har vist
Abstract
Bakgrunn
Menneskelig heparanase spiller en viktig rolle i kreftutvikling og enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) i heparanase genet (HPSE) å være korrelert med magekreft. Denne studien undersøkte sammenhengen mellom individuelle SNPs eller haplotyper i HPSE og mottakelighet, clinicopathological parametre og prognose av magekreft i et stort utvalg av Han befolkningen i det nordlige Kina.
metodikk /hovedfunnene
Genomisk DNA ble ekstrahert fra formalinfikserte, parafininnstøpte normale gastriske vevsprøver fra 404 pasienter og fra blod fra 404 friske kontroller. Seks SNPs ble genotypet ved matriks-assistert laser desorpsjon /ionisering time-of-flight massespektrometri. En chi-kvadrat (χ2) test og betingelsesløs logistisk regresjon ble brukt til å analysere risikoen for magekreft; en Log-rank test og Cox-modellen ble brukt til å produsere overlevelsesanalyse og en Kaplan-Meier metoden ble brukt for å kartlegge overlevelseskurver. De gjennomsnittlige genotyping suksessraten var mer enn 99% i begge gruppene. Haplotype CA i blokken bestående av rs11099592 og rs4693608 hadde en større fordeling i gruppen av Borrmann typene 3 og 4 (P = 0,037), gruppen av et større antall av lymfeknutemetastaser (N3 vs N0 gruppe, p = 0,046), og dessuten var korrelert til dårlig overlevelse (CG vs CA: HR = 0,645, 95% KI: 0,421 til 0,989, P = 0,044). I tillegg genotyper rs4693608 AA og rs4364254 TT ble assosiert med dårlig overlevelse (P = 0,030, HR = 1,527, 95% KI: 1,042 til 2,238 for rs4693608 AA; P = 0,013, HR = 1,546, 95% KI: 1,096 til 2,181 for rs4364254 TT). Det var ingen sammenheng mellom enkelt SNPs eller haplotyper og magekreft.
Konklusjon /Betydning
En funksjonell haplotype i HPSE ble funnet, som inkluderte de viktige SNP rs4693608. SNPs i HPSE spiller en viktig rolle i magekreft progresjon og overlevelse, og kanskje kan være en molekylær markør for prognose og behandling verdier
Citation. Li AL, Song YX, Wang ZN, Gao P, Miao Y, Zhu JL, et al. (2012) Polymorfisme og en haplotype i heparanaseinhibitor Gene foreninger med progresjon og prognose av magekreft i en Nord-kinesiske befolkningen. PLoS ONE 7 (1): e30277. doi: 10,1371 /journal.pone.0030277
Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan
mottatt: 13 oktober 2011; Godkjent: 12 desember 2011; Publisert: 20 januar 2012
Copyright: © 2012 Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Science Foundation National of China (nr 30972879 og nr 81172370), en Specialized forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning (nr 200 801 590 006) og Foundation Natural Science i Liaoning-provinsen (nr 20092129). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen i verden og andre ledende årsak til kreft dødelighet [1]. Til tross for fremskritt i diagnostikk og behandling, prognosen for pasienter med avansert magekreft er fortsatt dystert [2]. Videre er magekreft en sykdom av gen-miljø interaksjoner og genetiske faktorer spiller en viktig rolle i tumorigenese og progresjon [3]. Derfor oppdagelse og anvendelse av biomarkører innlemmet med tradisjonell kreftdiagnose, iscenesettelse, og prognosen kan anses det beste alternativet for å kontrollere denne livstruende sykdom [4].
enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) har vært antatt å være attraktive biomarkører i kreft risikovurdering, screening, iscenesettelse, eller gradering [5]. Dessuten er det menneskelige genom består av en rekke «haplotype blokker», som er nonrandom sammenslutninger av alleler på grunn av koblingsulikevekt (LD), og det er mulig å utnytte en enorm mengde informasjon å vurdere disse haplotype blokkene [6], [7 ]. Selv om anvendelsen av individuelle SNP analyser har vært begrenset så langt, har haplotype-basert forening studie foreslått som en kraftfull og helhetlig tilnærming til å identifisere årsaks genetisk variasjon underliggende komplekse sykdommer [8], [9].
