Abstract
Mål
cervicovaginal væske (CVF) kan betraktes som en potensiell kilde til biomarkører for sykdommer i nedre kvinnelige skjede. Væsken kan lett bli samlet inn, dermed gir nye muligheter som for eksempel utvikling av selvtester. Vårt mål var å identifisere en CVF protein biomarkør for livmorhalskreft eller dets forstadier tilstand.
Metoder
En differensial proteomikk studie ble satt opp ved hjelp CVF prøver fra friske og forstadier til kvinner. Etikett-fri spektral telling ble brukt for å kvantifisere protein hopetall.
Resultater
proteom analyse avslørte 16 kandidat biomarkører for hvilke
alpha-actinin-fire plakater (p = 0,001) og
pyruvat kinase isozyme M1 /M2 product: (p = 0,014) var mest lovende. Verifisering av
alpha-actinin-4
av ELISA (n = 28) viste at denne kandidaten biomarkør diskriminert mellom prøver fra friske og både lav risiko og høy risiko HPV-smittet kvinner (p = 0,009). Ytterligere analyser av langsgående prøver (n = 29) viste at
alpha-actinin-4
nivåer korrelerte med virus utholdenhet og clearing, med diskriminering på ca 18 pg /ml.
Konklusjoner
Våre resultater viser at CVF er en utmerket kilde til protein biomarkører for påvisning av lavere kvinnelige kjønnsorganer patologi og at
alpha-actinin-4
avledet fra CVF er en lovende kandidat biomarkør for forstadier staten livmorhalskreft. Videre studier angående sensitivitet og spesifisitet av denne biomarkøren vil demonstrere sitt verktøy for å forbedre dagens screeningprogrammer og /eller bruken for en livmorhalskreft selvdiagnose test
Citation. Van RAEMDONCK GAA, Tjalma WAA, Coen EP, Depuydt CE, Van Ostade XWM (2014) Identifisering av protein Biomarkører for livmorhalskreft med humane cervicovaginal Fluid. PLoS ONE ni (9): e106488. doi: 10,1371 /journal.pone.0106488
Redaktør: Rakesh N. Veedu, The University of Queensland, Australia
mottatt: 24 mars 2014; Godkjent: 01.08.2014; Publisert: 12. september 2014
Copyright: © 2014 Van RAEMDONCK et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. GVR mottatt tilskudd fra Institutt for vitenskap og teknologi (https://www.iwt.be/english/welcome) (prosjekt nr . 093132). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Christophe Depuydt erklærer at han er en arbeidsgiver av Sonic Health Benelux, Emiel Vloorstraat 9, 2020 Antwerpen, Belgia og at den beste av sin kunnskap, er det ingen interessekonflikter, og heller ikke økonomisk, faglig eller personell, mellom hans virksomhet i Sonic Health Benelux og dette manuskriptet [pone-D-14-13187] ( «Identifisering av protein biomarkører for livmorhalskreft ved hjelp av menneskelig cervicovaginal flytende «). Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
humant papillomavirus (HPV) er ansvarlig for nesten alle tilfeller av livmorhalskreft [1]. Selv om mer enn 150 varianter av dette viruset eksisterer, blir bare visse genotyper, slik som HPV 16, 18, 33, 45 og 58 er kjent som høy-risiko-typer (HR-HPV) [2]. Lavrisiko HPV-typer (LR-HPV), hovedsakelig HPV 6 og 11, sjelden forårsake kjønns svulster; men de forårsaker condylomata acuminata (anogenitale vorter) [3]. Vedvarende HPV oncoproteinet uttrykk (E6 /E7) i HPV infiserte epitelceller basal celler deregulates celledeling [4]. Overekspresjon av disse virale gener bevirker at deregulering av celleproliferasjon, metabolisme, apoptose, differensiering og genomiske ustabilitet, som alle kan føre til påfølgende stadier av livmorhals intra-epitelial neoplasi (CIN1, 2 og 3) eller squamous intra-epitelial lesjoner (low -grade SIL og høyverdig SIL). Omtrent 85% av alle seksuelt aktive personer vil bli utsatt for HPV, og de fleste av alle HR-HPV-infeksjoner som virusproduserende (som er begrenset i tid) som tyder på at i tillegg til det virale genotype er flere kofaktorer nært forbundet med persistens av de virale oncoproteiner og transformasjon av den cervikale slimhinnen til ondartet vev [5], [6].
