandel [18]. A-subenheten isoform er også antatt å være avgjørende i vesikulær menneskehandel [19].
Som tidligere karakteriserte hemmere av antero lysosome menneskehandel, for eksempel Tro og EIPA ikke kan føres inn i kliniske arena [20], vi søkt å identifisere ytterligere nye ombygginger og naturlig produkt forbindelser hvorav mange er allerede er i klinisk bruk for ikke-cancer indikasjoner. Vårt mål var å identifisere nye hemmere av antero lysosome menneskehandel med en god sikkerhetsprofil. Dette representerer en ny tilnærming i translasjonell kreftforskning som potensielt kan oppdage nye effektive anti-invasjon og anti-metastatiske narkotika.
I dette manuskriptet, presenterer vi resultatene av en skjerm på 4 biblioteker av forbindelser, hvorav noen er allerede markedsført for ikke-former for kreft, ved å benytte en ny høyt innhold metode som kombinerer fluorescens mikroskopi og multi-parameterbildeanalyse. Vi identifiserte flere legemidler som hemmer antero lysosome menneskehandel, inkludert niclosamide. Niclosamide (C13H8Cl2N2O4, MW 327) er en FDA-godkjent oral anti-helminthic agent, allment tilgjengelig utenfor USA for behandling av tarm bendelorm. Det er billig, generelt godt tolerert og forbundet med få bivirkninger [21]. Niclosamide utøver sin giftige effekt mot helminthes etter frakobling oksidativ fosforylering [22,23] og har den siste tiden vist seg å ha en lovende effekt mot kreft. I denne rapporten har vi undersøkt niclosamide sin virkningsmekanisme og effekt på lysosomer protease sekresjon, kreft cellemotilitet, og invasjon.
Materiale og metode
Cellelinjer og kultur
human prostatakreft-cellelinje DU145 og human glioma cellelinje A172 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). DU145-celler ble holdt i RPMI-1640 (Mediatech, Corning, NY) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. A172 glioma cellelinjer ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Mediatech) supplert med 10% FBS. Begge cellelinjer ble holdt i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 og ble passert på å oppnå mer enn 75% konfluens. Bufret RPMI-1640 ble fremstilt fra RPMI-1640 pulver supplert med 10 mM NaHCO
3 og 20 mM NaCl og tilpasset Phe 6.4.
Høyt innhold skjermen for hemmere av perifer lysosome menneskehandel
DU145 cellene ble sådd ut i 96-brønners plater ved 4500 celler per brønn. RPMI bufret media titrert ved pH fra 6.4 til 6.8 ble tilsatt til kolonne 12 etter at media ble fjernet, og tjener som negativ kontroll. Forbindelser som skal siktes ble tilsatt til kolonne 2-11 etter fortynning med lav pH-bufret medium ved en sluttkonsentrasjon på 5um. De 4 sammensatte bibliotekene som inngår i det aktuelle skjermbildet inkluderer NIH Clinical Collection (450 rusmidler), Prestwick (1200 rusmidler), phytochemical (320 rusmidler) og GreenPharma (240 narkotika). 25 uM EIPA tjente som en positiv kontroll. Etter en 16 timers inkubering ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd kald (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 20 minutter. Cellene ble vasket med fosfatbufret saltvann (PBS) og deretter lysosomer ble farget ved inkubasjon med den H4A3 LAMPE-1-antistoff fortynnet til 1: 200 i 0,25% BSA og 0,1% saponin i PBS (BSP) i 1 time. Cellene ble deretter vasket med PBS 3 ganger og inkubert i 1 time med Dylight esel anti-mus fortynnet til 1: 200 i BSP. Cellene ble deretter vasket med PBS 