Abstract
Mål
Vi forsøkte å undersøke den prognostiske verdien av RRM1 i GC pasienter.
Metoder
Totalt assessable 389 GC pasienter med clinicopathological og overlevelse informasjon ble registrert fra City of Hope (COH, n = 67) og Zhejiang University (ZJU, n = 322). RRM1 protein ble bestemt ved immunhistokjemi på FFPE- vevsprøver. Kaplan-Meier og Cox analyser ble anvendt for å måle overlevelse. Ras /Raf aktivitet og invasjon analyser ble brukt for å vurdere rollen til RRM1 i GC cellelinjer.
Resultater
In vitro
eksperimenter demonstrerte RRM1 aktivert Ras /Raf /MAPK signaltransduksjon og fremmet GC celleproliferasjon. I mellomtiden, RRM1 uttrykk var signifikant assosiert med spredning til lymfeknuter, tumorstørrelse, Ki67 uttrykk, histologisk subtype og histologisk karakter i GC vevsprøver (
p
0,05). Kaplan-Meier analyse viste at høy RRM1 uttrykk spådd dårlig overlevelse i GC pasienter i COH og ZJU kohorter (log-rank
p
0,01). I multivariat Cox analyse, fare prosenter av RRM1 for total overlevelse var 2,55 (95% KI 1.27 til 5.15) og 1,51 (95% CI 1.7 til 2.13) i COH og ZJU setter hhv. Spesielt RRM1 spesielt spådd utfallet av avanserte GCer med dårlig differensiering og høy proliferativ evne. Videre hemming av RRM1 ved siRNA reduserte signifikant dNTP basseng, Ras /Raf og MMP-9 aktiviteter, og nivåene av p-MEK, p-ERK og NF-kB, som resulterer i veksthemming og redusert invasjon i AGS og NCI-N87 celler.
Konklusjoner
RRM1 overekspresjon spår dårlig overlevelse i GC pasienter med avansert TNM stadium. RRM1 potensielt kan tjene som prognostisk biomarkør og terapeutisk mål for GCer
Citation. Wang Q, Liu X, Zhou J, Huang Y, Zhang S, Shen J et al. (2013) ribonukleotidreduktase Stor subenhet M1 Spår Poor Survival grunn Modulation av proliferativ og Invasiv Evne av magekreft. PLoS ONE 8 (7): e70191. doi: 10,1371 /journal.pone.0070191
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: 9 april 2013; Godkjent: 15 juni 2013; Publisert: 29.07.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd (R01, CA127541), Nature Science Foundation National of China (NSFC) 81101659 /H1609, Science Foundation i Zhejiang-provinsen Nature, Kina (NSFZ) Y2110073. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
gastric adenokarsinom (magekreft, GC) er den nest største årsaken til kreft-assosiert dødelighet over hele verden, spesielt i asiatiske land og utviklingsland, der omtrent en million tilfeller er diagnostisert årlig [1] – [2]. Den høyeste dødelighet (28,1 per 100 000 menn, 13,0 per 100 000 kvinner) fra GC har blitt rapportert i Øst-Asia, som inkluderer Kina, Japan og Korea [2]. Konvensjonelle behandlingsmetoder, inkludert kirurgi, cellegift og strålebehandling, har vist en overlevelsesfordel for GC pasienter [3] – [6]. Imidlertid er det 5-års overlevelse fortsatt skuffende, og de fleste GC pasienter dør av sykdom komplikasjoner og tilbakefall [3], [7] – [8]. Flere biomarkører blir undersøkt med det formål å forutsi overlevelse og bedre resultater hos pasienter med GC [9]. Så langt er det få av biomarkørene er mye brukt klinisk for GC.