heparanase er den eneste kjente pattedyr-enzym som nedbryter heparansulfat (HS) proteoglykaner i basalmembraner og den ekstracellulære matriks [10]. Dette fører til demontering av ekstracellulære barrierer, frigjøring av HS-bundne bioaktive faktorer, og generering av HS fragmenter som fremmer vekstfaktor-reseptor-binding og signalering [11], [12]. Heparanase er sterkt assosiert med kreft progresjon og metastase, inkludert celleoverlevelse, invasjon, spredning, neovaskularisering, og etableringen av et vekstgivende mikro [13], [14] og det har både prognostiske og terapeutiske anvendelser [15]. Den heparanase genet (HPSE), først klonet i 1999, ligger på kromosom 4q21.3 [16]. Det er gjort få studier på SNPs i HPSE genet. Molekylære epidemiologiske studier har vist distribusjons forskjeller i SNPs i HPSE i ulike israelske jødiske befolkninger [17]. Assosiasjoner til tumor følsomhet er også blitt påvist, inkludert ondartede hematologiske tilstander og magekreft, men resultatene har ikke vært accordant [18] – [20]. I tillegg har Shirley Ralphand [21] er vist en HPSE haplotype ble korrelert til trinn i eggstokk-karsinom og Yue et al. [20] har vist SNPs ble korrelert til clinicopathological parametere og overlevelse. Spesielt studien indikerte at SNPs i HPSE var assosiert med heparanase uttrykk nivåer og ga grunnlag for videre studier på sammenhengen mellom SNPs og sykdom [22]. Imidlertid ble disse assosiasjonsstudier begrenset til små prøver.
Nylig, Hennig G [23] og Horn H [24] observerte høy genotyping deteksjon priser (93,5% og 94-97%) og en perfekt samstemmighet av 100% med DNA ekstrahert fra normale formalinfikserte, parafininnstøpte vev (FFPETs) sammenlignet med kimlinje DNA ved hjelp av matrise-assistert laserdesorpsjon /ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS). Dessuten, andre rapporter viste også høye genotyping deteksjon priser og en perfekt samstemmighet med FFPET-avledet DNA inkludert tiår gamle blokker sammenliknet med blod fra samme individ ved hjelp av andre metoder, selv i genom-wide genotyping [25] – [28]. Det har blitt fastslått at FFPET-avledet DNA som var tilstrekkelig for genetisk polymorfisme analyse. I denne studien brukte vi en stor samling av FFPET-avledet DNA-prøver fra pasienter og blod-avledet DNA fra kontrollene i et MALDI-TOF MS metode for å genotype og studere mulige assosiasjoner mellom seks SNPs (rs4693602, rs6856901, rs4364254, rs11099592 , rs4693608 og rs4328905) eller haplotyper i HPSE og tumor mottakelighet, clinicopathological parametre, og overlevelse av magekreft med et stort utvalg av Han befolkningen i det nordlige Kina. Som et resultat ble enkelt SNPs og en haplotype funnet å vise assosiasjoner til progresjon og prognose av magekreft.
Resultater
emne egenskaper
Gjennomsnittsalderen var 56,67 ± 11,923 y og andelen av hannene var 70,54% i tilfelle gruppen. Gjennomsnittsalderen for kontrollgruppen var 56,91 ± 11,477 y og andelen menn var 70,54%. Det var ingen distribusjon forskjell i kjønn og alder mellom pasienter og kontroller (p = 1,00 for begge kjønn og alder). Av de 404 pasientene, stadium I magekrefttilfeller utgjorde 21,0% (85/404), stadium II magekrefttilfeller utgjorde 26,5% (107/404) og stadium III magekrefttilfeller utgjorde 52,5% (212/404) ( Tabell 1).