3 ganger og inkubert i 20 minutter med DAPI (Sigma-Aldrich) fortynnet 1: 1000 i PBS. DAPI ble vasket av med PBS, og cellene ble opprettholdt i PBS for varigheten av filtreringsprosessen. Platene ble montert og lese i en Cellomics Arrayscan (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) automatisert fluorescens imager (fig 1A). Celler ble fotografert med 20X objektiv i 2 fluorescerende kanaler. I alt 15 ulike felt i hver brønn, og maksimalt 300 celler ble fotografert per brønn. Den biocompartmental analysealgoritmen ble brukt til å identifisere hver celle ved sin kjerne og å anvende et cytoplasmatisk maske (ring) og beregne antall lysosomer inne i ringen. Ringen var på 12 piksler bredde, og dens indre kant var 6 piksler bort fra kjernen. Gjennomsnittlig antall lysosomer inni bestemt ringe regionen ble kjøpt som «bety ring sted count kanal 3», som representerer fordelingen av lysosomer i forhold til kjernen. Når lysosomer bevege seg bort fra kjernen og spre seg over hele cytoplasmaet, antall flekker som representerer lysosomer inne i cytoplasmiske maske øker. I motsetning til lysosomer klynge nær kjernen numrene på plass inne i cytoplasma ring avtar (figur 1B). Z «faktor av forsøket ble bestemt fra EIPA (positiv kontroll) og lav pH-verdi (negativ kontroll) [24]. Forsøk ble utført i duplikat. Kun plater med positiv Z-faktor ble anvendt for analyse.
(A) Metodikken av cellomics-baserte høyt innhold screening tilnærming. (B) DAPI farging anvendes av cellomics bildeplattformen for å identifisere individuelle celler. En virtuell maske trekkes ut av maskinen (presentert av en grønn ring) med en forutbestemt bredde og avstand fra kjernen. Antallet lysosomer inne i masken er beregnet av maskinen (representert ved den lilla sted inne i ringen). Ved å behandle cellene med sur Phe, lysosomer bevege seg ut og antall flekker inne i ringen øker. Ved å hemme lysosome bevegelse, antall plasser rundt kjernen øker mens antall flekker i ring maske avtar. Denne egenskapen ble anvendt for å beregne relativ lysosomet fordeling. (C) Den funksjonelle virkning for hver forbindelse i forhold til kontroll ble beregnet ved bruk av «normalisert prosent hemming» (NP). Statistisk signifikans mellom forbindelsene og den negative kontrollen ble målt ved hjelp av Z-stillingen. Et spredningsdiagram som representerer NPI (X-aksen) og Z-score (Y-aksen) av hver forbindelse er trukket. Stoffet som gir en NPI score på mer enn 50% og en Z score på mindre enn -4 (høyre nedre kvadrant som vist med rød pil) ble utpekt som «hit» forbindelser.
reagenser og antistoffer
LY294002, U0126, bafilomycin A og nocodazol ble anskaffet fra Calbiochem (San Diego, CA) og ble anvendt ved 10 uM, 10 uM, 100 nM og 10 uM, respektivt. Phalloidin 1: 200 ble kjøpt fra Life Technologies (Grand Island, NY). Den α-tubulin-antistoff, 1: 1000, ble kjøpt fra Neomarkers (Fremont, CA). LAMP1 antistoff (H4A3), 1: 200, ble kjøpt fra utviklingsstudier hybrid bank ved University of Iowa. DyLight 594 eller FITC, esel anti-mus eller anti-kanin ble kjøpt fra Jackson Immunoresearch (West Grove, PA). Pakt og pMet ble brukt på 1/1000 og kjøpt fra Cell Signaling (Beverly, MA). EIPA (25 uM), cytokalasin D (1 uM), Rab7 antistoff (1: 1000), og klorokin (50 uM) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Sekundær HRP-konjugert anti-kanin og anti-mus ble kjøpt fra GE Healthcare (Pittsburgh, PA).