ribonukleotidreduktase (RNR) regnes som en terapeutisk mål for kreftbehandling. RNR er et tidsbegrenset enzym som katalyserer omdannelsen av ribonukleosid diphosphates til deoksyribonukleosid diphosphates gjennom
de novo
metabolismen av endogene nukleotider [10]. RnR hemmere, som hvdroksvurinstoff, har vært mye brukt til å behandle leukemi og solide tumorer [11] – [13]. Imidlertid har anvendelsen av RNR inhibitorer blitt begrenset på grunn av lav effektivitet, medikamentresistens og bivirkninger [14]. De fleste av begrensningene i RnR hemmere er forårsaket av ikke-spesifikk målgruppe. Humant RNR består av tre underenheter, den store subenhet M1 (RRM1) og to små subenheter M2 og M2B. Hver liten subenhet kan kompleks med RRM1 for å danne et aktivt holoenzyme [10]. M2 nivå forut dårlig prognose i flere typer kreft, inkludert lungekreft, kreft i bukspyttkjertelen og GC [15] – [18]. M2B synes å spille en rolle i å undertrykke malignitet og er forbundet med bedre overlevelse i kolorektal kreft, i henhold til vår tidligere forskning [19] – [20]. Men de biologiske rollene til RRM1 ikke er identiske blant disse kreftformer. Vi har undersøkt mRNA nivåer av RRM1 i kreft og tilsvarende normale vevssnitt bruker ONCOMINE database (www.oncomine.com). Under utvalgte forhold (
p
0,05, foldendring 2, genet rang = topp 10%, alle datatyper), den RRM1 mRNA ble oppregulert i 39 unike analyser og nedregulert i 11 unike analyser. RRM1 stort sett økt de seksjoner fra blæren, cervical, tykktarms, hode og nakke, lever og lunge kreft, samt melanom og sarkom. I mellomtiden RRM1 ble nedregulert i brystkreft, leukemi og lymfom. Pattedyr RNR subenheten R1 (tilsvarende RRM1 i human) spiller en rolle i malignitet undertrykkelse ved å inaktivere Ras /Raf /MAPK-signalveien i Ras-transformerte 3T3-celler (mus) [21] – [22]. Videre utfallet studier har vist at høy RRM1 uttrykk (sammen med ERCC1 eller PTEN oppregulering) er med på å bestemme optimal overlevelse i tidlig stadium ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [23] – [26]; imidlertid har andre studier vist tilsynelatende motstridende resultater [27] – [29]. RRM1 overekspresjon er relatert til motstand mot gemcitabin i NSCLC og kreft i bukspyttkjertelen, noe som resulterer i et dårlig resultat [30]. Disse studiene tyder på at rollen til RRM1 i cancer fortsatt kontroversielt, selv i samme krefttype ved forskjellige stadier eller under forskjellige terapier [31] – [32]. RRM1 har blitt foreslått å ha andre biologiske roller i tillegg danner RnR holoenzymes å konvertere NDP til dNDP, noe som kan delvis forklare den lave effekten av RnR hemmere i behandling av kreft. Derfor omfattende undersøke rollene til RRM1 ville være nyttig i utviklingen nye RnR hemmere for behandling av kreft spesielt. GC er en av de vanligste kreftformene i verden, men RNR-hemmere, som hydroksyurea og gemcitabin, har ikke vært brukt ofte på grunn av lav effekt. På den annen side, har virkningen av RRM1 på GC-resultat aldri blitt undersøkt. Derfor ville det være verdifullt for å utforske den biologiske rolle RRM1 i GC-celler og evaluere den kliniske betydning av RRM1 overekspresjon i GC-pasienter.
I denne studien rollene til RRM1 for å regulere celleproliferering og invasjon via Ras /Raf-signalveien i GC-cellelinjer ble undersøkt. I mellomtiden, RRM1 protein uttrykk og utfallet av 67 GC pasienter fra City of Hope National Medical Center (COH) ble også bestemt. Funnene ble ytterligere validert i 322 GC pasienter fra Affiliated Sir Run Run Shaw Hospital of Zhejiang University (ZJU). Våre funn tyder på at RRM1 spår dårlig overlevelse i GCer og potensielt kan tjene som en prognostisk biomarkør og terapeutisk mål i GC pasienter.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Protokollen av denne studien ble gjennomgått og godkjent av Institutional Review board (IRB) i City of henholdsvis Håper National Medical Center og Zhejiang University,. Skriftlig informert samtykke ble innhentet av alle pasienter som deltok i denne studien. De støtteberettigede GC prøvene ble samlet inn fra City of Hope National Medical Center (COH sett) og Affiliated Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University (ZJU sett), henholdsvis.