det er flere grunner til at utvikling av en diagnostisk analyse, basert på cervicovaginal fluid (CVF), for tidlig påvisning av livmorhalskreft ville være fordelaktig. Til å begynne med dagens screeningsanalyser ikke er optimale. På grunn av den høye forekomsten av livmorhalskreft, er kvinner i alderen 25 og 65 ofte vist ved hjelp Pap (anicolaou) flekker, en test som er basert på påvisning av morfologiske endringer i livmorslimhinneceller. Dessverre kan den lave sensitiviteten av denne testen gi livmorhalskreft diagnostisert på et sent stadium [7]. Data for randomiserte forsøk viser at HPV DNA screening er mer følsom enn cytologi, men spesifisiteten er lavere, noe som uunngåelig vil føre til en overbehandling fordi omtrent 80% av HPV-positive pasienter spontant fjerne viruset [3]. I tillegg er colposcopic undersøkelse arbeidskrevende, vanskelig å automatisere og sårbare for inter- og intra-observatørvariasjon [8]. Innføringen av en ny biomarkør som hjelper bedre sensitivitet og spesifisitet av dagens screeningprogrammer er derfor mer enn velkommen. Den andre årsaken ligger i anvendelsen av CVF for diagnose. Fordi fluid kan lett bli samlet inn av individet ved hjelp av spesielle enheter [9], er en rask og enkel test på grunnlag av et målepinne analyse, utført av kvinnen selv, kunne utvikles. En slik selvtesten kan bli introdusert f.eks i ressursbegrensede populasjoner hvor ulik belastning av livmorhalskreft ofte oppstår. Faktisk er det anslått at bare 5% av kvinner i lav ressurs land blir screenet hensiktsmessig for livmorhalskreft [10]. Mangel på helsetjenester infrastruktur og finanskostnader er de viktigste årsakene til at cytologi-baserte programmer ikke er implementert. Siden alternative metoder er for tiden undersøkt i disse regionene, kan bruk av en CVF basert selvdiagnose test vurderes. I tillegg kan selvtester også brukes i oppfølgingsstudier av vaksinasjonsprogrammer da effekten av vaksinering i seksuelt aktive kvinner er usikkert [11]. Videre har eksisterende vaksiner bare adresse neoplasi-induserende genotyper HPV16 og -18 som tyder på at under ideelle forhold, kan bare maksimalt 70% av alle tilfeller av livmorhalskreft forebygges [7], [12]. Dermed i hvert fall for de neste tiårene, er nøye vurdering av vaksinasjonsprogrammer anbefales sterkt, og en enkel selvdiagnose test kan hjelpe mye i å møte dette spørsmålet.
I det siste, ble flere proteomikk studier utført for å identifisere biomarkører for (tidlig) påvisning av livmorhals neoplasi. I forskjellige studier, forstadier og sunn cervical vev ble sammenlignet og Lee
et al.
Studerte
in vitro
bidrag oncoprotein E7 til utvikling av livmorhals neoplasi ved hjelp av en HPV-infisert cellelinje [ ,,,0],13] – [20]. Flere markører som var knyttet til feilregulering av normal cellesyklus, slik som p16, Ki67 og cyclin E ble karakterisert. Disse funnene ført til bedre forståelse av HPV-indusert kreftutvikling, men så langt har de alle viste lav sensitivitet og /eller spesifisitet og derfor ikke kunne brukes i klinikken.
For biomarkører og validering, kroppsvæsker er bedre enn vevsprøver fordi følgende fordeler er iboende til de fleste kroppsvæsker: (1) lett tilgjengelighet; (2) unngåelse av prøvetaking risiko; og (3) flersamplings potensiell [21]. I dag er plasma det mest analyserte biologisk væske i jakten på biomarkører og det har allerede blitt brukt i livmorhalskreft forskning [22], [23]. Men kommer plasma i kontakt med nesten alle organer i kroppen, noe som gjør plasma biomarkører mindre spesifikk, fordi det er vanskelig å fastslå hvor organ de stammer [21].
