Abstract
Autophagy er beskrevet til å være involvert i homeostase, utvikling og sykdom, både som en overlevelse og en dødsprosess. Sitt engasjement i celledød utgår fra sammenhengen med den apoptotiske sti. Vi har fokusert på overlevelse autofagi og etterforsket sine samspill med apoptotiske maskineriet. Vi fant at mens Mcl-en holdt seg ineffektiv, Bcl-2 og Bcl-xL var nødvendig for sultet celler for å vise en fullt funksjonell autophagic sti som vist ved proteolyse aktivitet og påvisning av autophagic vesikler. Slike pro-autophagic funksjoner av Bcl-2 og Bcl-xL var uavhengig av Bax. Men de syntes å operere gjennom ikke redundante mekanismer som BCL-xL utøvet en strammere kontroll enn BCL-2 over reguleringen av autophagy: i motsetning BCL-2, Bcl-xL og Atg7 manipulasjon ga identiske fenotyper som tyder på at de kan være komponenter av samme signal sti; BCL-xL subcellulære lokalisering ble endret på sult, og viktigst BCL-xL handlet uavhengig av Beclin 1. Still et intakt BH3-bindingssete var nødvendig for BCL-xL å stimulere til en fullt funksjonell autophagic veien. Denne studien fremhever at, i tillegg til deres veletablerte anti-død funksjon i løpet av apoptose, Bcl-2 og Bcl-xL har en større rolle i celleoverlevelse. Skulle BCL-2 og Bcl-xL stå ved korsveien mellom pro-overlevelse og pro-død autofagi, introduserer denne studien det nye konseptet at reguleringen av autophagy av Bcl-2 og Bcl-XL er justert i henhold til dens overlevelse eller døden utfallet
Citation. Priault M, Hue E, Marhuenda F, Pilet P, Oliver L, Vallette FM (2010) Differential Avhengighet Beclin en for regulering av Pro-Survival Autophagy av Bcl-2 og Bcl -xL i HCT116 tykktarmskreftceller. PLoS ONE 5 (1): e8755. doi: 10,1371 /journal.pone.0008755
Redaktør: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasil
mottatt: 15 september 2009; Godkjent: 15 desember 2009; Publisert: 18 januar 2010
Copyright: © 2010 Priault et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE (INSERM), den Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Université de Nantes, Université de Bordeaux, Conseil Regional d’Aquitaine (til UMR 5095), og Agence Nationale pour la Recherche (prosjekt MABA til FV). Smp ble støttet av en post-doc fra INSERM. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Macro-autofagi (heretter kalt autofagi) er en katabolsk prosess orkestrert av de evolusjonære konservert
ATG
gener (for autofagi) [1], [2], og består i tilfeldig lagring av makromolekyler av nydannede doble eller flere membranbundne vesikler kalt autophagosomes. På grunn av deres størrelse (vanligvis mellom 500 til 1500 nm i pattedyrceller) [3], [4], autophagosomes kan omslutte løselig materiale så vel som hele organeller. Degradering av lasten oppnås etter begynnende autophagic vakuoler er smeltet sammen med lysosomer [5]. De resulterende produktene er da tilgjengelig for gjenvinning i biosyntetiske reaksjonsveier; således autofagi er en av de viktigste lysosomale trasé for biologisk materiale omsetningen.
Autophagy ble først karakterisert som en mekanisme for å overleve, siden det gjør det mulig for cellene å overvinne stringente betingelser for derved å forlenge levetiden. Ved sult, mutasjoner i
ATG
gener føre til celledød i gjær, chlorosis i planter, og redusert voksen levetid i
daf-2
Caenorhabditis elegans mutant [1]. I pattedyr finnes autophagy på en basalnivået og kontrollerer homeostatiske funksjoner. Stimulering av autofagi var lenge kjent som en reaksjon på sult eller hormonell stimulering [6]; Imidlertid har nyere studier utvidet cytoprotective rollen autofagi til vedlikehold av celle levedyktighet ved å vise at
ATG
gener er nødvendig for å overleve i ulike settinger i pattedyr [7] – [10]. Forresten i disse arbeidene, ble autofagi elegant vist seg å være avgjørende for bioenergi vedlikehold og celleviabilitet in vitro, men også til å spille en viktig rolle i vivo i overlevelse av hele organismen.