Pasient
inklusjonskriterier for deltakere inkluderte følgende: (i) adenokarsinom i ventrikkel med en patologisk diagnose; (Ii) informert samtykke eller frafallelse av samtykke gitt av pasienten; og (iii) oppfølging informasjon tilgjengelig. Vi ekskluderte GC pasienter med (i) unnlatelse av å gi informert samtykke; (Ii) ikke-adenocarcinom eller flere kreftformer; (Iii) ingen vevsprøve oppnådd; (Iv) tap av kontakt etter kirurgi; eller (v) stadium IV GC uten smertestillende middel kirurgi. Den COH sett inkludert en serie av 67 kvalifiserte GC pasienter som fikk kirurgi med R0 (58 tilfeller), R1 (8 tilfeller) eller R2 (1 tilfelle) reseksjon i City of Hope National Medical Center fra januar 1989 til desember 2006. Deltakerne i den COH sett besto av 51 Whites, 2 afrikansk-amerikanere og 14 asiater. I ZJU sett, ble kvalifisert 322 GC pasienter (242 tilfeller med R0 reseksjon, 67 tilfeller med R1 reseksjon og 13 tilfeller med R2 reseksjon) registrert. De ble hentet sin kirurgisk operasjon i løpet av 1997 til 2001. Alle GC pasienter i ZJU sett var asiatisk (kinesisk). I ZJU sett, 153 av 322 pasienter hadde etter operasjonen adjuvant kjemoterapi. Kombinasjon kjemoterapiregimer inkludert folinsyre, 5-fluorouracil og oksaliplatin (FOLFOX6, 73 tilfeller); epirubicin, oksaliplatin og Xeloda (EOX; 12 saker); 5-fluorouracil, epidoxorubicin og mitomycin C (FEM, 9 tilfeller); etoposid, folinsyre og 5-fluorouracil (ELF; 38 tilfeller); mitomycin C og 5-fluorouracil (MF, 4 tilfeller); og andre (oral S-1 /x, docetaxel-basert og andre protokoller, 17 tilfeller). Alle pasientene ble fulgt opp frem til januar 2012. Detaljene i den demografiske og clinicopathological informasjon ble oppdatert. De TNM forberede data for deltakerne ble innhentet fra de kliniske og patologiske diagnoser og fastsatt i henhold til de NCCN retningslinjer for GC (versjon 2, 2011). De menneskelige vevsprøver undersøkt i denne studien ble hentet fra kirurgi og lagret ved romtemperatur etter formalinfiksert og paraffinization. Korrelasjonsresultatet vises lagringstiden ikke påvirke RRM1 uttrykk i statistisk signifikans (
p
0,05).
Studiedesign
Dette var en retrospektiv utfallet studien. Utvalgsstørrelsen ble estimert ved hjelp nQuery Advisor 6,01 (Statistical Solutions Ltd, Saugus, MA, USA) programvare. Basert på denne beregningen, vil en utvalgsstørrelse på 300 deltakere nå 95% studie strøm (tosidig α = 0,05). Demografisk og clinicopathological informasjon ble hentet gjennom nøye diagram gjennomgang. Alle pasientene ble periodisk fulgt opp for å overleve data; pasienter med kurativ virksomhet ble også fulgt for tilbakefall overlevelse. Den oppfølgingsperioden ble beregnet fra datoen for operasjonen til datoen for siste kontakt. Den sykdomsfri overlevelse ble definert som tiden fra den første operasjonen for å tumorresidiv. Metastaser eller lokale tilbakefall ble ansett bevis for tumor tilbakefall. Bare dødsfall fra GC ble ansett endepunktet av sykdomsspesifikk overlevelse. Variablene som vurderes inkludert fødselsdato, kjønn, diagnosedato, dato og type operasjon, type cellegift, TNM stadium, tilbakefall /metastasestatus, dato for tilbakefall /metastase og klinisk status ved siste oppfølging.