genotyping suksess priser
Vi brukte MassArray Typer Analyzer programvare 4.0.4.20 for automatisert spektra behandling og genotype identifikasjon. Representative MALDI-TOF-MS-profiler av hver genotype av de seks SNP i HPSE ble vist i figur S1. Alle SNPs var polymorfe med mindre allelfrekvens 10% og genotype distribusjoner var alle i avtalen med Hardy-Weinberg likevekt (data ikke vist). Høy suksessrate, som strekker seg mellom 96,29% og 100% (gjennomsnitt: 99,09%) i FFPETs gruppen og mellom 99.50% og 100% (gjennomsnitt: 99,79%) i kontrollgruppen, ble vist (tabell S1)
foreninger mellom enkelt SNPs og clinicopathological parametre og overlevelse
alleliske frekvenser og genotypiske frekvenser i de seks SNPs var ikke signifikant forskjellig mellom pasienter og kontroller (P 0,05 og P 0,05 etter en permutasjon test for allele frekvenser; P 0,05 etter å ha blitt justert for kjønn og alder for genotypiske frekvenser;. Tabeller S2 og S3)
SNPs ble evaluert for assosiasjoner med clinicopathological parametere. rs4364254 genotyper var forbundet med histologiske karakterer (p = 0,002, tabell S4), ble genotype TT korrelert til vel celle differensiering sammenlignet med genotypen TC /CC (OR = 0,482; 95% CI: 0,300 til 0,774). Andre SNPs hadde ingen signifikante sammenhenger til clinicopathological parametere.
I univariat analyse, pasienter bærer rs4693608 AA genotype hadde dårlig magekreftspesifikk overlevelse sammenlignet med pasienter med AG + GG genotype (P = 0,049, HR = 1,387 , 95% CI: 1,001 til 1,923, tabell 2, figur 1 og figur S2). I multivariat analyse, den rs4693608 AA genotype og rs4364254 TT genotype begge hadde en dårlig magekreftspesifikk overlevelse (P = 0,030, HR = 1,527, 95% KI: 1,042 til 2,238 for rs4693608; P = 0,013, HR = 1,546, 95% KI: 1,096 til 2,181 for rs4364254, tabell 2). Også Borrmann type (P 0,001), Pt kategori (P 0,001), pN kategori (P 0,001), og lymphovascular invasjon (P 0,001) var signifikant korrelert med overlevelse i univariat analyse. Borrmann type (P = 0,021), Pt kategori (P 0,001), og pN kategori (P 0,001) forble signifikant korrelert med overlevelse i multivariat analyse (tabell 2)
Resultatene viser at akkumulere overlevelse på. 381 tilfeller med magekreft ble assosiert med de forskjellige rs4693608 genotyper i HPSE genet.
tilstedeværelse av en haplotype relatert til clinicopathologic funksjoner og overlevelse
Det var to to-markør haplotype blokker bygget mellom seks SNPs i våre resultater (figur 2). Blokk 1 bestod av rs4693602 og rs6856901 og inneholdt tre vanlige haplotyper (frekvensområde: 0,025 til 0,850), som utgjorde ca. 99,9% av pasientene; blokk 2 var sammensatt av rs11099592 og rs4693608 og inneholdt også tre vanlige haplotyper (frekvensområde: 0.091-0.798), som representerte ca 99,9% av pasientene. Alle seks vanlige haplotyper hadde ingen sammenheng med magekreftrisiko (P 0,05 og P 0,05 etter en permutasjon test; tabell S5)
A:. HPSE genet struktur. Fylte bokser representerer de 13 eksonene (5 «→ 3»). Pilene viser plasseringen av SNPs. B: Kartlegging av blokken strukturen av de seks SNP som genereres av Haploview. Verdien innenfor hver rute i trekanten tomten representerer den parvise korrelasjonen mellom SNPs (målt som D «) definert av øvre venstre og øvre høyre side av rutene. The Squares uten tall tilsvarer D «= 1. Shading representerer størrelsen og betydningen av parvis LD, med en rød til hvit gradient reflekterer høyere til lavere LD verdier. Hyppigheten av hver felles haplotype i en blokk er på siden av haplotype.
Sammenhenger mellom haplotyper i HPSE og magekreft clinicopathologic funksjoner på diagnosetidspunktet ble evaluert. Haplotype CA i blokk 2 hadde større utbredelse i gruppen av Borrmann typer 3 og 4 i forhold til TG + CG haplotyper (P = 0,037, Tabell 3). ble observert haplotype distribusjons forskjeller i kategorien PN (P = 0,045, Tabell 3), CA hadde en større fordeling i N3 gruppen enn N0 gruppen sammenlignet med CG (OR = 1.837,95% KI: 1,010 til 3,341, P = 0,046 ), men det var ingen signifikante distribusjons forskjeller mellom N2 og N0 grupper og mellom N1 og N0 gruppene (P = 0,671 og p = 0,496, henholdsvis).
haplotyper i blokk 2 indikerte en signifikant forskjell i tumorrelaterte overlevelse. Pasienter som bærer CA haplotype hadde en dårlig magekreftspesifikk overlevelse (CG vs CA: HR = 0,645, 95% KI: 0,421 til 0,989, P = 0,044; Tabell 4).
