Abstract
Bakgrunn
Epitelial celleadhesjonsmolekyl (EpCAM) -baserte opplisting av sirkulerende tumor -celler (CTC) har prognostisk verdi i pasienter med faste tumorer, slik som avansert bryst, tykktarm, og prostatakreft. Imidlertid har dårlig følsomhet blitt rapportert for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). For å løse dette problemet, utviklet vi en microcavity array (MCA) system integrert med en miniatyrisert enhet for CTC isolasjon uten å være avhengig EpCAM uttrykk. Her rapporterer vi resultatene fra en klinisk studie på CTCs av avanserte lungekreftpasienter der vi sammen MCA system med CellSearch system, som sysselsetter den konvensjonelle EpCAM basert metode.
Metoder
Koblede perifere blodprøver ble samlet inn fra 43 pasienter med metastatisk lungekreft pasienter å nummerere CTCs bruker CellSearch system i henhold til produsentens protokoll og MCA systemet ved immunolabeling og cytomorphological analyse. Tilstedeværelsen av CTCs ble vurdert blindt og uavhengig av begge systemene.
Resultater
CTCs ble påvist i 17 av 22 NSCLC pasienter ved hjelp av MCA system versus 7 av 22 pasienter ved hjelp av CellSearch system. På den annen side ble CTCs påvist i 20 av 21 småcellet lungekreft (SCLC) pasienter ved hjelp av MCA-systemet mot 12 av 21 pasienter ved hjelp av CellSearch system. Betydelig flere CTCs i NSCLC pasienter ble oppdaget av MCA system (median 13, range 0-291 celler /7,5 ml) enn ved CellSearch system (median 0, range 0-37 celler /7,5 ml) som viser statistisk overlegenhet (p = 0,0015 ). Statistisk signifikans ble ikke nådd i SCLC om trenden favoriserer MCA system over CellSearch systemet ble observert (p = 0,2888). MCA system også isolert CTC klynger fra pasienter som hadde blitt identifisert som CTC negativ bruker CellSearch system.
Konklusjoner
MCA systemet har et potensial til å isolere vesentlig flere CTCs og CTC klynger i avansert lungekreftpasienter i forhold til CellSearch systemet
Citation:. Hosokawa M, Kenmotsu H, Koh Y, Yoshino T, Yoshikawa T, Naito T, et al. (2013) Størrelse Basert Isolering av sirkulerende tumorceller i lungekreftpasienter ved hjelp av en Microcavity Array System. PLoS ONE 8 (6): e67466. doi: 10,1371 /journal.pone.0067466
Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong
mottatt: 18 januar 2013; Godkjent: 17 mai 2013; Publisert: 28 juni 2013
Copyright: © 2013 Hosokawa et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av Regional Innovasjon Cluster Program og Grant-i-Aid for stipend Unge Forskere (11J11150) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. MH, TYoshino, HKanbara, og TM har søkt om patenter relatert til MCA system . HKanbara er ansatt av Hitachi Chemical Co., Ltd. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak kreftrelaterte dødsfall i de fleste industrialiserte land. Småcellet lungekreft (SCLC) står for ca 15% av lungekreft tilfellene, og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), som inkluderer adenokarsinom (ADC) og plateepitelkarsinom (SCC), står for 85% av lungekreft tilfellene . Det har nylig blitt vist at identifisering av NSCLC pasienter ved påvisning av genetiske avvik, spesielt
EGFR
-aktiverende mutasjoner og
EML4-ALK
fusjonsgenet, gir bedre prediksjon av respons på EGFR tyrosin kinase-inhibitorer og ALK-inhibitorer, henholdsvis [1], [2]. Til tross for fremskritt innen forebygging og behandling, er NSCLC pasienter ofte diagnostisert på et avansert stadium og har en dårlig prognose på grunn av sykdom er tendensen mot fjernmetastaser, den primære årsaken til dødelighet blant NSCLC pasienter. Preget av aggressiv tumorvekst og ofte presenterer med metastaser i de regionale noder og fjerne organer, er SCLC utgangspunktet svært følsomme for cellegift, men har en tendens til å erverve chemoresistance, som fører til uunngåelige tilbakefall.