Immunohistokjemi (IHC) ble benyttet for å bestemme RRM1 protein uttrykk i formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) menneskelige vevsprøver. For å unngå systemiske skjevheter ble antistoffer validert, og vilkårene for IHC ble optimalisert ved hjelp av en kontroll vev bord. For å normalisere reaksjonsbetingelsene, ble alle FFPE vevsprøver fra ZJU satt sammen igjen inn i flere vev matriser. I tillegg ble en kontroll FFPE flere vev bord inkludert for hver IHC farging. For å forminske bildet leseren bias, ble en automatisert bildesystem anvendes for å oppnå digitale bilder av de fargede seksjoner for påfølgende kvantitative analyser. Hver prøve ble evaluert av to uavhengige etterforskere i en dobbeltblind måte.
Alle demografiske data, clinicopathological informasjon og IHC resultater ble kodet og lagt inn i en GC database. Doble dataregistrering og logiske kontroller ble brukt for feilreduksjon. Microsoft Office Access® ble brukt til å lage databaser. De manglende saker ble merket med riktig «mangler» kode. JMP 8.0 programvare (SAS Institute, Cary, NC, USA) og GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA, USA) ble brukt for statistisk analyse og overlevelse kurve plot. Multivariate logistiske regresjonsmodeller ble brukt til å justere for kovarianteffekter på odds ratio (OR). Kaplan-Meier analyse og en Cox-modellen ble brukt for total overlevelse (OS) og progresjonsfri overlevelse (PFS) analyser. Multivariate analyser og stratifisering ble brukt til å redusere virkningen av konfunderende effekter på estimering av hazard ratio (HRS).
Kvantitative IHC Analyser
IHC ble brukt til å undersøke RRM1 protein uttrykk. Nøyaktigheten av IHC ble validert ved kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) på to parallelle prøver. I korthet, etter deparaffinization ble endogen peroksidase-aktivitet blokkert med 3% H
2o
2 (hydrogenperoksyd). Matrisen Glassene ble senere inkubert med normalt geiteserum i 20 minutter, og deretter primært antistoff ble påført i 20 minutter ved romtemperatur. Etter 7 minutter av H
2o
2 behandling, ble tabell lysbilder inkubert med pepperrot peroksidase-merket tilsvarende antistoffer for 30minutes. DAB (3,3′-diaminobenzidin; 0,05 g DAB og 100 ml 30% H
2o
2 i 100 ml PBS) ble påført i 5 minutter og igjen i 10 minutter. Hver side ble deretter kontra med hematoksylin (DAKO). PBS ble anvendt som en negativ kontroll.
Antistoffer
A kommersielt produserte mus monoklonalt antistoff ble brukt mot humant RRM1 i denne studien. Den RRM1 antistoffproduksjon var basert på våre tidligere standard protokoll [33]. Anti-hRRM1 antistoffproduserende hybridomer ble screenet ved primær enzymbundet immunosorbent assay (ELISA). Kloner ble valgt basert på deres aktiviteter på parafininnstøpte menneskelig vev. RRM1 ekspresjon ble kvantifisert ved en visuell graderingssystem basert på graden av farging. Både immunreaktivitet i kjernen og cytoplasmaet ble evaluert. Hvert bilde ble scoret basert på følgende kategorier: subcellulære lokalisering (f.eks cytoplasma vs. nucleus), fargeintensitet (for eksempel integrert optisk tetthet), og /eller prosentandel av fargede celler (f.eks samlet areal eller prosentandel av positive celler). Basert på intensiteten av signalet, ble RRM1 uttrykk klassifisert som negativ (0), svakt positiv (1), positiv (2) eller sterkt positiv (3). En RRM1 score på 0 eller 1 ble utpekt RRM1-lav, og en score på 2 eller 3 ble klassifisert som RRM1 høy. Fordi våre data gitt konsistente resultater mellom cytoplasma RRM1 og kjernekraft RRM1, vurderte vi enten en høy kjernefysisk eller en høy cytoplasma poengsum som RRM1-high i Kaplan-Meier og Cox analyser.
Antistoffer mot p-MEK, p -ERK, NF-kB, Ras, Sp-1 og Ki67 ble hentet fra Cell Signaling Technology, Santa Cruz, Invitrogen, Millipore, Abcam og BD Bioscience, henholdsvis.