Diskusjoner
Som vi har kjent, har FFPET-avledet DNA lavere utvinning effektivitet og kvalitet (fragmentert DNA) på grunn av delvis nukleinsyre kryssbinding og degradering enn blod-avledet DNA. Men arkiv FFPETs gir en uvurderlig kilde for molekylærgenetiske studier med flere fordeler som (i) den eneste typen prøver tilgjengelig for personer som ikke kan ellers gi en DNA-prøve, (ii) en utmerket ressurs for store retrospektive biomarkør studier ( iii) et stort antall prøver samsvar med langvarige kliniske oppfølgingsdata, (iv) en verdifull ressurs med diagnose og histologiske identifikasjon, (v) en tilgjengelig ressurs fra patologi arkiver. Nylig har FFPET ekstrahert DNA blitt rapportert å være tilstrekkelig for genotyping, og har fått lov til biomarkør og funksjonell genomikk studier [23] -. [29]
MALDI-TOF MS metoden, som tilbyr omtrent 100% nøyaktighet for SNP genotyping, er for tiden regnet som en gullstandard [29], [30]. Genotyping av FFPET-avledet DNA ved MALDI-TOF MS har vist seg å være pålitelig og reproduserbar. Tidligere rapporter viste at det ikke var noen allelisk frekvensforskjeller mellom FFPET-avledet DNA og blod-avledet DNA fra det samme individ, inkludert MALDI-TOF MS [24] via flere metoder – [26], [28]. Vår innsats viste høy suksessrate varierer mellom 96,29% og 100% (gjennomsnitt: 99,09%), noe som var i samsvar med tidligere rapporterte data [23], [24], [29]
SNPs er stabilt arvet. , svært rikt og vise mangfoldet innen og mellom populasjoner, som antas å være attraktive biomarkører. Imidlertid har anvendelsen av de enkelte SNP vært begrenset fordi de er lite pene og deres virkninger er relativt vanskelige å identifisere [5], [31]. Derfor har betydningen av haplotype informasjon vært økende for å koble DNA-sekvensvariasjon med sykdom [32]. Artikler har rapportert at funksjonelle SNP i HPSE var assosiert med heparanase uttrykk forskjeller og heparanase er blitt vist å være nært involvert i den patologiske prosess, progresjon og utfallet av sykdommen [10], [22]. Hvordan å innlemme SNPs, men i studier om magekreft predisposisjon og prognose, og hvordan du finner de virkelige foreninger er fortsatt utfordrende oppgaver.
Det var ingen enkelt SNPs korrelert til magekreft risiko i våre resultater. Assosiasjonene mellom fire individuelle SNPs (rs4328905, rs4693608, rs11099592 og rs6856901) og magekreft risiko med 155 pasienter og 204 kontroller rapportert av Yue et al. [20] var i overensstemmelse med våre resultater. Videre alle seks vanlige haplotyper hadde ingen signifikante forskjeller i magekreftrisiko. Dette konsistens viste SNPs i HPSE hadde ingen sammenheng med forekomsten av magekreft i etniske Han-Nord kinesisk, ikke bare fra perspektivet til individuelle SNPs, men også fra perspektivet til haplotyper.