immunfluorescens
Celler ble sådd på 50-70% samløpet på dekkglass. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter. Cellene ble deretter vasket med PBS og inkubert med primært antistoff (1: 200 fortynnet i BSP) i en time. Cellene ble deretter vasket en gang med PBS før inkubering med fluorescens-konjugert sekundært antistoff (1: 200 fortynnet i BSP) i en time. For aktin farging, ble celler inkubert med phalloidin fortynnet til 1: 200 i BSP i 20 minutter. Lysbilder ble montert ved hjelp Slowfade Anti-Fade Gold reagens med DAPI (Life Technologies, Grand Island, New York). Bilder ble ervervet ved hjelp av et Olympus UPlanFL 40X /0.75 objektiv og et Olympus BX50 mikroskop med MetaMorph programvare. Bilder ble slått sammen ved hjelp ImageJ programvare. For confocal bilder, ble en HCX Plan Apo 63X /1,4 til 0,6 olje objektiv på Leica TCS SP5 mikroskop og Leica LAS AF programvare som brukes.
Acridine oransje flekker
Celler dyrket på glass dekkglass ble lastet med 10 ug /ml akridinorange (Sigma Aldrich) i 20 minutter ved 37 ° C og deretter vasket med PBS. Etter en inkubasjon over natten med forskjellige sammensetninger, ble cellene fiksert med kald 4% PFA i 20 minutter og deretter objektglass ble montert med Slowfade Anti-Fade gull-reagens med DAPI, før visualisering ved immunofluorescens-mikroskopi.
proliferasjonsanalyse
cellene ble sådd ut i 96-brønn plate med 4500 celler per brønn og dyrket i 16 timer. Antall levedyktige celler i triplikate brønner ble bestemt etter CellTiter-Blue
® (Promega, Madison, WI) reagens ble tilsatt til hver brønn ved 1/5 volumforhold, i henhold til produsentens protokoll. Platen ble inkubert ved 37 grader i en time, og deretter montert på fluorescerende leser, hvor fluorescens på angitt tidspunkt blir registrert ved 560 eksitasjon /590-utslipp.
ATP analysen
Celler ble sådd i 96-brønn plate med 4500 celler per brønn og dyrket i 16 timer. CellTiter-Glo
® reagens (Promega, Madison, WI) ble tilsatt til hver brønn i henhold til produsentens protokoll og platen er montert på luminescens-leser. Mengden av luminescens i hver brønn er proporsjonal med mengden av ATP.
Western Blot
Hele cellelysatene ble samlet opp i kokende Laemmli-buffer (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 0,13 mM bromfenolblått, 1 M sakkarose) blandes med beta-merkaptoetanol (i forholdet 50: 1). Lysater ble kjørt på en 10% polyakrylamidgel, overført til PVDF (Millipore, Billerica, Massachusetts), blokkert i 10% melk i TBST (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,5) og probet med egnede antistoffer i 16 timer. Membranene ble deretter inkubert med HRP-konjugert sekundært antistoff (1: 5000) i en time før utvikling ved bruk av ECL-plus (Pierce, Waltham, MA). Kodak Biomaks XAR film ble anvendt for kjemiluminescens deteksjon.
Cathepsin B assay
Denne analysen ble utført som tidligere beskrevet [7]. I korthet ble cellene sådd ut ved 80% konfluens, og på dette tidspunkt fullstendig medium ble erstattet med serumfritt medium og de angitte betingelser. Etter inkubasjonen ble mediet fjernet, og cellerester ble oppsamlet ved kort sentrifugering. Media ble deretter konsentrert via Amicon-filtrering konsentrasjonsenheter 10.000 Dalton (Millipore). Prøvene ble deretter titrert til pH 5,0-5,5 og aktiv cathepsin B ble så detektert ved hjelp av en fluorogent cathepsin B aktivitetsanalyse (Calbiochem, San Diego, CA) ifølge produsentens protokoll. Samtidig ble cellelysater ekstrahert med RIPA-buffer ved 4 grader. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av kolorimetrisk Pierce BCA-analyse (Thermo Fisher Scientific). Cathepsin B-aktivitet ble normalisert til total cellular proteinnivået ved å beregne forholdet cathepsin B-aktivitet i løpet av proteinnivået i hver tilstand.