Plasmid Bygg og Transfeksjon
Den hRRM1 plasmid (pEBG-RRM1) ble konstruert og rapportert i vår tidligere studie [34]. Plasmidet ble transfektert med X-treme GENE HP DNA Transfeksjon Reagens (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll for AGS celler. I korthet ble 2 pg av plasmid ble blandet med 6 ul X-treme GENE HP i 200 ul serumfritt medium etter inkubasjon ved romtemperatur i 15 minutter. Blandingen ble tilsatt til 2 x 10
5 forhåndsbelagt AGS celler i en 6-brønns plate. Etter transfeksjon i 48 timer, ble cellene høstet.
Cell Kultur og RNA interferens
Den menneskelige GC cellelinjer AGS og NCI-N87 ble oppnådd fra American Type Culture Collection og dyrket i F- 12K medium (AGS) eller RPMI-1640 medium (NCI-N87) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (MP Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA) og 1% penicillin og streptomycin i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C.
RRM1 siRNA (sc-37640) og krafse siRNA (SC-44233) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. The trans ble gjennomført med Lipofectamine ™ RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner.
in vitro
Proliferation Assay
en
in vitro
spredning analysen ble gjennomført i henhold til vår tidligere studie [15]. I korthet, 0,5 x 10
4 AGS og 2,0 x 10
4 NCI-N87-celler ble forhåndsbelagt i brønner på en 16-brønns-enhet som er kompatible med en W200 sanntids celle elektroniske føle (RT-CES) analysator og 16 × stasjon (ACEA biovitenskap, San Diego, CA, USA). Den «celle index» (normaliserte impedans) ble beregnet periodisk (typisk 30 minutter) i henhold til den celleveksten i hver brønn. Med mindre annet er angitt, ble fire replikater gjøres for hvert siRNA behandlingsgruppe. RRM1 hemming ble målt ved Western blotting.
In vitro
Invasion analysen
Matrigel invasjonen kamrene ble kjøpt fra BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA). Først ble en 8 mm porøsitet polykarbonatmembran belagt med 1 ml av serumfritt medium inneholdende 1 x 10
5 celler per brønn. Platene ble deretter inkubert med et chemo-tiltrekningsmiddel (20% FBS-medium) i 24 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator. Mediet ble deretter fjernet, og ikke-invaderende celler ble forsiktig skrapet av med en celleskrape. Filteret ble deretter vasket to ganger med PBS og farget med 0,5% metylenblått i 4 timer. Cellene som passerte gjennom filteret og festet til den nedre overflate ble telt ved bruk av optisk mikroskopi.
Gelatin Zymografi
En gelatin zymografi analyse ble utført for å undersøke innflytelsen av RRM1 på utskillelsen av aktive MMP-9. I korthet ble cellene dyrket til 70% konfluens, ble vasket to ganger med 1 x PBS, og inkubert i serumfritt medium. Etter 24 timer ble kondisjonert medium oppsamlet og konsentrert med en sentrifugal-filter (Millipore, MA, USA) under 6000 g i 15 minutter. Konsentrerte prøver ble fremstilt i ikke-reduserende prøvebuffer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Proteiner (20 pl /felt) ble separert ved hjelp av SDS-PAGE i geler inneholdende 1 mg /ml gelatin (Novex 10% Gelatin Gel, Invitrogen). Gelene ble renaturert i 1 time ved romtemperatur i 1 x renaturering av buffer (Invitrogen). Deretter ble gelene inkubert over natten ved 37 ° C i 1 x u-buffer (Invitrogen). Gelen ble farget med Coomassie-blått. Lysstyrken av de klare band, hvor MMP9 ble lokalisert og gelatin ble degradert, ble analysert ved hjelp av densitometry.
Ras aktivitetsanalyse
Ras aktivitet ble målt ved hjelp av en Ras Activity Assay kit (Millipore, MA, USA). Først ble aktivert Ras (GTP-bundet Ras) bundet til Raf-1-Ras bindingsdomene (RBD) konjugert til agarosekuler ved å inkubere cellelysatene ved 4 ° C i 45 minutter. Deretter ble aktivert Ras ble sluppet ut i SDS-PAGE prøvebuffer etter omfattende vasking av agarosekuler (tre ganger) med vaskebuffer (25 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM MgCl
2, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 1 mM Na
3VO
4, 10% glyserol, 10 ug /ml leupeptin, 10 ug /mL aprotinin og 25 mM NaF). Mengden av Ras ble påvist med monoklonale pan-Ras-antistoff.