I denne studien, genotype rs4364254 TT var korrelert til godt celledifferensiering. I tillegg Ostrovsky et al. [22] fant personer med genotype TT besatt relativt høye mRNA nivåer (P = 0,0029). Imidlertid har det vært motstridende resultater rapportert om sammenhenger mellom heparanase uttrykk og histologisk differensiering. Endo K et al. [33] fant at histologisk differensiering var verre i heparanase mRNA-positive mage kreft vev (p 0,01). Chen JQ et al. [34] fant at histologisk differensiering ikke var relatert til heparanase mRNA uttrykk i magekreft (P = 1,000). Takaomi Ohkawa et al. [35] har vist at heparanase ekspresjon ble påvist som sterkere i godt differensierte celler (P = 0.0277), som er et funn som consistents med våre resultater. Derfor heparanase kan være involvert i celle-differensiering, men mekanismene har ikke klart i det foreliggende
I univariat analyse, pasienter bærende rs4693608 AA genotype hadde en dårlig overlevelse (p = 0,049).; i multivariat analyse, rs4693608 AA og rs4364254 TT begge var signifikant korrelert med dårlig overlevelse (P = 0,030 for rs4693608 AA og P = 0,013 for rs4364254 TT). Muligens, fravær av konsensus i univariat og multivariat analyse var på grunn av den svake effekten av den enkelte SNP, men når den enkelte SNP ble ansett sammen med den andre SNP, Borrmann typen, PT kategori, og pN kategori i multivariat analyse, det genereres en innflytelse på prognosen. Det er rikelig med bevis som tyder på at genetiske faktorer bidrar til sykdomsprosessen i vanlige komplekse egenskap sykdommer, men effekten av en enkelt variant er trolig liten [36]. Dessuten Ostrovsky et al. [37] tilveiebragt en første bevis på korrelasjon mellom funksjonelle SNPs rs4693608 og rs4364254 og risiko for akutt graft-versus-vert-sykdom (GVHD) utvikling, og den rs4693608 var den viktigste. Deres resultater ble henhold til våre. I tillegg Ostrovsky et al. [22] rapportert både rs4364254 TT genotype og også rs4693608 AA-genotype var korrelert til en forholdsvis høy mRNA nivå (P = 0,0029 og 0,004, respektivt), som kan delvis forklare en dårligere prognose i pasienter med rs4693608 AA eller rs4364254 TT i denne studien . Disse observasjonene var biologisk plausibel grunn overekspresjon av HPSE var nært forbundet med større invasivitet av magekreft [38] – [40]. De foreliggende resultatene viste vår antagelse at SNPs var involvert i reguleringen av heparanase uttrykk, og dermed påvirke invasjon evne og overlevelse i magekreft.
Selv om verken genotype rs11099592 CC heller rs4693608 AA viste en statistisk forskjell i Borrmann type, haplotype CA komponert med dem gjorde viser en betydelig forskjell. Haplotype CA hadde en større fordeling i gruppen av Borrmann typene 3 og 4 (P = 0,037). Kanskje pasienter med haplotype CA var mer sannsynlig å utvikle en dårligere generell type. Dessuten haplotype CA hadde en større fordeling i N3-gruppen (p = 0,046, sammenlignet med N0 gruppe). Men det var ingen signifikante distribusjons forskjeller mellom N2 og N0 grupper og mellom N1 og N0 grupper. Kanskje var det en sammenheng mellom haplotype CA og større antall lymfeknutemetastaser, men det er behov for videre studier. Videre pasienter bærende CA haplotype viste også dårlig gastrointestinal cancer-spesifikk overlevelse, som var i overensstemmelse med forskjellene i Borrmann typen og antall av lymfeknutemetastaser. Videre Ostrovsky et al. [22] rapporterte at rs11099592 CC genotype og rs4693608 AA genotype ble korrelert til høy mRNA uttrykk (P = 0,0167 og P = 0,004, henholdsvis), som var i samsvar med våre resultater om haplotype CA. Kanskje den absolutte risikoen knyttet til hver av SNPs var lav, men kombinert haplotype analyse kan være mer nyttig for å identifisere personer med høy risiko for progresjon av sykdommen. Kanskje var det bestemte haplotyper som spiller en betydelig rolle i magekreft invasjon og metastasering, videre påvirker prognosen.