I tillegg til dette fysiologiske rolle i vev homeostase, autofagi er også paradoksalt assosiert med celledød. Dette konseptet oppsto fra observasjonen at autofagi er vanligvis sett i døende celler når massive eliminering er nødvendig organer [11]. Eksistensen av «autophagic celledød» heller enn «celledød med autofagi» [12] ble langt avhørt fordi autofagi og apoptose er ofte aktiveres sammen som svar på stress [13] – [15] Selv om viser tydelige morfologi [16]. Direkte bevis for en
ATG
-avhengig celledød ble brakt både ved tap av funksjon studier som viser at nedregulering av
ATG7
eller
ATG5
kunne undertrykke celledød i apoptose-mangel celler [17], [18], og også av over-uttrykk eksperimenter som viser at ektopisk uttrykk for mutanter av
ATG6 Twitter /Beclin en kan utløse autofagi stimulering som resulterte i
ATG5
-avhengig celledød [19]. Således kan autophagy tenkes som et alternativ død program, i det minste i celler med nedsatt apoptose maskineri. Likevel, hvis autophagic død er nå anerkjent, er fortsatt ukjent som (i) ingen definitive bevis på autofagi som den primære initiativtaker til død har blitt rapportert, og (ii) bevis årsaks begivenhet for sin debut mangler fortsatt av en stimulus som ville skew pro-overlevelse autofagi til en dødelig program.
Mer nylig har felt av interesse for autophagic celledød utvidet på grunn av funn at autofagi deregulering er innblandet i kreft, og fordi molekylære interplays har sannsynliggjort en crosstalk mellom apoptose og autofagi [20]. Derfor er skjebnen til cellene utvilsomt styrt av koordinert regulering av apoptose og autofagi, men når og hvor er fortsatt uløste spørsmål [21], [22]. En avgjørende gjennombrudd med hensyn til dette sistnevnte punkt var det funn at nøkkelen regulator av autophagy Beclin en havner en BH3 domene [23] som bindes til BH1-BH2 domener av anti-apoptotiske Bcl-2 [19] eller Bcl-xL [24 ]. Fortløpende, ble grundige analyser av reguleringen av autophagy av Bcl-2 og Bcl-xL foretatt og viste at deres binding til Beclin 1 resulterte i inhibering av autophagy. Denne bindingen ble opprinnelig foreslått å avlede Beclin en i å samhandle med og stimulerende klasse III phosphatidylinositol-3-kinase Vps34 aktivitet [19], men en konsensus argumenterer nå mot et gjensidig utelukkende interaksjoner av Beclin en med BCL-2 og Vps34 [24] – [26], og understreker at autophagic aktivitet ikke er utelukkende drevet av Beclin en forening med BCL-2 /BCL-xL. Følgelig Zeng et al. har rapportert miljøer hvor Beclin en ikke binder BCL-XL eller BCL-2 [27], viser at disse interaksjonene er ikke forplikte. Alle disse observasjonene tyder på at den funksjonelle relevansen av BCL-2 /Beclin en eller BCL-XL /Beclin 1 interaksjoner ikke er fullt ut forstått ennå. Enda mer, visning av Bcl-2 som et anti-autophagic protein [28] – [30] ble utfordret av det funn at over-ekspresjon av Bcl-2 i apoptose-manglende celler kan i stedet potensere autofagi [18]
for ytterligere å undersøke dette temaet, bestemte vi oss for å utforske autophagic funksjoner av BCL-2 familiemedlemmer under forhold hvor autofagi stimulering fungerer som en overlevelse prosess: ligner på det som ble observert med døden fremmende autofagi, fant vi at overlevelse autofagi er spesielt viklet med anti-apoptotiske funksjoner av Bcl-2 og Bcl-xL; Men interessant nok, de ble begge funnet å stimulere autofagi og utstilt annen avhengighet Beclin en å spille slike pro-overlevelse funksjoner.