CVF kan fås ved cervicovaginal LAVAGES, vaginale vattpinner , tamponger eller med en enhet for selv prøvetaking [9], [24] og har følgende fordeler over plasma: (1) det har en lavere væskevolum /orgel-forhold sammenlignet med plasma, noe som resulterer i høyere følsomhet; og (2) det kommer i kontakt med færre organsystemer, som mest sannsynlig øker spesifisiteten av markørene [21], [25]. I denne studien har vi fokus på identifisering av kandidat biomarkører for livmorhals neoplasi ved å sammenligne protein sammensetningen av enkelt CVF prøver fra friske og forstadier (LSIL og HSIL) kvinner. Våre funn tyder på at
alpha-actinin-fire plakater (ACTN4) er en lovende kandidat biomarkør for forstadier tilstand av livmorhalskreft og at dette CVF protein er svært godt egnet for utvikling av en selvdiagnose test.
Materialer og metoder
studie~~POS=TRUNC og prøvetaking
Alle pasientene ble enige om å delta med skriftlig samtykke og studien ble godkjent av den etiske komiteen av Antwerpen universitetssykehuset (registreringsnummer : B30020108372). Studie spesielle pasientidentifikasjonskoder ble tildelt og overført på en slik måte at pasientens konfidensialitet ble bevart.
Alle prøvene i denne prospektive, blindet, kohortstudie ble tatt av den samme gynekolog (WAAT). Ved unormale celleprøve resultater (på grunn av HPV-infeksjon, eller som et falskt positivt resultat), blir både friske og forstadier til pasienter rutinemessig utsatt for en colposcopic undersøkelse, en fremgangsmåte som omfatter rensing av vagina med 5% eddiksyre. Etter kolposkopi denne vaskevæske (inneholdende det cervicovaginal væske) kastes normalt, men ble oppsamlet for proteomikk analyse. I tillegg ble cervikal cytologiprøvene oppsamlet i løpet av denne colposcopic undersøkelse for å fastslå cytologi og HPV-status som tidligere beskrevet ved hjelp av typespesifikke PCR [26]. Alle BD-SurePath flytende basert cytologiprøvene ble sendt til patologi laboratorium (RIATOL, Institutt for molekylær diagnostikk, Sonic Health Benelux, Antwerpen, Belgia) for behandling. Basert på en kombinasjon av colposcopic resultater, cytologi utfall og HPV genotyping, sunne og forstadier til kvinner kunne identifiseres på en pålitelig måte. Vi valgte prøvene stammer fra seks sunt (normal kolposkopi /cytologi og HPV negative; gruppe A) kvinner og seks forstadier (unormal kolposkopi /cytologi og HR-HPV positive, gruppe B) individer (tabell 1). Alle prøver ble hentet fra postmenopausal ( tre år etter siste menstruasjon) kvinner fra samme aldersgruppe (59 +/- 13 år). Pasienter som brukte medisiner ble ekskludert fra studien. Dessuten ble pasienter som viste synlige tegn på gynekologiske infeksjoner (f.eks gonoré) eller lidd en HIV-infeksjon utelukkes også. Basert på cervicovaginal fluidprøvene, ble pasientene testet for Trichomonas vaginalis. Under proteomikk analyser, ble friske og forstadier CVF prøver alltid analysert i par for å minimere tekniske varianter av LC-MS /MS-plattformen.
proteomikk analyse
Etter samling, de cervicovaginal LAVAGES (25-40 ml) ble umiddelbart transportert på is til laboratoriet og lagret ved -80 ° C. Etter sentrifugering ble supernatanten konsentrert ved frysetørking til et sluttvolum på omtrent 200 pl. Proteinprøver (1 mg /prøve) ble separert og fraksjonert i den første dimensjon på en revers fase (RP) protein C4 HPLC-kolonne. Enzymatisk spalting med trypsin ble utført, og de resulterende peptidene i hver fraksjon ble separert i en andre dimensjon på en RP-C18 mikro-kapillar-HPLC-system. Massespektrometrisk analyse ble utført ved hjelp av et MALDI-TOF /TOF instrument. Resulterer MS /MS Spectra fra hver prøve ble screenet mot den menneskelige Swiss-Prot database (versjon: 57,1) med maskoten søkemotor. Analyse av de oppnådde datasettene ble utført som tidligere beskrevet [25]. Mer detaljert informasjon finner du i dokument S1 og figur S1.