Sirkulasjonstumorceller (CTCs) er definert som tumorceller som sirkulerer i det perifere blod hos pasienter med metastatisk kreft. Målt ved hjelp av US Food and Drug Administration (FDA) -godkjent CellSearch system (Veridex, Raritan, NJ, USA), antall CTCs i perifert blod kan brukes til å forutsi prognosen for pasienter med metastatisk brystkreft [3], kolorektal kreft [4], prostatakreft [5], NSCLC [6], og SCLC [7]. Den CellSearch system beriker CTCs ved hjelp av magnetiske kuler belagt med et monoklonalt antistoff rettet mot-epitelial cellemarkør, slik som epitelcelle-adhesjonsmolekyl (EpCAM) [8], [9]. Imidlertid har flere studier vist at tilstedeværelsen av EpCAM på tumorceller varierer med tumortype [10], [11]. Ekspresjonen av epitel-celle markører, inkludert EpCAM, blir nedregulert for å øke invasivitet og metastatisk potensial av epitel-til-mesenchymale overgang (EMT) [12] – [16]. Det har blitt foreslått at den lave forekomst av CTCs detektert i pasienter med fremskreden NSCLC ved hjelp av CellSearch systemet kan skyldes tap av EpCAM uttrykk [17], noe som indikerer at EpCAM-baserte CTC isoleringsmetoder ikke kan oppnå stabil og reproduserbar CTC utvinning fra alle tumortyper.
Andre CTC isoleringsmetoder er i hovedsak basert på forskjeller i størrelse og formbarhet mellom CTCs og hematologiske celler. Ettersom tumorceller (mer enn 8 mikrometer) er større enn leukocytter [18] – [21], isolering ved størrelsen av epitel-tumorceller (Iset) kan oppnås ved hjelp av filtrering for å separere individuelle celler. Iset ved hjelp av et polykarbonatfilter, et billig, brukervennlig fremgangsmåte for å anrike CTCs, muliggjør utvinning og deteksjon av epitelial-markør-negative CTCs på basis av størrelse-avhengig CTC isolasjon. I kliniske tester, har bruk av en Iset-basert system er funnet å oppnå høyere CTC følsomhet hos pasienter med metastatisk lungekreft sammenlignet med bruk av CellSearch system [22] – [24].
Nylig microfabricated anordninger for størrelse basert separasjon av tumorceller har blitt mye utviklet for å muliggjøre en nøyaktig og effektiv anrikning av CTCs fra fullblod [25] – [28]. Disse enhetene inkluderer en miniatyrisert microcavity array (MCA) systemet som vi utviklet for svært effektiv innfanging av enkeltceller ved filtrering basert på forskjeller i størrelsen på cellene [29], [30]. I en tidligere studie undersøkte vi anvendelse av vårt MCA system til påvisning av tilsatte tumorceller fra ubehandlet humant fullblod basert på forskjeller i størrelse og deformerbarhet mellom tumorceller og andre blodceller [31]. Ved hjelp av vår enhet, var vi i stand til å fange kreftceller på størrelses- og geometri-kontrollerte microcavity matriser består av 10.000 åpninger ved å bruke undertrykk, slik at de omsluttede cellene til å være lett nummerert og analysert ved mikroskopisk avbildning av spesifiserte områder. Videre har vi funnet at bruken av miniatyrisert anordning tillatt for innføring av en rekke reagenser for påvisning av tumorceller gjennom mikrofluid struktur. Våre resultater tyder på at systemet er en enkel, men nøyaktig system for påvisning av tumorceller i fullblod. For å bekrefte og bygge videre på våre tidligere funn, sammenlignet vi kapasiteten og effektiviteten i vår romanen MCA system og dagens gullstandard CellSearch system i å utføre CTC deteksjon og telling i fullblodsprøver hentet fra en kohort av NSCLC og SCLC pasienter.