Lentiviral levering av shRNA
shRNA rettet mot Rab7 (CCGGGCCACAATAGGAGCT GACTTTCTCGAGAAAGTCAGCTCCTATTGTGGCTTTTT) ble levert i DU145 prostata kreft celle ved hjelp av Mission
™ lentiviral Transduction Partikler (Sigma-Aldrich) i henhold til produsentens protokoll og som tidligere beskrevet [6,7]. shRNA ekspresjon ble holdt under puromycin (1,8 ug /ml) valg. Ikke Target (NT) shRNA targeting ingen kjente pattedyrgener ble brukt som en negativ kontroll (Sigma-Aldrich, shc202V).
Transfeksjon celler med plasmider som koder LC3-GFP-mCherry
retroviral- basert pBABE-mCherry-EGFP-LC3B plasmid (plasmid # 22418) ble kjøpt fra Addgene (Cambridge, MA). Viruset ble pseudotyped hjelp av pPAM3 emballasjen vektoren etter ko-transfeksjon inn i HEK293T celler og virus-supernatanter ble filtrert (0,2 pm), alikvotert og lagret ved -80C. Transfeksjon eksperimenter ble utført med Lipofectamine transfeksjon reagens (Life Technologies) i henhold til produsentens protokoll.
motilitet og invasjonsanalyser (IncuCyte)
96 godt ImageLock Mikro (Essen Bioscience, Ann Arbor, Michigan) ble belagt med type-I kollagen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Celler ble sådd ut og dyrket til 90% konfluens. Identiske sår ble gjort i hver brønn med 96 godt såret healer (Essen Bioscience). Celler ble vasket for å fjerne flytende celler og rester. 20% Matrigel (Corning) ble plassert i brønner beregnet for invasjon studier. Behandlingsbetingelsene ble påført i hver brønn. Platene ble montert på IncuCyte zoom bildeplattformen (Essen Bioscience) som holdes ved 37 ° med 5% CO2 og erverver sanntidsbilder for det samme region i hver brønn hver 4. time. En maske ble laget for å bestemme sårheling for hver brønn. Relativ Sår Tetthet (bakhjulsdrevet) ble anvendt for å kvantifisere tumorcelle-invasjon og motilitet.
DQ-kollagen IV-degradering assay
DU145-celler ble dyrket i 2 dager på dekkglass som ble lagvis med 100% matrigel (Corning) og DQ-kollagen IV (Invitrogen Life Technologies, fortynnet ved sluttkonsentrasjon på 25 ug /ml). Etter behandling over natten med medikamentet i nærvær eller fravær av HGF ble cellene fiksert i 4% (vekt /volum) paraformaldehyd i 30 minutter. Deretter ble cellene vasket 2 ganger med PBS og inkubert med Alexa Fluor 635 phalloidin (Life Technologies) ble fortynnet 1: 200 i BSP i 30 minutter for å farge aktin cytoskjelettet. Cellene ble deretter vasket 2 ganger med PBS, og objektglassene ble montert. Kolonier og spaltet DQ-kollagen IV ble visualisert på Leica TCS SP5 Laserskanning konfokalmikroskop og bildene ble tatt med LAS AF programvare.
statistikker
GraphPad Prism 5.0 og Microsoft Excel-programvare ble brukt til å utføre statistikken. Ett eller to-halet Student t test ble benyttet for å analysere statistiske forskjeller. Alle grafene viser gjennomsnitt og standardavvik (SD). Forskjeller på p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. IC
50 av narkotika ble beregnet ved bruk av lineær regresjon ligningen på GraphPad Prism. Drug screening ble utført på 2 paralleller. Robust Z «faktor ble beregnet ved hjelp av median og median-absoluttavvik for kontroll positiv og negativ av hver plate og bare plater med positiv verdi ble validert [24-27]. Z «Faktor = 1 – {3 (SDN + SDP) /(Mn-Mp)} [20], hvor Mp, Mn, SDP, Sdn er gjennomsnitt og standardavvik for positiv kontroll (EIPA) eller negativ kontroll (syre alene) . Størrelse virkning av hver forbindelse ble beregnet ved hjelp av normaliserte andel av inhibering (NP). NP = (H-xi) /(H-L) tids 100; hvor H = gjennomsnittet av negativ kontroll og L = bety av positiv kontroll, og xi verdien av den tilsvarende forbindelse. Statistisk forskjell i forbindelsenes virkning i forhold til den negative kontroll ble beregnet ved bruk av Z-score, som er verdien av hver forbindelse normalisert til den negative kontroll. Z poengsum = (xi-H /SDN, hvor xi er verdien av den tilsvarende forbindelse, H og Sdn er middelverdi og standardavvik for den negative kontroll i hver plate henholdsvis. Bare stoffer som viser en Z-score under minus 4 og NPI over 50% ble revurdert for fremtidige studier.