Enzyme knyttet immunsorbent analyse
For å bekrefte LC-MS /MS-resultater, enzymbundet immun sorbent (ELISA) ble utført for
alpha-actinin-fire plakater (ACTN4) og
pyruvat kinase isozyme M1 /M2 plakater (PKM2), i henhold til produsentens instruksjoner. Et menneske ACTN4 ELISA kit (Cusabio Biotech Co. LTD.) Og en menneskelig PKM2 ELISA kit (USCNK Life Science Inc.) ble brukt for å kvantifisere ACTN4 og PKM2 i cervical vaginal vasker fra sunn (n = 16) og HPV-infisert (n = 12) kvinner (både før og etter overgangsalderen). I tillegg flere langsgående prøver (n = 29) ble også testet for disse to kandidat biomarkører.
statistikker
For å avgjøre om forskjellen i protein Forekomsten var betydelig, normaliserte spektra overflod faktorer (NSAF verdier ) ble underkastet statistisk testing. Fordi de valgte proteiner ble identifisert i flere prøver, og derfor også inneholdt flere NSAF-verdier, ble en ikke-parametrisk Mann-Whitney U-test brukt. Dessuten ble en chi-kvadrat-test utført, hvorved frekvensen av alle identifiserte proteiner ble analysert for å bestemme hvorvidt visse proteiner var mer eller utelukkende påvises mer under visse betingelser. Uparede Students t-tester ble utført for å analysere ELISA-resultatene. Alle statistiske tester ble utført ved hjelp av statistikkprogrammet of Social Science (SPSS versjon 18).
Resultater
Differensial studie for karakterisering av livmorhalskreft biomarkører
For å identifisere forskjellig rikelig proteiner, 12 prøver ble delt i to grupper og ble individuelt analysert ved bruk av en analytisk proteomforskning plattform (tabell 1). Gruppe A består av 6 prøver fra friske individer, mens gruppe B besto av 6 prøver fra forstadier til enkeltpersoner. Proteomikk analyse resulterte i 846 og 825 identifikasjon for gruppe A og gruppe B, henholdsvis, som representerer 371 (gruppe A) og 341 (gruppe B) ikke-redundante proteiner (figur 1). Gjennomsnittlig overlapp mellom alle prøver fra gruppe A var 54% og fra gruppe B var 53% (tabell S1).
For de sunne proteom- 371 unike proteiner ble identifisert mens 341 unike proteom for forstadier proteomet. En overlappende sett av 238 proteiner ble funnet i begge proteom.
En semi-kvantitativ analyse ble også utført basert på etiketten frie NSAF metode (tabell S2). For begge grupper, de NSAF verdiene av proteinene tilstedeværende i minst 5 av de 6 prøvene ble innbyrdes sammenlignet. Variasjonen i protein overflod mellom prøvene ble uttrykt som variasjonskoeffisienten (CV). En gjennomsnittlig CV-verdi på 60% (lavest: 19%; høyest: 134%) ble oppnådd for gruppe A (frisk), mens en midlere CV på 52% (lavest: 14%; høyest: 99%) ble notert for gruppe B .
Identifikasjon av forskjellig rikelig proteiner
for å identifisere kandidat biomarkører som korrelerer med forstadier tilstand av livmorhalskreft, sunne og forstadier til CVF proteom ble sammenlignet. En kvalitativ analyse ble utført mellom 371 identifiserte proteiner for den sunne gruppen og 341 identifikasjoner for forstadier gruppen, noe som resulterte i 238 eller 67% overlappende proteiner. Å identifisere proteiner med en statistisk signifikant forskjell på forekomsten ble alle identifikasjoner utsatt for statistisk testing med en Pearson chi-kvadrat test. Proteiner med en p-verdi ≤0.05 er listet opp (tabell 2). Ut fra disse beregningene ble ACTN4 identifisert i alle prøver fra forstadier pasienter men ikke i prøvene fra friske pasienter. Videre ACTN4 var først og fremst identifisert basert på flere unike peptider med en gjennomsnittlig MASCOT protein score på 162 (tabell S3). Forskjellen i mengden av dette protein ble ytterligere bekreftet ved hjelp av ELISA (se nedenfor).