Resultater
Sult-Induced Autophagy er en overlevelse Process i HCT116 Cells
striden om den pro-overlevelse [7], [10] eller pro-død [17] – [19] utfallet av manipulering av autophagy etter nærings begrensende forhold har vært drevet av konfrontasjon av flere studier . Derfor må vi først satt ut for å ta opp skjebnen til sultet celler i våre innstillinger: kolorektal HCT116-celler ble valgt som de dukket opp, blant alle cellelinjene vi har testet, for å vise den sterkeste autophagic respons når konfrontert til næringsbegrensning (vår upublisert data ). Cellene ble overført til sult medium og etterfulgt av video mikroskopi i løpet av 48 timer. Morfometriske analyser (Fig. 1A) viste at HCT116 foreldre celler vises stort sett apoptotiske funksjoner (~55%) som bekreftes av caspase 3 aktivering (Fig. 1B) mens ~ 30% gikk en standard død som følge av en rask osmotisk død (innen 20 til 30 minutter etter løsgjøring fra platen), og mindre enn 5% forble i live. HCT116-BaxKO kloning ble også analysert for å analysere resultatet av sult i apoptose manglende celler: som forventet morfometrisk analyse (Fig. 1A) og western blot (Fig. 1B) ikke klarte å oppdage eventuelle apoptotisk funksjon, og vi observert at brøkdel av celler gjennomgår den osmotiske død forble uendret (~ 30%). Interessant nok en annen fenotype dominerte som mer enn 50% av HCT116-BaxKO cellene løsnet fra platen, men opprettholdt levedyktighet ettersom de utvinnes normal tilslutning og proliferasjon når de overføres tilbake til fullstendig medium (Fig. 1C). Av notatet, kan disse frittliggende cellene ikke hensyn til mitotiske celler etter 48 timer med sult siden næringsstoff begrensning er kjent for å indusere en rask cellesyklus arrest [10], [31]. Å konstatere at dette reversibel «stasis state» var relevant for autophagic metabolsk hvile fenotype Lum et al. har beskrevet [10], ved analysert vi kravet til en funksjonell autophagic maskineri. Autophagy bruker to ubiquitin-lignende konjugering systemer for autophagosomes fullføring, som både involverer Atg7, et protein som minner om de E1 ubiquitin-aktiverende enzymer [32] som er essensielle for autofagi [33]. Som et resultat er Atg5 konjugert til Atg12 når autofagi er aktivert; western blot viste at sult massivt indusert autofagi i HCT116 BaxKO kloning i forhold til foreldre celler (Fig. 1B). Genetisk nedsatt autofagi ble også utført med shRNA målretting av Atg7, og sultet HCT116-BaxKO shAtg7 celler ble funnet å gjennomgå massive osmotisk celledød (~80%) på grunn av defekte inntreden i autophagic stasis tilstand (mindre enn 5%) (fig . 1A), noe som bekreftes av den dramatiske reduksjon i Atg5-Atg12 konjugat i disse cellene (fig. 1B). Den stasis tilstand var dermed avhengig av autofagi og viste et middel for å holde døden i sjakk. Vi konkluderer med at selv om forbigående fordi cellene til slutt dø hvis sult er forlenget, overfører autofagi en overlevelsesfordel i våre innstillinger.
(A) Morfometrisk analyser av celler sultet i 48 timer. Celler ble sådd i fullstendig media og time-lapse video mikroskopi ble startet ved overføring til HBSS. Levedyktige celler er definert som adherente celler, blir apoptotiske celler definert som celler som oppviser flere membran blebs, død etter tap av osmotisk integritet er definert som celler som viser svellingen av en enkelt bleb, og stasis celler er definert som celler som har løsrevet fra underlaget men opprettholde plasmamembran integritet. Et minimum av 700 celler ble analysert i løpet av triplikate eksperimenter. Skala: 50 mikrometer. (B) Western blot som viser kaspase 3 aktiveringen og Atg5-Atg12 konjugat i hele celler ekstrakter fra celler sultet i de angitte tidsrom. (C) De ikke-adherente HCT116-celler fra BaxKO 24 timer-sultet kulturer ble oppsamlet og overført til fullstendig medium. Cellene fikk lov til å følge i 6 timer, deretter time-lapse video mikroskopi ble startet i 48 timer. Skala:. 100 mikrometer