Måling av dNTP Pool
Dette assay ble utført i henhold til fremgangsmåten til Sherman og Fyfe [35]. Det totale reaksjonsvolumet var 50 ul. Reaksjonsblandingen inneholdt 10 mM MgCl
2, 0,25 uM templat /primer, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM DTT, 1,25 mM [
3H] dATP (for dCTP, dGTP, og dTTP analysen) eller [
3H] dTTP (for dATP analyse) og 0,2 enheter av Sequenase (2,0). Reaksjonsblandingen ble inkubert ved romtemperatur i 20 minutter, og deretter ble reaksjonen stoppet på is. Etter reaksjonen ble 40 pl aliquoter fjernet og flekket på sirkel (diameter 2,4 cm) Whatman DE81 ion-exchange papirer. Papirene ble tørket, vasket (3 x 10 minutter) med 5% Na
2HPO
4, og skyllet én gang med destillert vann og en gang med 95% etanol. Hver papir ble tørket og satt inn på en liten test tube; 7 ml av Ecolume ble deretter tilsatt til hvert rør. En væske-scintillasjonsteller (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA) ble anvendt for å telle tritium-merket dNTP. Standardprøvene var 0,25, 0,5, 0,75 og 1,0 pmol.
Resultater
Validering av spesifisiteten av RRM1 antistoffer i adenokarsinom i ventrikkel Prøver
spesifisiteten av RRM1 antistoffer ble validert av et peptid blokkering analysen. Antistoffene ble fortynnet (1:1000), pre-inkubert med rekombinant RRM1 peptid (1 pg /ml) ved 4 ° C over natten, og deretter visualisert ved western-analyse. På fig. 1
En
, en dominerende signal fra en kvalifisert RRM1 antistoff kan bli sett av western blot og ble redusert med RRM1 knockdown i AGS celler. I mellomtiden signalet ble spesielt blokkert av rekombinant RRM1 peptid, noe som indikerer spesifisiteten av RRM1 antistoffer.
A
. Peptid blokkeringsanalyse ble gjennomført på RRM1 antistoffer til IHC-farging, alle antistoffene var i 1:1000 fortynning og inkubert med rekombinant RRM1 peptid (1 pg /ml) ved 4 ° over natten. Antistoff # 2 viste mer spesifikke og sterkere signal enn andre antistoffer (data ikke vist), derfor har vi brukt det som antistoffet for IHC farging.
B
. Nuclear fraksjonering ble ansatt på AGS celler. AGS-cellene ble sultet i 96 timer og re-supplert med normal vekstmedium i 12 timer. Deretter ble cellene samlet og fractionized for kjerneprotein. Western blot ble anvendt for å åpenbare den sub-cellulær lokalisering av RRM1, GAPDH og Sp-1 ble anvendt som cytoplasmiske og kjernefysiske markører.
C
. Translokasjon av RRM1 fra cytoplasma til kjernen ble observert av Immuno-fluorescens cytochemistry. AGS-cellene ble sultet i 48 timer og re-supplert med normal vekstmedium i 12 timer. Deretter ble cellene fiksert og inkubert med primære og sekundære antistoffer. Translokasjon av RRM1 ble observert i henhold til fluorescens mikroskopi.
D
. RRM1 var heterogent uttrykk blant tilstøtende normalt vev og histologiske undergrupper (JGCA klassifisering V.2011) inkludert papillær, rørformede, mucinous og signetring celle og udifferensiert adenokarsinom.
Fordi ulike uttrykk mønstre av RRM1 er rapportert , lokalisering av RRM1 ble videre undersøkt. I normale celler, ble RRM1 hovedsakelig uttrykt i cytoplasma (fig. 1
B
). En fluorescens-merking-analysen bekreftet også at RRM1 protein akkumuleres i cytoplasma etter 48 timer med serum sult. Imidlertid RRM1 translokert til kjernen som respons til serum re-tilskudd i 12 timer (fig. 1
C
). Derfor tok vi både cytoplasma og kjernekraft farging av RRM1 i betraktning når man tolker IHC farging.