Materialer og metoder
studie~~POS=TRUNC og etikk erklæringen
Denne prospektiv studie ble utført for å evaluere CTC oppregning bruker CellSearch systemet og MCA system hos pasienter med metastatisk lungekreft i en blindet eksperiment (Umin klinisk studie registret, antall UMIN000005189). Tilstedeværelsen av CTCs ble vurdert individuelt i henhold til deres kriterier før du vet noen resultater fra hverandre. Studien inklusjonskriteriene var diagnosen patologisk påvist lungekreft med radiologisk tydelig metastatiske lesjoner, dvs. histologisk eller cytologisk bekreftet metastatisk NSCLC eller SCLC, og påmelding på Shizuoka Cancer Center. De institusjonelle gjennomgang styrene i Shizuoka Cancer Center godkjent studieprotokoll, og alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke. Fra hver av de 43 pasientene som ble rekruttert, blant dem 22 hadde blitt diagnostisert med NSCLC og 21 med SCLC, ble 10-15 ml blod samlet i EDTA-rør for CTC oppregning av MCA system i vårt laboratorium (Shizuoka Cancer Center, Shizuoka , Japan) og 20 ml ble samlet i CellSave samling rør for CTC oppregning av CellSearch system i laboratoriet av SRL Inc. (Tokyo, Japan).
Cell Kultur og merking
HCC827, NCI-H358, NCI-H441, DMS79, NCI-H69, og NCI-H82-cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection uten ytterligere testing og godkjenning. A549 (Riken Bioresource Center, Tsukuba, Japan) og PC-14 [32] ble vennlig levert av Dr. Fumiaki Koizumi (National Cancer Center, Tokyo, Japan). Den A549, HCC827, NCI-H358, NCI-H441, PC-14, DMS79, NCI-H69, og NCI-H82 NSCLC og SCLC-cellelinjene ble dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, Irvine, UK), 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), og 1% (volum /volum) penicillin /streptomycin (Invitrogen Corp.) i 3-4 dager ved 37 ° C med 5% CO
2 tilskudd. Umiddelbart før hvert forsøk ble celler dyrket til konfluens trypsinisert og resuspendert i fosfatbufret saltvann (PBS). Som et mål på tumorcellestørrelse, ble cellestørrelsesfordelingen bestemmes ved hjelp av CASY® celleteller + Analyzer Model TTC (Scharfe System GmbH, Reutlingen, Tyskland). For å evaluere ytelsen enhet, ble tumorcellelinjer som er merket med CellTracker Red CMTPX (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), med merking oppnås ved inkubering av cellene med en relativ fargestoff (5 uM) i 30 minutter. Etter at cellene var blitt pelletert ved sentrifugering (200 g i 5 min), ble supernatanten dekantert. Cellene ble deretter vasket to ganger med PBS for å fjerne eventuelt overskytende fargestoff før de ble resuspendert i PBS inneholdende 2 mM EDTA og 0,5% bovint serumalbumin (BSA).
Fabrikasjon av MCA System
MCA-system ble fremstilt på samme måte som tidligere rapportert [29], [31]. For CTC oppregning med fluorescens mikroskop observasjon, ble en MCA som hadde blitt produsert av electro av nikkel brukes. For CTC morfologisk analyse av Giemsa-farging, ble en gjennomsiktig MCA som hadde blitt fremstilt ved laserbestråling av poly (etylentereftalat) (PET) anvendes. Hver av de 10.000 hulrom anordnet i hver 100 x 100 matrise ble fremstilt for å ha en diameter på 8-9 um på toppflaten og til å være 60 um fjernt fra den tilstøtende microcavity. Poly (dimetylsiloksan) (PDMS) strukturer ble fremstilt og deretter integrert med den MCA slik at den øvre substrat bestod av et mikrokammeret, en prøveinngang, og et utløp, mens det nedre substratet under MCA inneholdt en vakuumledning for å frembringe undertrykk slik at cellen entrapment. CTC isolasjonsanordningen ble konstruert ved å sette sammen den MCA, mens de øvre og nedre PDMS lag ble konstruert ved å bruke avstandsbånd (figur 1a). Prøven innløp var koblet til et reservoar, mens vakuummicrochannel ble forbundet med en peristaltisk pumpe.