I tillegg er det en semi-kvantitativ sammenligning utføres for å bestemme om visse proteiner som ble identifisert i både det friske og de forstadier gruppene ble uttrykt forskjellig. De NSAF-verdier for korresponderende proteinene ble statistisk testet ved anvendelse av en Mann-Whitney U-test. Kun proteiner med en statistisk signifikans av p≤0.05 er angitt (tabell 3). Denne beregningen resulterte i fire proteiner som er kjennetegnet ved en betydelig forskjell i mengde mellom de to betingelser. Bare ett protein,
haptoglobin
, viste en nedregulering i forstadier tilstand, mens tre andre proteiner,
ATP syntase subenhet beta
,
annexin A2 Hotell og PKM2 ble oppregulert. PKM2 og
annexin A2
viste den laveste p-verdi (0,01 og 0,03, henholdsvis), og ble oppdaget i fem av seks prøver fra forstadier gruppen. Fordi høyst variable proteiner er ikke egnet kandidat biomarkører, ble variasjonen i Forekomsten av disse proteinene beregnes. Med CV-verdier på 40% og 29% for den friske og forstadier gruppe for PKM2, henholdsvis, er dette proteinet mer egnet som en kandidat biomarkør sammenlignet med
annexin A2
, som hadde verdier på 77% og 48%, henholdsvis.
Verifisering av kandidat biomarkører
En ELISA ble utført for å bekrefte differensial profiler av ACTN4 og PKM2. Healthy (n = 16) og HPV-infisert prøver (både HR-HPV-onkogen (n = 8) og LR-HPV ikke-onkogene prøver (n = 4)), som ikke ble inkludert i den foregående forsøk, ble testet under anvendelse av kommersielt tilgjengelige sett (tabell 4).
Nivåer av ACTN4 var betydelig høyere i prøver fra HR-HPV infiserte individer sammenlignet med prøver fra friske, ikke-HR-HPV-infiserte pasienter (p = 0,023), som bekreftet våre LC-MS /MS-resultater. Bemerkelsesverdig, sample en, som stammer fra et ikke-HR-HPV-infisert pasient, synes å være en avvikende på grunn av den høye ACTN4 konsentrasjon på 85,6 pg /ml (se diskusjon). I tillegg er LR-HPV-infiserte pasienter hadde høyere ACTN4 konsentrasjoner i forhold til de ikke-HPV-infiserte pasienter (p = 0,052), men noe lavere verdier i forhold til HR-HPV-infiserte pasienter (p = 0,114). Sammenligning av ACTN4 nivåer i HPV-infisert (både HR og LR-infeksjoner) versus ikke-infiserte prøver (friske pasienter) viste en signifikant forskjell, med en p-verdi på 0,009 (figur 2). Den høyeste ACTN4 konsentrasjonen for den friske gruppe (unntatt for den avvikende) var 17,3 pg /ml, mens den laveste konsentrasjon for den HR-infiserte gruppen var 30,6 pg /ml. Den laveste konsentrasjon av ACTN4 i LR-infiserte gruppen var 21,3 pg /ml, som er høyere enn den høyeste verdi av den friske gruppe. Basert på disse observasjonene, kan en terskel på 18 pg /ml settes som den høyeste verdien av ACTN4 for ikke-infisert tilstand. Ingen lineær korrelasjon ble funnet mellom virusmengde og den absolutte konsentrasjonen av ACTN4, noe som forutsetter at ACTN4 er ikke bare en markør for HPV-infeksjon, men snarere for forstadier scenen.
Konsentrasjon av ACTN4 for friske individer (n = 16), HR-HPV-infiserte pasienter (n = 8) og LR-HPV-infiserte pasienter (n = 4). Statistisk testing av ACNT-4 nivåer mellom sunne og HR-HPV-infiserte pasienter resulterte i en p-verdi på 0,023 og mellom sunn kontra LR-HPV i en p-verdi på 0,052. Når HR og LR-HPV-infiserte pasienter ble gruppert som HPV-infiserte pasienter, ble en p-verdi på 0,009 funnet mellom ikke-infiserte (friske pasienter) og infiserte grupper.