Den autophagic Beholdere av tykktarms HCT116-celler er uavhengig av Bax
Det forrige forsøket antydet at når celler kan utføre både apoptose og autofagi, apoptotiske fenotyper råde over autophagic funksjoner. Vi var derfor opptatt av muligheten for at autophagic respons kan faktisk bli svekket ved utførelsen av apoptose. For å løse dette spørsmålet, har vi sammenlignet autophagic kapasitet på HCT116 og HCT116-BaxKO celler under forhold hvor macroautophagy er den dominerende form for protein nedbrytning, nemlig etter 6-9 timer med sult [34]. Fig. 2A viser nedbrytning av L – [
14C] valin-merket langlivede proteiner. Den basale proteolyse målt under kontroll forhold var sammenlignbare i begge cellelinjer og henholdsvis angis som intern referanse (hvite søyler). Sult tilsvar resulterte i en to-fold økt proteolyse i begge cellelinjene (svarte søyler). Dette proteolyse var (i) i det vesentlige lysosomal siden bafilomycin A1 (Baf A1, en inhibitor av lysosomal ATPase protonpumpe) fullstendig forhindret dets forstørrelse (mørk grå søyler), og (ii) i forbindelse med autophagy siden dens stimulering ble betydelig reversert ved tre-MA (lys grå søyler). Som en kontroll, en apoptotisk induksjon av etoposid over samme periode stimulerte ikke noen proteolyse (skraverte søyler). Vi har også analysert omdannelsen av cytosolisk Atg8 /LC3-I inn i autophagosome-bundet konjugat fosfatidyletanolamin LC3-II, som er et av kjennetegnene til autophagy. Western blot (Fig. 2B) bekreftet at HCT116 og HCT116-BaxKO både produsert sammenlignbare mengder av LC3-II ved sult. Den diffuse cytosolic av punktformet lokalisering av mCherry-LC3 ble også overvåket i mus embryonale fibroblaster (MEFs) som et alternativ cellelinje, og viste at sult utløste samme autophagosomal relocalisation av LC3 i villtype MEFs og Bax banket ut MEFs (Fig . S1). Til sammen våre forsøk viser at apoptose henrettelsen ikke svekker autophagic respons, og vi konkludere med at autophagic kapasitet er uavhengig av Bax
(A) HCT116 og HCT116-BaxKO celler ble inkubert med L -. [
14C] valin, og jaget i 9 timer i komplett medium (hvite søyler), HBSS (svarte striper) eller HBSS supplert med enten 0,1 mikrometer Baf A1 (mørk grå søyler) eller 10 mm 3-MA (lys grå søyler), eller i komplett medium 20 uM etoposid (skraverte søyler). Resultatene rapporterer stimulering av proteolyse i forhold til de respektive basalnivåer målt under ikke-sultende betingelser (hvite stolper). Verdiene er middelverdi på minst 3 uavhengige eksperimenter ± S.D. (B) Western blot og kvantifisering av omdannelsen av LC3-I til fosfatidyletanolamin-konjugert LC3-II. Celler ble dyrket i fullstendig medium eller sultet i 9 timer i nærvær av E-64d (20 ug /ml) og leupeptine (20 ug /ml) for å forhindre nedbrytning av intra-autophagosomal LC3-II. 150 mikrogram hele cellelysat ble lastet på 15% SDS-PAGE. * Student test p. 0,02
Ektopisk Uttrykk av Bcl-2 og Bcl-xL, men ikke Mcl-en, Stimulerer Autophagy
Det siste resultatet gitt jording for vår vedtak om å bruke apoptose-mangelkloning HCT116-BaxKO å ta opp regulering av pro-overlevelse autofagi av anti-apoptotiske proteiner, mens skille bidraget av BCL-2 familiemedlemmer til apoptose. HCT116-BaxKO-celler ble transfektert med plasmider som koder for enten Bcl-2, Bcl-xL eller Mcl-1, noe som resulterer i henholdsvis 9, 2 og 3 proteinet økning ganger (fig. 3A). Sult ikke endre uttrykket profiler (fig. S2). Videomikroskopi av sultet celler viste at over-ekspresjon av Bcl-2 og Bcl-xL betydelig økt antall celler som kommer inn i autophagic stasis tilstand (fig. 3B, henholdsvis 88% og 82%), mens Mcl-1 overekspresjon utvidet i stedet antallet levedyktige adherente celler (fig. 3B, hvit bar = 48%). Dermed Bcl-2 og Bcl-xL klart hatt en annen effekt enn Mcl-en på autofagi. Dette ble bekreftet av autophagic proteolyse (fig. 3C) og transmisjonselektronmikroskopi (TEM), karakterisert ved at nedbrytningsvesiklene var mer tallrike i celler som uttrykker Bcl-2 og Bcl-xL, mens de som uttrykker Mcl-1 holdt som ikke-transfekterte celler (Fig. 3D, og fig. S3 for forstørrelse); av notatet, av og til, omfattende vakuoliseringen dukket opp i cytoplasma av celler over-uttrykker BCL-XL (Fig. 3D, venstre panel). Når vi brukte BaxKO MEFs og overvåket mCherry-LC3 fluorescens mønster, har vi funnet at relocalisation av proteinet mot punctate strukturer var signifikant stimulert i Bcl-2 eller Bcl-xL transfekterte celler (fig. 3E), og viser dermed at fenomenet ble konservert i en alternativ cellelinje. Alle gullstandardteknikker brukt så langt enstemmig viste at bare autophagic vesikler (AVS) er påvirket av BCL-2 eller BCL-xL overuttrykk mens andre lipidic vesikler som multi-vesikulær kropper ikke er; Derfor brukte vi monodansylpentane (MDH) [35] (et lipofilt fargestoff som allerede vist seg å flekk Avs [36]) for å kjøre IT-baserte analyser av AVS, måle deres størrelse, og bestemme deres frekvens for påvisning (figur S4.): sultet HCT116-BaxKO celler transfektert med Bcl-2 eller Bcl-xL avslørte en økning av antallet AVS, korrelert med en øket hyppighet av utseende av større AVS, noe som blir dobbelt så stor som klassiske autophagosomes som bekreftes av sporadisk TEM. På motsatt, Mcl-1 transfekterte celler var ikke statistisk forskjellig fra ikke-transfekterte celler. Derfor konkluderer vi med at, mens Mcl-en ikke spiller en viktig rolle i overlevelse autofagi, Bcl-2 og Bcl-xL spesifikt stimulere autophagic kapasiteten og øke AVS antall og størrelse.
(A) Western blot av celler transfektert med tom vektor eller vektorer som koder Bcl-2 eller Bcl-xL eller Mcl-1. 50 ug av proteinekstrakter ble analysert på en 12% SDS-PAGE. Mcl-1 ble detektert som et modent protein (m), en spleiset variant (e) og en caspase-spaltet produkt (c). (B) Morfometrisk analyser av HCT116-BaxKO-avledet stabile cellelinjer: celler ble sådd ut i komplett media og time-lapse video mikros startet da cellene ble overført til HBSS (sult) eller ikke (komplett). Et minimum av 700 celler ble analysert i det minste i triplikate eksperimenter. (C) Relativ stimulering av sult-indusert 3-MA-sensitive nedbrytning av langlivede proteiner i HCT116-BaxKO cellelinjer transfektert eller ikke med BCL-2 eller BCL-XL eller Mcl-en. Celler ble jaget i 6 timer i HBSS eller HBSS + 3-MA. Det 3-MA følsomme aktivitet målt i HCT116-BaxKO-celler ble satt til 1, og resultatene representerer 3-MA sensitive aktiviteter av hver cellelinje i forhold til det som finnes i ikke-transfekterte celler. Dataene er gjennomsnittet (± s.d.) På minst 3 uavhengige eksperimenter. Student-testen ble anvendt for signifikans statistikk av resultatene sammenlignet med ikke-transfekterte celler: (*) p = 0010 (**) p = 0001 og (***) p = 0479. (D) TEM av HCT116-celler BaxKO over-uttrykker Bcl-2 eller Bcl-xL eller Mcl-1 etter 6 timers sult i HBSS. Piler peker på nedbrytende autophagosomes. Skala: 2 mikrometer. (E) 24 timer etter transfeksjon enten med mCherryLC3 alene, eller sammen med mCherryLC3 and Flag-BCL-xL eller Flag-BCL-2, BaxKO MEF celler dyrket i komplett medium eller sultet i 6 timer ble fikset. Immonocytochemistry avslører Flag-merket konstruksjoner (grønt). Bilder er representative for minst 4 uavhengige eksperimenter. Skala:. 10 mikrometer
nedregulering av BCL-XL er en mer potent hemmer av Autophagy Enn Den i BCL-2