RRM1 var heterogent uttrykk blant undergrupper av GC vev (Fig. 1
C
). RRM1 ble fortrinnsvis uttrykt i kreftvev (47,0% RRM1-høy) over de tilstøtende normalt vev i GC prøver (25,4% RRM1-høy). I henhold til JGCA klassifiseringen [36], ble gastrisk adenokarsinom klassifisert i fem histologiske subtyper. RRM1 ble sterkt uttrykt i den papillære (61,9%), rørformet (59,6%) og udifferensierte adenokarsinomer (55,4%), men forholdsvis lavere i mucinous (34,4%) og signet ring celle adenokarsinom undertyper (14,3%).
RRM1 Fremmer cellevekst via Ras /Raf /MAPK signalveien i GC
pattedyr RNR store subenheten R1 (R1) undertrykker malignitet i Ras forvandlet mus 3T3 celler [21]. p-ERK er en viktig nedstrømskomponent regulert av Ras /Raf signaltransduksjon. Derfor, for å studere sammenhengen mellom RRM1 og GC aggressivitet, målte vi p-ERK i 32 GC pasientenes parafinprøver. IHC flekker indikerte at RRM1 uttrykket ble concordantly assosiert med p-ERK-nivå i GC prøver (figur 2
En
,
venstre panel
). Korrelasjonen var statistisk signifikant (figur 2
En
,
høyre panel
). Videre genet overføre eksperiment viste at høyere RRM1 uttrykk økt p-ERK uttrykk i AGS celler (fig 2
B
,
øvre panel
) og fremmet cellevekst
in vitro
(fig 2
B
,
nedre panel
). For å avgjøre om RRM1 regulerer Ras /Raf /MAPK signal, vi nedregulert RRM1 uttrykk av siRNA i AGS og NCI-N87 celler. Krafse siRNA ble anvendt som en negativ kontroll. Western blot-analyse indikerte at RRM1 ble spesielt redusert av den tilsvarende siRNA (fig. 2
C
). Sammen med en reduksjon på RRM1, ble signalene for p-MEK, p-ERK og NF-kB sunket betraktelig; Ras /Raf aktivitet også falt bemerkelsesverdig i både AGS og NCI-N87 celler. Ovennevnte observasjoner illustrerer at RRM1 kan fremme GC celleproliferasjon ved å aktivere Ras /Raf /MAPK signal.
En
, RRM1 overekspresjon ble funnet å være i følge med høy ekspresjon av p-ERK i GC pasienter (
p
0,01, n = 32), vinduer 1-4 viser representative bilder av p-ERK og corresponsive RRM1 flekker i 2 kreft vev fra to representative pasienter (Pic 1-2: GC No1; bilde 3-4: GC No2).
B
, Overuttrykte RRM1 (både utenfor livmoren og endogene RRM1) gjennom transfeksjon av pRRM1 (pEBG-RRM1) fremmer AGS cellevekst; p-ERK var også oppregulert senere.
C
, RRM1 ble nedregulert med siRNA i to GC cellelinjer, AGS og NCI-N87. Cellene ble samlet opp og analysert med Western blot og Ras aktivitet kit (Millipore, MA). Ras-Raf aktivitet ble sterkt redusert, og så var nedstrøms proteiner p-MEK, p-ERK og c-NFkB.
RRM1 Expression er forbundet med magekreft Aggressivitet
Å videre utforske de ovennevnte funnene ble RRM1 protein uttrykk målt i GC prøvene. På bakgrunn av IHC-farging, 22 av 67 GCer i COH settet og 156 av 322 GCer i ZJU settet var enten cytoplasmisk eller kjernefysisk RRM1-høy (tabell 1). I COH og ZJU sett, RRM1-høy var hyppigere hos menn enn hos kvinner, og mer sannsynlig å nå statistisk signifikans i ZJU sett (
p
0,01). Det var mer proksimale GC (44,8%) i COH settet, men mer distal GC (52,5%) i ZJU settet. RRM1 uttrykk var betydelig høyere i de proksimale GCer (
p
0,05) i COH sett, og en lignende trend ble observert i ZJU sett (
p
= 0,31). I mellomtiden RRM1 var assosiert med antall lymfeknuter involvert, tumor størrelse, Ki67 uttrykk, histologisk subtype og histologisk grad i ZJU sett (
p
0,05 for hver). På grunn av den lille størrelsen på utvalget, ble ingen statistisk signifikans for de ovennevnte faktorene observert i COH settet, men lignende trender kan selvsagt bli sett.