I tillegg mest lovende semikvantitativ kandidat, PKM2, ble verifisert med et kommersielt ELISA-sett. For denne analysen ble de samme 28 prøver anvendt; imidlertid LC-MS /MS-resultatene ble ikke bekreftet (data ikke vist).
Vi deretter analysert ACTN4 konsentrasjonene i ytterligere 29 langsgående prøver (dvs. prøver fra den samme pasient ved flere tidspunkter) fra 9 pasienter. For hver pasient, ble et minimum på tre langsgående prøver evaluert (figur 3). Fra disse ni pasienter, fem pasienter fjernet viruset, to pasienter hadde vedvarende HPV-infeksjon, en pasient fått en ny HPV-infeksjon og en pasient var frisk. Selv om antall pasienter per gruppe er små, kan disse prøvene hjelpe oss å bekrefte våre funn. En ACTN4 ELISA ble utført på flere av prøvene for å identifisere korrelasjoner mellom virus profiler og ACTN4 nivåer i en pasient. Men i tillegg til den virustiter, også forventet vi genotypen og tidspunktet for infeksjon for å påvirke ACTN4 uttrykket fordi forskjellige virustyper har forskjellige kreftfremkallende kapasiteter og livmorhalskreft utvikler seg vanligvis etter en vedvarende HR-HPV-infeksjon [2]. Nylig ble det påvist at utviklingen av livmorhals forstadium for kreft (cervikal intraepitelial neoplasi av grad tre; CIN3) forutgås av en jevn økning i virusbelastning av et gitt HR-HPV type, mens en hurtig eksponentielt økende belastning blir vanligvis fjernet i løpet av seks til 18 måneder, og er vanligvis forbundet med lavgradige cytologiske abnormiteter [27]. Med disse faktorene i betraktning, ble følgende to trender observert fra eksperimentene: (1) pasienter som hadde et tidlig stadium infeksjon (pasient 1) eller fjernet viruset (pasienter 2, 6, 7 og 9) hadde økende eller synkende ACTN4 nivåer, henholdsvis, og pasienter med ingen eller lave infeksjoner (pasient 5) eller kontinuerlig infeksjoner (pasienter 4 og 10) hadde stabile lave eller høye ACTN4 nivåer, henholdsvis; og (2) for en vedvarende infeksjon (pasient 1, 4 og 10), den ACTN4 akkumulert.
Sammenligning av ACTN4 nivåer med genotype og virusmengde i langsgående prøver fra 9 forskjellige pasienter. Liknende genotyper er illustrert i de samme farger. På venstre side av virusmengde (i antall kopier /celle) blir vist på en logarithmical skala, mens på høyre side konsentrasjonen av ACTN4 er uttrykt i pg /ml. Y-øks indikerer tiden (i dager), mens pasientene ble fulgt. En svart stiplet linje illustrerer ACTN4 grense på 17,3 pg /ml. ACTN4 nivåer ble bestemt på tidspunkter når en CVF prøven var tilgjengelig.
Diskusjoner
karakteriserer CVF proteomet av sunne og forstadier til kreft pasienter
I denne studien var CVF proteom fra 12 (6 sunn og 6 forstadier) enkeltprøver ble karakterisert til å identifisere kandidat protein biomarkører for påvisning av forstadier tilstand av livmorhalskreft. Analysen av disse 12 prøvene ble utført både ved kvalitativ (liggende /fraværende) og semi-kvantitative nivå. Antallet av protein identifikasjon for hver av prøvene er meget forenlig med tidligere utførte proteomic studier av CVF [28].
bestemmelse av mengden av overlappende proteiner mellom prøvene innenfor en gruppe viste signifikante forskjeller. Bare 10% av alle proteiner ble observert i hver enkelt prøve fra begge grupper. Denne gruppen består i hovedsak av proteiner som er karakteristisk for CVF proteomet, basert på deres lokalisering og biologisk funksjon. Vi kaller derfor disse proteinene «karakteristiske proteiner». Imidlertid et betydelig antall identifikasjoner, slik som intracellulære proteiner, er mindre karakteristisk for CVF proteome. Dette funn kan forklares ved prosesser såsom avbrudd av epitelcellelaget under prøvetaking og avgivelse av døde epitelceller. Vi har derfor gruppere disse identifikasjoner som «ikke-karakteristiske» proteiner. Basert på disse funnene, som er felles for nesten alle omfattende CVF proteomikk studien, kan man gjøre et skille mellom en «kjerne proteomet» over ofte identifisert karakteristiske CVF proteiner og en «variabel proteom-» som inneholder ikke-karakteristiske CVF proteiner [28] .