Resultater
En roman bildebasert høyt innhold screening tilnærming identifiserer legemidler som hemmer antero lysosome trafficking
for å identifisere klinisk tilgjengelige forbindelser som hindrer surt Phe-mediert antero lysosome menneskehandel, har vi utviklet et høyt innhold skjermen ved hjelp av Cellomics Array Scan IV bildebehandling plattformen (fig 1A). DU145 prostata kreft celler ble sådd i 96 brønners plater. lav pH serum frie medier og EIPA ble anvendt som negative og positive kontroller respektivt. Forbindelser fra fire uavhengige kjemiske biblioteker ble påført på ca. 5 uM konsentrasjon til celler behandlet med pH 6,4 serumfritt RPMI over natt. cellene ble fiksert og lysosomer ble identifisert med en lysosomet tilhørende membranprotein-1 ( LAMP1) antistoff, en etablert lysosomal markør, mens kjernene ble visualisert med DAPI. Den Cellomics Arrayscan plattformen ble brukt til å visualisere immunfluorescens i hver brønn med 20x objektiv og en kompartment analyse programvare kvantifisert lysosome innenfor hver celle. Lysosome fordeling ble bestemt ved å analysere antall LAMP-en positiv puncta innenfor det angitte «ring» regionen (figur 1B).
Celler med lysosomer viser JLA (EIPA behandlet) hadde færre lysosomes innenfor ringen region i forhold til celler med lysosomer lokalisert diffust i hele cytoplasma. Analyser ble validert ved å beregne Z «faktor som måler evnen av test å skille mellom positive og negative kontroller [24]. Den funksjonelle effekt for hver forbindelse i forhold til kontrollene ble beregnet ved hjelp av en «normalisert prosent av hemming» score (NPI). Sterkere hemming av antero lysosome trafficking ensidige høyere NPI verdi. Statistisk signifikans av «bety ring spot» forskjell mellom forbindelse og negativ kontroll ble målt ved anvendelse av en Z-stillingen tilnærming (Fig 1C). Forbindelser med NPI score over 50% og Z score under -4 ble valgt (høyre nedre kvadrant som vist med rød pil) og re-undersøkt visuelt for å eliminere falske positiver. Blant 2210 testet forbindelser, ble atten narkotika identifisert som hits og verifisert av sekundærscreening. Mange av disse forbindelser er allerede kjent for å være mikrotubul forstyrrende midler, og forutsigbart at de ville hindre utadrettet bevegelse av lysosomer.
Niclosamide, et anti-helminthic middel, ble også identifisert som en av de treff. Siden har niclosamide vist seg å ha anti-kreft effekt i glioblastom [28], ikke-småcellet lungekreft [29], tykktarmskreft [30], og brystkreft [31], valgte vi å ytterligere undersøke hvilken rolle niclosamide på lysosomet bevegelse i prostatakreftceller.