(a) Skjematisk fremstilling av oppbygningen av MCA-systemet. (B) Scanning elektronmikroskop bilde av en dyrket tumorcellelinje fanget på MCA-systemet. (C-f) Celler isolert fra SCLC pasientens blod farget med Hoechst 33342 (c) og fluorescensmerkede antistoffer som er rettet mot cytokeratin (d) og CD45 (e). Sammenslåing av bildene (f) tillatt for identifisering av CTCs og hematologiske celler. Scale bar = 60 mikrometer.
CTC Enumeration hjelp av MCA System
Menneskeblodprøver ble samlet inn i en samling rør med EDTA for å hindre koagulering og brukes innen 2 timer. Den gjennomsnittlige volumet av blod analysert var 4,0 ml per prøve (rekkevidde, 3,0 til 7,5 ml). Alle CTC oppregning bruke MCA systemet ble utført uten kjennskap til pasientens kliniske status i laboratoriet i Shizuoka Cancer Center Research Institute. Etter innføring av blodprøver i reservoaret, ble negativt trykk påføres på en cellesuspensjon ved bruk av en peristaltisk pumpe som er koblet til en vakuumledning, slik at prøven som skal føres gjennom mikrohulrom ved en strømningshastighet på 200 mL /min. For å fjerne eventuelle gjenværende blodceller i matrisen, PBS inneholdende 2 mM EDTA og 0,5% BSA (1 ml) ble innført i reservoaret og føres gjennom mikrohulrom ved en strømningshastighet på 200 mL /min i 5 min.
å farge CTCs med anti-pancytokeratin antistoff ble fanget cellene fiksert ved å strømme 400 ul av 1% paraformaldehyd (PFA) i PBS gjennom MCA ved en strømningshastighet på 20 mL /min i 20 min. Etter vasking med 100 ul av PBS, ble cellene behandlet med 300 mL av 0,2% Triton X-100 i PBS ved en strømningshastighet på 20 mL /min i 15 min. Etter permeabiliseringen ble cellene behandlet med 3% BSA i PBS ved en strømningshastighet på 20 mL /min i 30 min. For å identifisere CTCs og leukocytter, 600 ul celle-fargeløsning inneholdende 1 pg /ml Hoechst 33342 (Molecular Probes); en cocktail av anti-pancytokeratin antistoffer (Alexa488-AE1 /AE3 (1:100 fortynning, eBioscience, San Diego, CA, USA) og FITC-CK3-6H5 (1:60 fortynning, Miltenyi Biotec, Auburn, California CA USA); og PE-merket anti-CD45-antistoff (1:120 fortynning, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ble strømmet gjennom mikrohulrom ved en strømningshastighet på 20 mL /min i 30 minutter Endelig matrisen ble vasket med 400. . ul PBS inneholdende 2 mM EDTA og 0,5% BSA for å fjerne eventuelt overskytende fargestoff Etter utvinning av tumorceller, et bilde av hele cellegruppe-området ble oppnådd ved bruk av et fluorescens mikroskop (BX61, Olympus Corporation, Tokyo, Japan) integrert med 10 × objektiv og en datamaskin-opererte motorisert stadium, WU, NIBA, og WIG filtersett, en avkjølt digitalkamera (DP-70, Olympus Corporation);., og Lumina Vision oppkjøpet programvare (Mitani Corporation, Tokyo, Japan)
i kliniske studier, et helt bilde av cellegruppe området hadde blitt oppnådd ved bruk av en fluorescens mikroskop (Axio Imager Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland) integrert med en 10 × eller 20 × objektiv og et data opererte motoriserte scenen; Wu, FITC, og Texas rødt filter sett; et digitalt kamera (AxioCam HRc, Carl Zeiss); og AxioVision oppkjøpet programvare (Carl Zeiss). Deretter bildeanalyse hadde blitt utført og gjenstander som fornøyd forhåndsbestemte kriterier hadde blitt talt. Fluorescerende intensitet og morfometriske egenskaper, slik som cellestørrelse, form og kjernestørrelse, ble vurdert ved utførelse CTC identifikasjon og ikke-tumorcelle utelukkelse, med celler kjennetegnet ved en rund til oval morfologi og en synlig kjerne (dvs. som Hoechst-33342 positiv) som var positive for cytokeratin og negativ for CD45 identifisert som CTCs. Isolerte CTCs på den transparente MCA ble også farget ved anvendelse av en May-Grünwald-Giemsa (MGG) fargemetode som består av fiksering med 4% PFA, ufortynnet May-Grünwald flekk i 2 minutter, May-Grünwald flekk fortynnet 50% i PBS i 1 min og Giemsa beis for 18 min, etterfulgt av skylling med PBS i 1 min.