En funksjonell haplotype blokk bestående av rs11099592 og rs4693608 ble funnet i våre resultater, som ble assosiert med Borrmann type, pN kategori og prognose av magekreft. På den ene side er SNP rs11099592 en A-G substitusjons nonsynonymous SNP lokalisert i ekson 8, og denne endring resulterer i en arginin-til-lysin erstatning ved posisjon 307, kanskje fører til en funksjonell forskjell i proteinet. På den annen side er SNP rs4693608 plassert i intron 3 og viste en sammenheng med overlevelse. Økende mengder av bevis indikerer at genomisk varianter i ikke-kodende sekvenser kan endre ekspresjon av genprodukter ved å endre genregulering, ekson skjøting, mRNA-stabilitet, kryptiske spleiseseter aktivering og så videre, som kan derfor forårsake sykdom fenotyper. Dessuten kan haplotyper gi mer relevant informasjon enn individuelle SNPs [7], [41]. Videre, uansett om gentranskripsjon, opprettholdelse av cellulær differensiering og induksjon av en invasiv metastatiske fenotype er på grunn av den direkte interaksjon av heparanase med DNA er ennå ikke demonstrert.
Ostrovsky et al. [22] viste viktig sammenheng mellom kombinerte genotyper for rs4693608 og rs4364254 SNPs og heparanase mRNA uttrykk nivå. Videre deles de alle kombinert genotyper inn i tre undergrupper (LR-lav uttrykk, MR-mellom uttrykk, HR-high uttrykk) i henhold til heparanase mRNA uttrykk nivå på hver genotype, og de bekreftet betydelige forskjeller mellom tre undergrupper av kombinerte genotyper transportører og mRNA nivåer. Dessuten Ostrovsky et al. [37] første funnet sammenhenger mellom kombinerte genotyper for rs4693608 og rs4364254 SNPs og risiko for akutt GVHD utvikling i sine følgende studie med dette undergrupper analysemetode. Det er en viktig og verdifull metode. Dessuten er denne metode som er nyttig for risiko prediksjon forbundet med haplotype tilnærming i å følge klinisk praksis. Vår fremtid studien, som er koblet mRNA uttrykk nivå til genotyper eller haplotyper i HPSE av Han befolkningen i Nord-Kina, vil bruke denne metoden.
Fordi størrelsen på utvalget av villtype homozygot var relativt for liten for stratifisert analyse på hver genotype av alle seks SNPs undersøkt i vår studie, kan vi ikke vise resultatene av SNP-analyse på hver genotype, men vi gjennomført analyse kombinert heterozygote med villtype homozygot. Det var en begrensning av denne studien.
I konklusjonen, denne studien vurderes polymorfismer av HPSE genet i magekreft med en MALDI-TOF MS metode og arkivert FFPETs i et stort nord kinesisk case-kontrollerte kohort. Vi fant en funksjonell haplotype blokk bestående av rs11099592 og rs4693608, som ble assosiert med Borrmann type, pN kategori og prognose; og SNP rs4693608, som var inkludert i blokken, viste en sammenheng med overlevelse. Disse resultatene støttes av assosiasjoner mellom SNPs i HPSE og mRNA uttrykk nivåer tidligere rapportert av Ostrovsky et al. [22]. I tillegg ble seks individuelle SNPs og haplotyper ikke korrelert til magekreft risiko. Disse resultatene var i samsvar med vår første antagelsen om at heparanase var involvert i kreft invasjon og metastasering og påvirket prognose til slutt, men det var ikke involvert i forekomsten av kreft.