Vi neste undersøkt effekten av BCL-2 og BCL-xL nedregulering i forhold til at av Atg7 i sultet celler. En multiplisitet for infeksjon (MOI) på 4 forårsaket minst 90% stanse av mål-gener (fig. 4A) uten noen krysseffekten på hverandre (ikke vist). I løpet av den tidsramme av forsøket, levedyktigheten av transduserte celle holdt seg på kontrollverdier ( 90%, data ikke vist) både i fullstendig medium eller etter 6h sult. TEM viste at dobbelt membran bundet vesikler var knapt synlig i sultet celler hvor BCL-2, Bcl-xL eller Atg7 hadde blitt nedregulert i forhold til SCR transduced celler (Fig. 4B). Plasmidet brukes til transduce den shRNAs koder grønt fluorescerende protein (GFP), og vi kunne dermed korrelere effektiviteten av infeksjon med autophagic respons avslørt av mCherryLC3 lokalisering (Fig. 4C). Ved sult, celler som viser en høy grad av transduksjon med shAtg7 (svært GFP-positive celler) viste en diffus cytosolic fordeling av mCherryLC3 viser at autofagi ble effektivt svekket, mens ikke omsatte celler vises punktat mCherryLC3 organisasjon. I holde, sultet celler hvor shBcl-2 eller shBcl-XL hadde blitt effektivt omsatte viste en diffus mCherryLC3 flekker, selv om shBcl-XL reproduserbart utløste en sterkere hemmende fenotype enn shBcl-2. Således, Bcl-2 eller Bcl-xL nedreguleringen hadde en hemmende effekt på autophagy, men dette eksperiment kan indikere at Bcl-2 og Bcl-xL ikke kan være helt overflødig for den molekylære kontroll av overlevelse autophagy. I et forsøk på å kvantifisere en slik forskjell, vi endelig analysert sult-indusert proteolyse av shRNAs transduserte celler: for en MOI på 4, Bcl-2 slått ned cellene beholdt 75% av 3-MA følsom proteolyse i forhold til en krafse shRNA (SCR). Dette platået var allerede nådd med en MOI av to og forble uendret selv om høyere Mois (ikke vist). I motsetning til dette, Bcl-xL og Atg7 lyddemping redusert nedbrytningshastigheten henholdsvis 15 og 17% (fig. 4D). Derfor Bcl-2 og Bcl-xL knock-down begge hadde en overbevisende hemmende effekt på autophagic proteolyse. Imidlertid vil bare Bcl-xL nedregulering etterlignet det av Atg7 og viste seg å være et nøkkelmolekyl kontroll av autophagy.
(A) Western-blots av HCT116-BaxKO celler infisert med økende mengder av virale partikler transduse shRNA mot Bcl- 2, BCL-xL eller Atg7, eller et egge shRNA (SCR). Total proteinekstrakter ble utført, og 50 ug proteiner ble analysert på SDS-PAGE. (B) HCT116-BaxKO celler infisert med viruspartikler som bærer shRNA mot BCL-2, Bcl-xL eller Atg7 med en MOI = 4 ble analysert for autophagic nedbrytning av langlivede proteiner kort tid etter smitte. Celler ble jaget i 6 timer i HBSS eller HBSS + 10 mm 3-MA. 3-MA følsomme aktivitet målt i SCR-infiserte celler ble satt til 100%, og resultatene representerer 3-MA sensitive aktiviteter av hver infiserte cellelinje i forhold til det som finnes i SCR-infiserte celler. Dataene er gjennomsnittet (± s.d.) På minst 3 uavhengige eksperimenter. Når feilen ikke er angitt, bar var for små til å bli sett. (C) HCT116-BaxKO celler som er stabilt transfektert med mCherryLC3 ble infisert med viruspartikler som bærer shRNA mot Bcl-2, Bcl-xL eller Atg7 med en MOI = 4. Celler ble analysert for deres GFP fluorescens (infiserte celler) og LC3 relocalisation etter 6 timer med sult. Skala: 15 mikrometer. (D) TEM etter 6 timer med utsulting av HCT116-BaxKO cellene der BCL-2 eller BCL-XL eller Atg7 uttrykk ble stille. Skala:. 2 mikrometer
BCL-xL Regulerer Survival Autophagy Uavhengig av Beclin en
Studier rapporterer anti-autophagic funksjoner av Bcl-2 og Bcl-xL skildre forholdene der stimulert autofagi resulterte i celledød, og viste at deres binding til Beclin en blokkert utbruddet av autophagy. På motsatt, Zeng et al. rapporterte at i ikke-sultet U-251 glioblastom celler, verken BCL-2 eller BCL-xL var normale endogene bindende enheter for Beclin 1 [27], noe som tyder på at avhengig av innstillingene, blir disse proteinene ikke forplikte partnere.