CTC Bestemmelse ved hjelp av CellSearch System
Fullblodprøver blod~~POS=TRUNC prøver~~POS=HEADCOMP ble opprettholdt ved romtemperatur over natten sendt til laboratoriet av SRL Inc., og behandlet innen 96 timer etter prøvetaking. Alle CTC evalueringer ble utført uten kjennskap til pasientens kliniske status i laboratoriet, og resultatene ble rapportert kvantitativt som antall CTCs /7,5 ml blod. CTCs ble definert som EpCAM-isolerte intakte celler som viser positiv farging for cytokeratin og negativ farging for CD45. I samsvar med tidligere evalueringer av CellSearch systemet [8], ble en pasient regnes CTC positivt hvis ≥2 CTCs /7,5 ml blod ble funnet i pasientens prøven.
Resultater
CTC Isolation og bildeanalyse ved hjelp av MCA System
Isolering og farging av tumorceller fra fullblod ble fullført i løpet av 120 til 180 minutter, og bilde skanning av MCA ble utført ved 3 fluorescens-bølgelengder ved hjelp av en 10 x eller 20 x objektiv og en motorisert stadium. Figur 1b-f viser scanning electroscope mikroskopi (SEM) og fluorescens bilder av de fargede celler som ble gjenvunnet på MCA. Som det kan observeres, var enslig celler og cellegrupper individuelt fanget og fastholdt på mikrohulrom som lett kan foreskrives. Gjenvunnet celler som hadde en runde til ovale morfologi og en synlig kjerne (dvs. var Hoechst 33342 positiv) og var positiv for pancytokeratin og negativ for CD45 ble identifisert som kreftceller, mens CD45-positive celler ble identifisert som forurenser normale hematologiske celler. Bildene viser at det foreligger en tydelig immunfenotypen av epitel cellemarkør-positive tumorceller. Selv om en rekke leukocytter ble beholdt på tabellen, tumor-celle telling var relativt lett fordi enkelte cellene hadde blitt fanget på nøyaktig justert mikrohulrom.
Følsomhet for MCA System i CTC Påvisning av Lung Cancer Cell Lines
i vår forrige undersøkelse, varierende antall celler av lungekreft cellelinje NCI-H358 ble tilsatt i blodet, og tumor celleisolasjon ble evaluert ved hjelp av vår MCA system [31]. Den beregnede deteksjonseffektivitet var konstant og over 90% ved 10-100 tumorceller var tilstede per milliliter blod. I denne studien, for å evaluere utnyttelsesgrad av forskjellige lungecancer cellelinjer ved hjelp av MCA-systemet 100 celler av hver av åtte lungecancercellelinjer (A549, HCC-827, NCI-H358, NCI-H441, PC-14 , DMS-72, NCI-H69, og NCI-H82) ble tilsatt i friske donorblodprøver og deretter behandlet av MCA-analyse. Tabell 1 viser de gjennomsnittlige utvinningseffektivitet og typisk diameter av cellelinjene. Som det kan observeres, var en høy utvinningsgrad oppnås, uavhengig av tumortype, som strekker seg fra 68% til 100% i cellelinjen pigg-i eksperimenter. De fleste av de gjenvundne celler var levedyktig og i stand til å formere seg selv etter under isoleringsprosessen, noe som tyder på muligheten for videre biologisk og molekylær analyse av CTCs.
neste, for å evaluere spesifisiteten og sensitiviteten av CTCs deteksjon, følsomhetstester ble utført på kunstige prøver fremstilt ved å tilsette 1 og 3 dyrkede NCI-H358-celler for å friske donorblodprøver, som tidligere rapportert av Vona et al. [20]. Ett og 3 dyrkede NCI-H358-celler ble tilsatt i separate 7,5 ml alikvoter av blod. Disse 7,5 ml blodprøver ble behandlet med MCA system i 3 uavhengige tester (Tabell S1). Resultatene viste en sensitivitetsterskelen for MCA system i nærheten av en tumor celle per 7,5 ml blod. I tillegg CTCs var ikke detekterbare fra 6 friske donor blodets ved hjelp av MCA-systemet (figur 2). Derfor ble en pasient betraktet som positive hvis CTC ≥1 CTCs per 7,5 ml blod ble gjenkjent av MCA-systemet.