niclosamide er giftig ved konsentrasjoner på 1,0 mikromolar
Først, testet vi cellulær toksisitet av niclosamide for å identifisere omfanget av konsentrasjonene ved hvilke dette stoffet kunne benyttes for eksperimentelle studier. Niclosamide ble påført på DU145 prostata kreftceller ved varierende konsentrasjoner over tid. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av et fluorescens-baserte celleanalyse (S1A Fig). Niclosamide behandling resulterte i redusert spredning ved konsentrasjoner på 0,6 uM og oppover ved 24 og 48 timer etter behandling. Nedgangen i cellenes levedyktighet ble mer tydelig ved 48 timer og ved en dose på 1 uM og oppover når vi merke til en reduksjon i levedyktige celler ved 48 timer versus 24 timer. Den halv-maksimal hemmende konsentrasjon (IC
50) ble beregnet som 1,01 uM (S2 Fig). Derfor, for resten av forsøkene vi har utført, vi valgte en konsentrasjon som ikke overstige 1 mikrometer og eksperimenter som ikke overstige 24 timer.
Niclosamide hemmer antero lysosome menneskehandel i kreftceller
for ytterligere å karakterisere niclosamide som et lysosom handelen inhibitor, ble DU145 prostata kreftceller behandlet over natten med DMSO eller niclosamide og utsatt for sure pH 6,4 media, 33 ng /ml HGF eller 100 ng /ml EGF i 16 timer. Cellene ble deretter fiksert og farget med DAPI (blå), LAMP1 (rød), og phalloidin (grønn) (figur 2A). Celler behandlet med DMSO vises antero lysosome menneskehandel i respons til surt Phe, HGF og EGF. Men ikke celler behandlet med niclosamide ikke gjennomgå antero lysosome menneskehandel i respons til surt Phe, HGF eller EGF; i stedet, lysosomer forbli gruppert i perinukleær regionen. Dette bekrefter resultatene av den høyt innhold av legemiddel skjerm som er identifisert niclosamide som en inhibitor av lysosomet handel.
(A) DU145-celler ble behandlet med 6,4 Phe, 33 ng /ml HGF eller 100 ng /ml EGF i tilstedeværelse eller fravær av 0,5 pM niclosamide. Cellene ble fiksert og farget for DAPI (blå), aktin (grønn), og LAMP-en (rød). I kontroll og i EGF eller HGF-behandlede celler lysosomene er plassert i periferien (hvite piler) mens i niclosamide-behandlede celler lysosomene er rundt kjernen (hvite pilspisser). Skala barer: 10 mikrometer. DU145-celler ble behandlet over natten med varierende konsentrasjoner av niclosamide fortynnet i (B) lav pH medier (pH 6,4), (C) medium inneholdende 33 ng /ml HGF, eller (D) medium inneholdende 100 ng /ml EGF og relative lysosomet fordeling var beregnes ved hjelp av cellomics imager. Kvantifisering av lysosomet stilling er vist som gjennomsnittet av den beregnede «betyr ring sted telling kanal 3». Feilfelt representerer SD fra minst 3 uavhengige eksperimenter. * Angir statistisk signifikans (p 0,01) versus niclosamide. (E) DU145 celler ble behandlet med 1 mikrometer Niclosamide over tid og i forhold lysosome fordeling ble beregnet ved hjelp av cellomics imager. Kvantifisering av lysosomet stilling er vist som gjennomsnittet av den beregnede «betyr ring sted telling kanal 3». Feilfelt representerer SD fra minst 3 uavhengige eksperimenter.
En dose respons studie ble utført for å bestemme den minste effektive dose av niclosamide kreves for å initiere JLA. DU145-celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner av niclosamide i 16 timer i nærvær eller fravær av sure Phe (figur 2B), HGF (figur 2C) eller EGF (figur 2D). Celler ble immunfarget for å detektere LAMP1 og DAPI ble brukt til å identifisere kjerner. Den relative lysosomet fordeling ble analysert ved hjelp av Cellomics Imager. Niclosamide betydelig blokkert omfordeling av lysosomer i en konsentrasjon så lav som 312 nM etter stimulering med HGF eller EGF, og på 625 nM etter stimulering med syrlig Phe.