i vårt paradigme cytoprotective autofagi, endogen Beclin 1 ble immunopresipitert fra kontroll eller sultet cellelysater (fig. 5A). BCL-2 ble effektivt trukket ned, men ikke BCL-XL; av notatet, gjorde BCL-2 /Beclin en forening ikke varierer i sultet versus kontrollceller. Det motsatte immunoprecipitation av endogen BCL-2 bekreftet disse observasjonene, mens BCL-xL igjen ikke klarte å trekke ned noen påviselig Beclin 1. Disse eksperimentene støtte en differensial regulering av pro-overlevelse autofagi av Bcl-2 og Bcl-xL, men ytterligere eksperimenter var nødvendig for å forsikre seg om at BCL-xL handlet uavhengig av Beclin 1. subcellulære fraksjonering viste at med unntak av mitokondrie del av BCL-2, betydelige mengder av Bcl-2 og Beclin en overlapping i lys fraksjoner, og i ytterligere holde med IP resultater, ingen av disse proteinene endret lokalisering i kontroll eller sultet celler. I motsetning til dette ble Bcl-xL detektert gjennom hele gradienten i kontrollceller og ble relocalised til meget lette fraksjoner i sultet celler; gitt antall avdelinger som BCL-XL er til stede, er det rimelig å anta at det kan samhandle med mange partnere, og dette kan forklare at Beclin en ikke blir funnet som sin viktigste samspill partner gjennom IP-eksperimenter. Confocal analyser viste at BCL-XL samlokalisert med mitokondrielle indre membran protein ATP1 i kontroll og sultet celler (figur 5C.); derav lette fraksjoner hosting BCL-XL i utsultet cellene er i umiddelbar nærhet av mitokondrier.
(A) Samtidig immunoutfellingsstudier av endogen Beclin en med endogen Bcl-2 og Bcl-xL i HCT116-Bax KO celler dyrket i fullstendig medium eller sultet i 6 timer. (B) subcellulære fraksjonering av HCT116-Bax KO-celler dyrket i fullstendig medium eller sultet i 6 timer. Celler ble brutt med en Dounce homogenisator, ble post-atom supernatanter lastet på toppen av en sammenhengende 10-55% sukrose gradient for ultrasentrifugering over natten. Fraksjoner på 500 pl ble oppsamlet, og totalt protein ble utfelt. Det samme volum av hver fraksjon ble separert på en 14% Tris-tricin SDS-PAGE. Western-blots var som beskrevet i metodedelen. (C) Immunocytochemistry på endogen BCL-XL og ATP1 i HCT116-BaxKO celler dyrket i komplett medium eller sultet i 6 timer.
Siden IP-eksperimenter viste en interaksjon mellom Bcl-2 og Beclin en, men var mangelfulle for BCL-xL og Beclin en, vi endelig besluttet å sette opp en siste rekke eksperimenter for å utforske videre funksjonelle forskjeller mellom Bcl-2 og Bcl-xL og deres avhengighet av Beclin 1. Vi analyserte autofagi i cellene over-uttrykker Beclin en eller BH3 mutanter Beclin 1
F123A og Beclin 1
125A som henholdsvis løs eller beholde sin binding til Bcl-2 og Bcl-xL [19], [37] (protein-ekspresjonsnivåer er vist i fig. S5 ). Fig.6A viser at, som forventet, Beclin en ektopisk uttrykk stimulert sult-indusert autophagic proteolyse. En slik egenskap var strengt avhengig av et funksjonelt BH3 domene (dvs. i stand til å samhandle med BH1-BH2 inneholder partnere) siden Beclin en
125A lignet villtype protein, mens Beclin en
F123A var helt ute av stand til å utløse autofagi. De BH1 mutanter av Bcl-2 og Bcl-xL (dvs. BCL-2
G145A eller BCL-xL
G138A), som både løs deres interaksjon med BH3 domenet Beclin 1 [19], [24] var gjensidig analysert. Nivåer av over-ekspresjon i HCT116-celler BaxKO var lik dem for ektopisk Bcl-2 og Bcl-xL (fig. S2). Hindre bindingen av Bcl-2 til Beclin en helt avskaffet stimulering av autophagic proteolyse observert med mors BCL-2. TEM bekreftet at mengden og størrelsen av autophagic vesikler i Bcl-2