CTC telle /7,5 ml blod er vist til 6 friske donorer, 22 NSCLC og 20 SCLC pasientene .
i tillegg tumorcelleutnyttelsesgrad av MCA system ble sammenlignet med den til Iset system (figur S1). I denne sammenligningen ble 100 celler av NSCLC cellelinje NCI-H358 tilsatt i friske donor blodprøver og deretter behandles av MCA system og et spor-etset polykarbonat 8-mikrometer pore membran (Nucleopore, Whatman Ltd., Kent, UK). Resultatene viste utvinningsgraden ved hjelp av MCA-systemet (100% ± 5%) for å være vesentlig høyere enn ved bruk av Iset systemet (91% ± 2%) (p 0,05, t-test), som indikerer at bruken av MCA systemet muliggjør CTC isolasjon med en effektivitet tilsvarende eller større enn den Iset system.
CTC Enumeration bruker CellSearch system og MCA system
for å gjennomføre blind sammenligning av følsomhet av CellSearch og MCA-systemer, blodprøver ble samlet fra 22 metastatisk NSCLC og 21 SCLC pasienter mellom april 2011 og februar 2012 og analysert for bestemmelse av antallet pasienter identifisert som positive ved CTC hvert system (tabell 2). Av disse prøvene, en prøve fra en pasient SCLC ble ikke evaluert av MCA system fordi en utilstrekkelig mengde blod var blitt innsamlet for behandling av begge systemene. Som et resultat ble 17 av de 22 (77%) NSCLC identifisert som CTC positivt ved hjelp av MCA-systemet men bare 7 av de 22 (32%) NSCLC ved hjelp av CellSearch systemet (tabell 3). Av disse pasientene, åtte ble identifisert som CTC positivt av både CellSearch systemet og MCA system, en ble identifisert som CTC positive ved bare CellSearch system, og ni ble identifisert som CTC positive ved MCA systemet bare. Tatt i betraktning de oppnådde resultater ved begge systemene sammen, 18 (82%) av NSCLC ble identifisert som CTC positiv. Analyse av disse funnene viste at et betydelig større antall NSCLC pasienter ble identifisert som CTC positive ved MCA system (median celletall 13, range 0-291 celler /7,5 ml, figur 2) enn ved CellSearch system (median legemer 0 , range 0-37 celler /7,5 ml), som viser den statistiske overlegenhet av MCA system i CTC oppregning (p = 0,0015, Wilcoxon test;. tabell 3)
i motsetning til 20 av de 20 (100%) SCLC pasienter ble identifisert som positive ved hjelp CTC MCA system versus 12 av de 21 (57%) pasienter ved hjelp av CellSearch system. Median CTC telling ble funnet å være 2 celler /7,5 ml (variasjon 0-325) ved hjelp av CellSearch system og 23 celler /7,5 ml (range 2-2329) ved hjelp av MCA system (figur 2). Selv om det ikke nådde et nivå av statistisk signifikans, påvisning følsomheten av MCA-systemet i CTC telling viste en trend mot å bli større enn den til den CellSearch system (p = 0,2888, Wilcoxon test; tabell 3). For hvert utfall, ble avtalen mellom testresultatene av systemene vurderes av Bland-Altman plott [33]. I analysen av avtale om CTC oppregning i NSCLC pasienter var gjennomsnittlig forskjell var 50,1 (95% CI, rekkevidde 11,1 til 89,1), med grensene for avtalen strekker seg fra -125,8 til 226,0. MCA system gitt uforholdsmessig høyere CTC teller ved høyere gjennomsnittsverdier i forhold til den CellSearch system (figur S2A). I motsetning til i analysen av avtale om CTC oppregning i SCLC pasienter var gjennomsnittlig forskjell var 202,6 (95% CI, rekkevidde -116.7-521.9), med grensene for avtalen strekker -1.162,0 til 1567,2. I motsetning til med analyse av NSCLC blodprøver, ble det ikke observert skjevhet mellom systemene i analysen av SCLC prøvene unntatt pasienter med ekstremt høy CTC titer (figur S2B). Statistisk analyse også viste ingen sammenheng mellom stedet for metastaser og CTC telling av lungekreftpasienter ved hjelp av enten system (data ikke vist).