Materialer og metoder
Prøvetaking
404 pasienter med histopathologically bekreftet magekreft som hadde fått radikal kirurgi mellom januar 1998 og desember 2004 ble fortløpende valgt. Pasientene var fra nordlige Kina og ble antatt å være gode representanter for denne regionen. 404 normale mage vevsprøver ble hentet fra et segment av resected prøvene lengst fra tumor ( 10 cm) og FFPETs ble arkivert i Kirurgisk onkologi Institutt for det første sykehuset i Kina Medical University i Nord-Kina. Alle prøver ble fiksert og forankret under standard kliniske histologiske forhold og ble lagret ved værelsestemperatur. Parafin deler av FFPETs ble farget med hematoxylin og eosin (H E) for patologisk undersøkelse for å bekrefte fraværet av tumorous vev. Svulsten histologisk grad ble vurdert i henhold til Verdens helseorganisasjon kriterier og svulster ble iscenesatt ved hjelp av syvende utgaven av TNM staging av International Union Against Cancer (UICC) /amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) system (2010) basert på postoperativ patologisk undersøkelse av prøvene. Komplett patologiske data ble oppnådd blant annet alder, kjønn, dato for operasjonen, plassering av primærtumor, histologisk grad, venøs invasjon, lymphovascular invasjon, dybden av invasjonen, antall LNS hentet, antall metastatiske LNS, og antall kreftforekomster hentet. De (i) med synkron eller metachronous ondartede svulster, (ii) med fjernmetastaser funnet preoperativt, (iii) som gjennomgikk preoperativ strålebehandling eller kjemoterapi, eller (iv) med ufullstendige patologiske data oppføringer ble ekskludert fra denne studien. Oppfølging ble gjennomført for hele studiepopulasjonen innen januar 2010. To pasienter døde i den postoperative perioden, og 21 pasienter ble tapt under oppfølging, derfor 381 pasienter ble inkludert i overlevelsesanalyse. Median og gjennomsnittlig oppfølgings perioder var 90,0 måneder og 93.3 ± 20,24 måneder (variasjon: 61-136 måneder), henholdsvis. Følgende data ble innhentet for alle pasienter: dødsdato (hvis aktuelt), dødsårsak (hvis aktuelt), og dato for oppfølging. Det primære endepunktet var årsaksspesifikk overlevelse varighet fra dato for magekreft diagnose til dødsdato. Den 5-års overlevelse av de 404 pasientene var 54,2%.
404 blodprøver ble hentet fra kreftfrie personer som ble tilfeldig valgt basert på fysiske undersøkelser i løpet av desember 2009 til august 2011, som kontrollgruppen, og denne gruppen ble antatt å være en god representasjon av befolkningen i Nord-Kina. Utvalgskriteriene inkluderte ingen individuelle historie av kreft, frekvens matchende saker om kjønn og alder, og personene var urelaterte etniske Han-kinesere. Prøvene (etylendiamintetraeddiksyre [EDTA] antikoagulere) ble lagret ved -20 ° C i løpet av 30-40 minutter, og deretter flyttet til en fryser ved -80 ° C i løpet av 2 eller 3 dager etter samling.
studien ble godkjent av forskningsetiske komité for Kina Medical University, Kina. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter før du deltar i studien.
DNA-ekstraksjon
Genomisk DNA ble ekstrahert fra FFPET prøver i saken gruppen. Seksjoner med en tykkelse på 8 um og et overflateareal på opp til 250 mm
2 ble fremstilt med en mikrotom og DNA ble isolert fra 6 til 12 deler, avhengig av vev størrelse og celletellinger den. Mikrotomen ble rengjort og kniver ble endret for å unngå intersample forurensning. DNA-ekstraksjon fra FFPETs ble utført med QIAamp® DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden) [29], fremgangsmåtene beskrevet av produsenten, inkludert (i) oppløses parafin i xylen og fjerne, (ii) Lyse prøven under denaturering betingelser med proteinase K, (iii) å reversere formalin tverrbindende inkubering ved 90 ° C, (iv) binder DNA til membranen og tillater kontaminanter å strømme gjennom, (v) å vaske gjenværende forurensninger, og (vi) eluere ren og konsentrert DNA fra membranen (med tris-EDTA buffer [TE]). Omtrent 2-10 ug DNA ble utvunnet i 50 ul sluttløsning og ble lagret ved -80 ° C.
Genomisk DNA ble ekstrahert fra blodprøver fra kontrollgruppen med den universelle Genomisk DNA Extraction Kit Ver.3.0 (TAKARA) i henhold til produsentens instruksjoner. Om 2-6 ug DNA ble gjenfunnet i TE og ble lagret ved -80 ° C.