Deretter gjennomførte vi et tidsforløp analyse for å identifisere det minimum av tid som var nødvendig før niclosamide var effektiv på å indusere JLA. DU145-celler ble utsatt for niclosamide over tid i nærvær av sure medier (pH 6,4). Fig 2E viser at lysosome posisjonering ble endret på snart som 2-4 timer etter eksponering for niclosamide, og JLA økt over tid. Ingen forandring i lysosomet posisjoneringen ble observert i kjøretøyet kontroll behandlede celler. Til sammen indikerer disse data at niclosamide endrer posisjonen til lysosomet ved en dose så lav som 312 nM og så tidlig som 2 timer.
Niclosamide-indusert JLA ikke involverer inhibering av ATP-produksjon
tidligere arbeid har innblandet kinesin, en ATPase motor protein, i tillegg til-ende-rettet bevegelse lysosomet (ytre lysosomal bevegelse) [32-34]. Siden niclosamide er kjent for sin evne til å målrette den oksydative fosforylering av parasitter [22,23], søkte vi å bestemme hvorvidt niclosamide-induserte JLA skyldtes ATP uttømming, som følge av et inhibert oksidativ fosforylering, og dermed endring av aktiviteten av ATP -driven proteiner som kinesin. Følgelig ble DU145 prostata kreftceller behandlet med vehikkel kontroll eller niclosamide i løpet av en 4 timers periode og intracellulære ATP-nivåer, et surrogat av oksidativ fosforylering, ble målt ved anvendelse av en luminescens-baserte analysen (S1B Fig). Selv er virkningen av niclosamide på lysosome posisjonering observert så tidlig som to timer etter eksponering for stoffet, ble det ikke observert signifikant forskjell i ATP-nivå mellom celler behandlet kjøretøy kontroll eller niclosamide. Feilfelt representerer SD fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer SD fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer SD fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Feilfelt representerer SD fra minst 3 uavhengige eksperimenter. Yang et al. Cytokalasin D ble anvendt som en kontroll for å depolymerisere actin filamenter. Celler ble fiksert og farget for aktin (grønn) og DAPI (blå). Pilene viser at de samme cellulære komponenter (trådformede aktin-pilspiss, kortikal actin- lukket pil, focal adhesion- åpen pil) er lik mellom kontroll og niclosamide. Skala barer: 20 mikrometer. Nocodazol ble anvendt som en kontroll for å depolymerisere mikrotubuli. PI3kinase og MAPK er ikke nødvendig for niclosamide for å forhindre sure media som induseres utover lysosomet bevegelse. Product: (A) Celler ble stimulert med 33 ng /ml HGF i nærvær eller fravær av 0,5 pM niclosamide over tid. Cellelysater ble oppsamlet og ble utført Western blot-analyse for de angitte proteiner. (B) DU145-celler ble forbehandlet med PI3K-inhibitor, LY294002, eller MAPK-inhibitor, U0126, før tilsetningen av niclosamide 1 uM i 16 timer. Cellene ble fiksert og farget for LAMP-en og mener lysosome fordeling i forhold til kjernen ble beregnet ved hjelp av Cellomics imager. Kvantifisering av lysosomet fordeling er vist som gjennomsnittet av relative posisjonen til kjernen. * Angir statistisk signifikans (p 0,05) i forhold til samme behandling i serumfritt. Niclosamide blokkerer vekstfaktor-indusert motilitet og invasivitet uavhengig av Rab7 status.
DU145 NT og Rab7 KD-celler ble dyrket i 96-brønners plater og såret med den 96-brønners viklet helbreder før tilsetningen av Matrigel i brønnene utformet for invasjon. Celler ble tillatt å (A) migrere, eller (B) invadere i nærvær av 33 ng /ml HGF eller 100 ng /ml EGF i nærvær eller fravær av 0,3 uM niclosamide. Motilitet og invasjon ble beregnet ved hjelp av IncuCyte plattformen og den relative såret tetthet prosent på 24 timer etter såret. Feilfelt representerer SD fra minst 3 uavhengige eksperimenter.