Morfologiske egenskaper av CTCs Isolerte bruke MCA System
CTCs var telles, identifisert som cytokeratin positiv og negativ CD45, og som har en synlig kjerne på grunnlag av analyse av fluorescerende bilder. Som det kan observeres i figur 3, som viser et representativt galleri av CTCs identifisert ved bildeanalyse, CTCs er større enn de omkringliggende leukocyttene og forekommer ofte i klynger, definert her som en sammenhengende grupperinger av celler inneholdende 3 eller flere kjerner. Figur 4 viser en enslig CTC CTC og en klynge detektert i en SCLC pasient ved hjelp av MCA-systemet. Ved hjelp av MCA-systemet, ble CTC klynger observert i 2 av de 22 NSCLC (pasient nr 13 og 21) og fire av de 21 SCLC pasienter (pasient nr 31, 33, 34, og 43). May-Grünwald-Giemsa farging av CTCs isolert med MCA system avslørte at de er preget av et høyt N /C-forhold, kjernekraft molding, og morfologisk likhet med primærtumorceller.
Celler ble farget med Hoechst 33342 , FITC-merket anti-cytokeratin antistoff, og PE-merket anti-CD45 antistoff.
May-Grünwald-Giemsa-fargede celler viste en høy kjerne-cytoplasma ratio og kjernekraft molding (× 40). Svart pil viser 9-mikrometer microcavity. Scale bar = 60 mikrometer.
Diskusjoner
Iset systemer har blitt funnet å ha høyere CTC følsomhet enn CellSearch systemet i flere krefttyper, inkludert NSCLC [17], [22] Men porene i Iset filtre, som er laget av polykarbonat med spor etsing, er tilfeldig plassert innenfor systemene ved en ujevn tetthet. I motsetning til slike skinne etset polykarbonatfiltere, er den størrelse, geometri, og tettheten av mikrohulrom i MCA-systemet vurderes i denne studien kontrolleres nøyaktig for å oppnå spesifikk celleseparasjon i henhold til forskjeller i cellestørrelse og deformerbarhet. Justere celler på MCA letter ikke bare cell imaging ved å tillate for skanning av spesifiserte områder med en automatisert fluorescens mikroskop, men gjør det også reduksjon i arbeid som kreves for CTC telling [29], [31]. Som sådan tilveiebringer MCA system en plattform for bruk av high-throughput avbildningsteknologier som gir raskere og rimeligere datainnsamling samt CTC telling og avansert analyse av molekylære fenomener, inkludert fluorescens in situ hybridisering for påvisning av tumor-spesifikke genomisk endringer. Videre er MCA integrert med en miniatyrisert anordning slik at anrikning av CTCs fra blod, samt farging og vasking i mikrofluid analysen kan utføres i løpet av en integrert enhet.
I den foreliggende undersøkelse, CTCs isolert på MCA ble med hell farget med fluorescensmerkede antistoffer som er rettet mot tumorcellemarkører, og farging og vasking ble funnet å ha liten eller ingen effekt på retensjonen av tumorceller på mikrohulrom. På grunn av sin lille størrelse, er den MCA system bærbar, som, ved at point-of-care CTC telling, eliminerer behovet for å sende blod for testing under ugunstige forsendelse betingelser og ekspederer klinisk beslutningstaking. Disse funksjonene, i tillegg til vår nylig utviklet prosedyre for å isolere enkeltceller fra MCA bruker mikrokapil, tillate kreftceller til å bli utvunnet fra MCA for påfølgende molekylære analyser av CTCs [29].