Valg av SNPs og genotyping
Studien inkluderte seks SNPs i HPSE, som ble tatt fra NCBI SNPs database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) og HapMap database (fase III-database) (https://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.zh ). Disse SNP ble kartlagt i HPSE-genet (figur 2). rs 11099592 var unik, ikke bare med en mindre allel frekvens (MAF) 1%, men også som polymorfe i Han Kina Beijing (HCB) populasjonen blant alle kodende region SNPs (cSNPs) i HPSE, som ble registrert i databasene. I tillegg ble andre fem SNP’er lokalisert i intronic og 3′-UTR regioner. Videre har andre forskere vist at rs11099592, rs4693608, og rs4364254 ble korrelert med heparanase mRNA-ekspresjon [22]. Også assosiasjoner mellom individuelle SNPs eller haplotyper i HPSE og mottakelighet, clinicopathological parametre og prognose av svulst rapportert i disse artiklene var komplisert, men for det meste konsentrert om seks SNPs vi valgte [17] -. [22]
SNPs ble genotypet ved hjelp av MALDI-TOF MS system (MassARRAY; Sequenom, San Diego, CA, USA) med primere og prober (Tabell S6) som tidligere beskrevet [29], [42]. For å sikre skrivekvalitet, 1% positive prøver (Yanhuang celle-stamme) ble inkorporert i hver genotyping plate for å validere påliteligheten av primere og 1% negative prøver (vann uten DNA) for å overvåke forurensning. 5% tilfeldige prøver ble testet i duplikat ved forskjellige personer og reproduserbarheten var 100%. Laboratoriepersonalet ble blindet til prøven arrangement under prosessen. Det var seks trinn, blant annet PCR forsterkning, reker alkalisk fosfatase behandling, basen forlengelse, salt fjerning med harpiks, SpectroCHIP doserings (Sequenom, San Diego, CA, USA), og data oppkjøp med MALDI-TOF MS ifølge Justenhoven et al. [43]. Til slutt ble dataanalyse utført ved hjelp MassArray Typer Analyzer programvare 4.0.4.20 (Sequenom, San Diego, California) [44].
LD blokk besluttsomhet og haplotype bygging
Haploview 4.2 programmet ble brukt til evaluere LD og konstruere haplotyper [31]. LD mellom de seks SNPs som brukes i haplotype analyse ble målt ved en parvis D «statistikk. Strukturen av LD blokken ble undersøkt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge Gabriel et al. [45], ved hjelp av 80% tillit grenser D «for å definere områder av historisk rekombinasjon mellom SNPs. Haplotyper ble konstruert fra genotype data i full størrelse case-control panel i blokker ved hjelp av en akselerert forventning-maksimering algoritme metoden [46]. Kort fortalt, skaper denne metoden svært nøyaktige befolkningen frekvensestimater av de fases haplotyper basert på den maksimale sannsynligheten som bestemmes fra unphased inngang [47].
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble foretatt ved hjelp av PASW Statistikk 18,0 programvare (SPSS, Inc., Somers, NY, USA). En tosidig kji-kvadrat (χ2) test ble brukt for å estimere populasjonsdistribusjonskarakteristika, sammenligne forskjeller i allel og genotypiske frekvenser mellom saker og kontroller og vurdere sammenhenger mellom individuelle SNPs og clinicopathological parametere. En permutasjon prosedyre (1000 prøver) ble brukt til å korrigere den P-verdi av enkelt-locus foreningen resultater. Odds ratio (OR) og konfidensintervall (KI 95%) ble beregnet ved ubetinget logistisk regresjon for å analysere sammenhengen mellom genotypefrekvensene og magekreft risiko, og ble justert for kjønn og alder. Univariat og multivariat overlevelsesanalyse var ferdig med log-rank test og Cox modell ved hjelp av clinicopathological parametere og SNPs. Dette resulterte i identifisering av kovariabler som signifikant korrelert med overlevelse av pasientene. Multivariat overlevelsesanalyse ble utført ved separat tilsetning av SNP variabler til alle clinicopathological parametere. En Kaplan-Meier metoden ble brukt for å kartlegge overlevelseskurver. Den Haploview 4,2 programvarepakken ble brukt til: estimat parvis koblingsulikevekt (LD), oppdage avvik fra Hardy-Weinberg likevekt, konstruere haplotype og beregne haplotype frekvenser og estimat assosiasjoner mellom haplotyper og magekreft risiko. Den Haplo.states programmet ble brukt til å vurdere sammenhenger mellom haplotyper og clinicopathologic funksjoner [31]. Den THEsias programvare basert på Cox overlevelse regresjon i haplotype-baserte krets analyse ved hjelp av stokastisk-EM-algoritme ble anvendt for å fremstille overlevelse analyse av haplotypene [48]. Vi takker også College of China Medical University for teknisk assistanse i eksperimenter.