i forhold til gjennomsnitts CV verdiene av de vanlige identifikasjoner mellom tre tekniske replikater (25%) [25], de middel CV verdier av protein overflod i sunn og forstadier til prøvene (60% og 52%, henholdsvis) var betydelig høyere. Dette resultatet var forventet fordi, i motsetning til de tekniske gjentak, prøvene ikke var identiske. I alle prøvene, ble proteiner med høy interindividuelle forskjeller observert (opp til 134%), mens den målte middelverdi CV av de «karakteristiske proteiner» var 38%. Disse resultatene er lik andre proteomic studier av kroppsvæsker. For eksempel Yamakawa
et al.
[29] fant en gjennomsnittlig CV verdi på 63% for sædvæske proteomet, og ifølge Anderson
et al.
[30], er gjennomsnittlig CV verdien av en serie av plasmaproteiner ca 45%.
Identifikasjon av forskjellig rikelig proteiner
for å undersøke differensial rikelig proteiner, en etikett-fri spektral tellemetoden ble utført. Som denne metoden tillater kun for en semi-kvantitativ analyse, ble fremragende effekter først etterforsket som disse vanligvis gi de mest pålitelige resultater. Derfor må vi først forfulgt proteiner som deres tilstedeværelse eller fravær i forstadier gruppen var karakteristisk for en gitt tilstand. Statistisk testing (chi-kvadrat-test) resulterte i 12 proteiner med en signifikant forskjell på forekomsten (p 0,05), hvorav 6 proteiner ble utelukkende identifisert i forstadier til prøvene (tabell 2). Den mest betydningsfulle proteiner var ACTN4 (Acc No: O43707), som ble identifisert i alle forstadier eksempler, men ingen av de friske prøver (p = 0,001). Spesielt, SCCA-en, ofte brukt som plasma biomarkør for livmorhalskreft [31], ble også identifisert, men med en høyere p-verdi (p = 0,046).
ACTN4 er en kritisk komponent i cytoskjelettet og er som er involvert i dannelsen av celle-celle adhesjon [32]. Det er blitt vist at inhibering av visse membranbundne adhesjonsmolekyler forårsaket av en ondartet transformasjon resulterer i en reduksjon av celle-celle adhesjon styrke og oppregulering av ACTN4 [33]. Basert på en undersøkelse av knockdown ACTN4 ved hjelp av brystkreftceller, Khurana
et al.
Demonstrerte at ACTN4 var involvert i reguleringsmekanismen av cellevekst [34]. Dessuten ble det cytoplasmatiske akkumuleringen av ACTN4 forbundet med flere ondartede sykdommer og er forbundet med en dårlig prognose [35], og en akkumulativ genomisk vinning av ACTN4 var assosiert med dannelsen av ovarian adenocarcinomer [36]. Også RNAi-mediert nedregulering av ACTN4 viste en sammenheng mellom over uttrykk for ACTN4 og en aggressiv fenotype av muntlig plateepitelkarsinom [37]. Nylig ble proteinet funnet å være assosiert med flere faktorer med varierende funksjoner, noe som tyder på andre roller for dette proteinet, bortsett fra aktin regulering [38]. Faktisk Khurana
et al.
Identifisert en LXXLL motiv som var ansvarlig for samhandling av ACTN4 med østrogenreseptoren og co-aktivatorer [39]. Nyere studier i HPV-transgen musemodeller dokumentere at østrogen og dens kjernefysiske reseptor fremme livmorhalskreft i kombinasjon med HPV-onkogener [40]. Det er derfor fristende å spekulere i at ACTN4 spiller en rolle i den viktige virkning.