For ytterligere å undersøke om RRM1 var assosiert med GC aggressivitet, en ikke-betinget multivariat logistisk analyse ble gjennomført. Her ble den TNM trinnet anses å være utgang (stadium III 53 av 67 GC pasienter døde av GC-relaterte lidelser, og 34 pasienter hadde en gjentakelse. I ZJU sett, den lengste oppfølgingstiden var 179 måneder; totalt 175 av 322 GC pasienter døde av GC, og 87 pasienter hadde en gjentakelse. Resultater konsistente med de som ble sett for cytoplasma RRM1 (HR = 1,62, 95% KI 1.20 til 2.20) og kjernekraft RRM1 (HR = 1,61, 95% KI 1.19 til 2.18). Derfor enten høy cytoplasma eller høy atom RRM1 uttrykk ble behandlet i følgende analyse.
Kaplan-Meier analyser indikerte at RRM1-høy var signifikant relatert til dårlig OS og PFS i COH og ZJU sett (log rank
p
0,01 eller
p
= 0,03) (figur 3
A
–
D
).. Median overlevelse for RRM1-lav undergruppe var 28 måneder i COH sett og 42 måneder i ZJU settet. For RRM1-høy undergruppe, ble median overlevelse betydelig redusert til 12,5 og 23 måneder i COH og ZJU setter hhv. Lignende resultater ble oppnådd i den PFS. RRM1-høy betydelig økt risiko for GC tilbakefall i begge settene (log rank
p
0,01 i COH sett og
p
= 0,03 i ZJU sett)
A
. Kaplan-Meier analyse for OS ble vist som RRM1 høyt
vs.
RRM1-low for å forbedre studie makt i COH sett.
B
, Kaplan-Meier analyse for OS ble gjennomført i ZJU sett. Kaplan-Meier analyse for PFS ble utført på
C plakater (COH sett) og
D plakater (ZJU sett). Den multivariat Cox analyser for OS av GC ble vist på
E Hotell og
F
for COH og ZJU satt hhv. Hazard ratio (HR) i RRM1 var basert på RRM1 høyt
vs
RRM1-lav.; Tumor stedet var proksimale
vs
. Kroppen
vs
. distal Hel; Ki67 var positiv
vs
. negativ; Tumor scenen var Stage I II
vs
. III IV; Tumor klasse var lav
vs
. moderat
vs
. høy; Kjønn var mannlige
vs
. hunn; Alder var basert på per enhet endringer. Den «*» ble brukt for å indikere statistisk signifikans (
p
0,05)
For å unngå confounder effekter, ble en multivariat Cox analyse utført ved hjelp av COH og ZJU setter (. fig. 3
E og 3F
). I COH settet, hvilke faktorer TNM stadium, tumor plassering, tumor karakter, Ki67 nivå, kjønn og alder ble anvendt for å justere HR. Som vist i fig. 3
E og 3F
, RRM1 og TNM stadium var signifikant assosiert med dårlig OS av GC pasienter i COH og ZJU sett. HRS for RRM1 var 2,55 (95% KI 1.27 til 5.15) og 1,51 (95% CI 1.7 til 2.13) i COH og ZJU setter hhv. Ki67 har vært mye brukt som en celledeling biomarkør for kreft, men det klarte ikke å forutse utfallet av GC i COH og ZJU setter.
Den Prognostic Utførelse av RRM1 i Avanserte GCer
Å ytterligere evaluere prognostisk ytelsen RRM1 i undergrupper av GC, ble en lagdeling analyse utført. Her har vi ikke rapportere stratifiseringsfaktorer resultatene fra COH sett på grunn av den lille utvalgsstørrelse (totalt 67 tilfeller).