I denne blind sammenligning av bruk av MCA system som i den konvensjonelle CellSearch system for CTC oppregning i lungekreftpasienter, ble MCA systemet som finnes i stand til å isolere forskjellige lungecancercellelinjer tilsatt i løpet av helblod ved høye nivåer av effektivitet. Imidlertid MCA system utførte isolering av SCLC-cellelinjer noe mindre effektivt sammenlignet med NSCLC-cellelinjer, noe som indikerer at det er små ( 8 mikrometer i diameter) celler av SCLC-cellelinjene kan passere gjennom den mikrohulrom under blodfiltrering. I en tidligere studie [31], fant vi at brystkreft (MCF-7 og Hs578T), mage (AGS og SNU-1), og tykktarmen (SW620) tumorcellelinjer som inkluderer EpCAM-negative tumorceller kan bli gjenopprettet ved hjelp av MCA-system med mer enn 80% effektivitet. Imidlertid, har vi også funnet at effektiviteten av utvinning av små celler (gjennomsnittlig diameter 11,6 um) av tumorcellelinjen SW620 til å være litt mindre enn den til andre cellelinjer, slik vi gjorde av SCLC-cellelinjene som ble undersøkt i dette studiet.
MCA system vurderes i denne studien ble funnet å ha en høyere følsomhet enn CellSearch system i NSCLC CTC oppregning, noe som tyder overlegenhet størrelses- og formbarhet baserte isoleringsmetoder i forhold til immunomagnetiske-baserte teknikker. De fattige følsomheten CellSearch har blitt tilskrevet den lave EpCAM uttrykk i avansert NSCLC. Men en av de NSCLC pasienter vurdert i denne studien ble funnet å være CTC positiv bruker CellSearch systemet, men CTC negativ bruke MCA system, noe som indikerer at endringer i EpCAM uttrykk ikke kan utelukkende gjøre rede for forskjellene som finnes mellom de to systemene i NSCLC oppregning .
CTC deteksjonsraten ved hjelp av CellSearch system i SCLC pasienter var 67%, som er betydelig høyere enn i NSCLC og i samsvar med det som finnes i tidligere studier [7], [34] – [36]. Selv om MCA-systemet ikke er avhengig av EpCAM uttrykk, som sirkulerer SCLC-celler er blitt rapportert å vise høye nivåer [37], i å utføre CTC isolert bruken ble funnet å gi en høy deteksjonsrate, noe som indikerer at det kan brukes for CTC deteksjon i ikke bare NSCLC men også SCLC pasienter. Likevel er CTC tellinger av flere pasienter var høyere når det analyseres ved hjelp av CellSearch System i forhold til MCA-systemet, noe som indikerer at noen små tumorceller i pasientens blod kan strømme gjennom mikrohulrom, slik det er beskrevet ovenfor. Tidligere undersøkelser har antydet at immunomagnetiske separasjonsteknikker mangler evnen til å isolere store klynger, mens bruk av størrelses-baserte separasjonsteknikker fører til tap av små CTCs [17]. For å løse disse problemene, er formen av de mikrohulrom i MCA modifisert for å forbedre deres effektivitet i å isolere små celler fra tumorceller i fullblod i vår nylig studie [38].
Observasjon av CTC klynger er blitt rapportert i en rekke kreftformer, inkludert lungekreft [23], [24], [39] – [42]. Det er en hypotese som dannes i klynger gir CTC celler med fordeler over gjenværende ensom når det gjelder overlevelse, proliferativ kapasitet og evne til å danne mikrometastaser. I denne studien ble CTC klynger isolert fra både NSCLC og SCLC pasienter ved hjelp av MCA system. Interessant nok ble CTC-positive klynger identifisert som å ha et lite antall CTC celler ved CellSearch system, men et stort antall av MCA-systemet. En grunn til at flere SCLC pasienter ble funnet å ha en stor CTC telling når vurdert av MCA-systemet kan være at dette system gjør det mulig for isolering av større CTC klynger som ikke kan isoleres ved immunomagnetisk separasjon. Undersøkelse av denne hypotesen krever videre detaljert analyse av egenskapene til CTC klynger, som uttrykk for epitel-markører og tilstedeværelse av apoptotiske celler innenfor CTC klynger, som kan bli utført ved hjelp av MCA-systemet.
Som konklusjon, vår