basert på den semikvantitativ NSAF-metode, proteiner ble valgt for sin differensial ekspresjon mellom de to betingelser. Statistisk testing (Mann-Whitney U) resulterte i fire proteiner med en signifikant (p 0,05) forskjell i overflod (tabell 3). Selv om disse fire proteinene viser en statistisk signifikant forskjell i løpet av denne oppdagelsen fase, blir et bekreftelsestrinn er nødvendig for å bekrefte disse resultater. Når både p-verdien og hyppigheten av nærværet ble tatt i betraktning,
annexin A2
og PKM2 var mest lovende (p 0,03) fordi begge ble identifisert i minst 9 av 12 individuelle prøver, med en tre fold oppregulering for forstadier tilstand (Tabell 3). Til tross for identifikasjonen av en
nnexin A2
i nesten hver prøve (11/12 prøver) med en akseptabel forskjell i overflod (p = 0,03), inter-individuelle variasjoner (CV 77%) for den friske gruppe var mye høyere sammenlignet med PKM2 (35%). Derfor PKM2 (Acc No: P14618) ble valgt for verifisering av ELISA
PKM2 er en glycolytic enzym som bidrar til energiforsyningen i cellen.. Dette proteinet har to isoformer, en embryologiske isoform (M2) med forhøyet enzymatisk aktivitet og en voksen isoform (M1). Nylig ble det vist at ondartede transformasjoner av celler ved HR-HPV onkogener E6 og E7 indusert en PKM bytte fra M1 til M2 [41]. Denne bryteren bevirker en dreining fra normal cellulær metabolisme til forhøyet glykolyse, noe som er gunstig for veksten og svulst i tumorceller [42]. Dessverre var vi ikke i stand til å bekrefte forskjellen i PKM2 konsentrasjoner mellom CVFs fra friske og forstadier til enkeltpersoner, selv om to ELISA kit fra forskjellige leverandører ble brukt. Det er mulig at den semikvantitativ spektral tellemetoden kan være utsatt for altfor mye variasjon. Alternativt har vi tidligere observert at CVF matrisen er ikke optimalt for noen ELISA-konfigurasjoner, og dette kan være tilfelle for de to PKM2 ELISA-analyser.
Verifisering av alfa-actinin-4 nivåer
Alpha-actinin-4, den mest lovende kandidaten biomarkør, ble bekreftet på 57 flere CVF prøver (28 enkeltprøver og 29 langsgående prøver) av ELISA, et tall som absolutt oppfyller kravene til oppdagelsen /verifisering fase av protein biomarkører [43] . ELISA-resultater viste at konsentrasjonen av ACTN4 er forhøyet i HPV-infiserte pasienter sammenlignet med de ikke-infiserte pasienter, for derved å bekrefte at LC-MS /MS-resultater. Men infeksjon med LR-HPV (HPV-6 og HPV-11) resulterte i høyere ACTN4 konsentrasjoner i CVF. Selv om konsentrasjonene av ACTN4 målt i CVFs fra LR-HPV-infiserte individer er høyere enn de fra ikke-infiserte individer, ble observert noen signifikant forskjell i overflod nivå (p = 0,052). Fordi disse funnene er basert på analyse av prøver fra kun fire enkelt LR-HPV-infiserte pasienter, må mer av denne type prøve evalueres før konklusjoner kan trekkes. En ikke-infiserte pasienter viste en avvikende verdi av 85,6 pg /ml ACTN4. Denne pasienten ikke har en kjent historie med HR-HPV-infeksjon, men den kliniske filen viste iskemisk hjertesykdom og en forekomst av brystkreft. Det er derfor mulig at denne forhøyede konsentrasjon av ACTN4 er forårsaket av den medisinske behandling eller en LR-HPV-infeksjon annet enn HPV-6 og HPV-11. Derfor omfattende validering av denne markøren på et større antall prøver, inkludert de fra pasienter som lider av andre sykdommer og infeksjoner (HIV, herpes, bakteriell vaginose,
Chlamydia
etc.), er neste steg å avgjøre om ACTN4 er egnet for diagnoseformål. I disse studiene, kan man sette en grense på 18 pg /ml for å diskriminere mellom prøver fra friske versus HPV-infiserte individer.
Selv om ACTN4 nivåer ikke tallmessig korrelerer med viral belastning, en stigende og synkende trend kunne tydelig observeres hos pasienter som enten har startet en infeksjon eller fjernet viruset. Vi observerte også at infeksjoner over lengre perioder forårsaket akkumulering av markøren.