G145A uttrykkende celler var svært forskjellig fra Bcl-2-uttrykkende celler, og var faktisk kan sammenlignes med ikke-transfekterte celler (se fig. 3D og fig. 6B høyre). Derfor BCL-2 pro-autophagic funksjoner helt avhengige av bindingen av en BH3 inneholder partner (sannsynligvis Beclin 1 i henhold til IP-eksperimenter og til proteolyse data innhentet med Beclin en
F123A). I kontrast, BCL-xL
G138A fortsatt beholdt en viss evne til å stimulere autophagic degradering, selv om det var langt mindre effektiv enn sin opprinnelige motstykke (Fig. 6A). TEM indikerte at BCL-xL
G138A stimulert AVS syntese så effektivt som BCL-XL (se fig. 6B igjen med Fig. 3D). Relocalisation av mCherry-LC3 i BaxKO-MEFs transfektert med BCL-xL
G138A bekreftet denne observasjonen (sammenlign fig. 6C med Fig. 3E). Colocalisation av LC3 og Lamp1A i sultet HCT116 BaxKO celler som uttrykker BCL-XL eller BCL-xL
G138A viste at autophagic vesikler inneholdt begge merkene, og dermed representere nedbrytende autophagosomes. Derfor mutasjon av Bcl-xL BH3-bindingssete som resulterte i en strukturelt intakt, men funksjonsmessig svekket autophagic pathway. Dette settet med data indikerer at degraderende AVS dannes i BCL-XL
G138A men videre eksperimenter for å forklare hvorfor disse AVS er mindre funksjonell enn i BCL-XL uttrykker celler. Sammenligning av mengden av Atg5-Atg12 konjugat i ikke-transfekterte celler eller i celler som uttrykker Bcl-xL eller Bcl-xL
G138A mislyktes i å identifisere en hvilken som helst forskjell, noe som indikerer at konjugering trinnet ikke er begrensende, og kan ikke bli ytterligere stimulert ved Bcl- xL ekspresjon (fig. S6). Fremtidige forsøk vil ta sikte på å sammenligne kinetikken av AVS modning i BCL-XL og BCL-XL
G138A uttrykke celler. Som en konklusjon, Bcl-2 og Bcl-xL utstillings en differensial avhengighet Beclin en trenger å vise sine pro-autophagic funksjoner. Mens BCL-2 fullt avhengig av sin binding til Beclin 1, ikke BCL-xL ikke kontrollere dannelsen av autophagosomes via Beclin en, og vi foreslår at et protein som bruker BH3-bindende domene hjelper BCL-xL stimulere en funksjonell autophagic sti.
(A) Relativ stimulering av sult-indusert 3-MA-sensitive nedbrytning av langlivede proteiner i HCT116-BaxKO cellelinjer transfektert eller ikke med BCL-2, BCL-2
G145A, Bcl- XL, BCL-xL
G138A, Beclin 1, Beclin en
F123A eller Beclin en
I125A. Celler ble jaget i 6 timer i HBSS eller HBSS + 3-MA. Resultatene representerer den 3-MA sensitive aktiviteter av hver cellelinje i forhold til det som finnes i ikke-transfekterte celler. Dataene er gjennomsnittet (± s.d.) På minst 3 uavhengige eksperimenter. Student-testen ble anvendt for signifikans statistikk av resultatene sammenlignet med ikke-transfekterte celler; p-verdier ikke er angitt på grafen er p 0,01. (B) TEM av HCT116-BaxKO celler transfektert med BCL-xL
G138A (venstre) eller BCL-2
G145A (til høyre) etter 6 timer med sult. Skala: 2 mikrometer. (C) 24 timer etter kotransfeksjon av mCherryLC3 med flagg-BCL-xL
G138A, BaxKO MEFs dyrket i komplett medium eller sultet i 6 timer ble fikset. Immonocytochemistry avslører Flag-merket konstruksjoner (grønt). Bilder er representative for minst 4 uavhengige eksperimenter. Skala: 10 mikrometer. (D) HCT116BaxKO celler over-uttrykker BCL-XL eller BCL-xL
G138A ble transfektert med mCherryLC3 og mEGFP-Lamp1A. Etter 6 timer av sult, ble cellene fiksert og observert med en 100x objektiv. (Skala bar: 5 mikrometer)
Diskusjoner
De molekylære baser for å forutsi cytoprotective eller pro-
