Abstract
Bakgrunn
Claudins er trange veikryss proteiner som er involvert i tett veikryss dannelse og funksjon. Tidligere studier har vist at claudin-7 blir ofte oppregulert i ovarialcancer (EOC) sammen med claudin-3 og claudin-4. Her undersøker vi i detalj uttrykk mønstre av claudin-7, samt dens mulige funksjoner i EOC.
Metodikk /hovedfunnene
Det er totalt 95 eggstokkene vevsprøver (7 normal eggstokk vev, 65 serøs karsinom, 11 klare cellekreft, 8 endometrioid karsinomer og 4 mucinkjertler karsinomer) ble undersøkt for claudin-7 uttrykk. I sanntids RT-PCR-analyse, genet for claudin-7,
CLDN7
, ble funnet å være oppregulert i alle tumor vevsprøver de studert. Tilsvarende immunhistokjemisk analyse og western blotting viste at claudin-7 protein ble betydelig overuttrykt i de aller fleste EOCs. Liten interfering RNA-mediert knockdown av claudin-7 i eggstokkreft celler førte til betydelige endringer i genuttrykk målt ved mikromatriser og validert av RT-PCR og immunoblotting. Analyser av genene differensielt uttrykte avslørte at genene endres i respons til claudin-7 knockdown var assosiert med trasé implisert i ulike molekylære og cellulære funksjoner som cellesyklus, cellevekst og proliferasjon, celledød, utvikling, og celle bevegelse. Gjennom funksjonelle eksperimenter in vitro, fant vi at både migrasjon og invasjon ble endret i cellene der
CLDN7
hadde blitt slått ned eller overuttrykt. Interessant nok var claudin-7 uttrykk forbundet med en netto økning i invasjonen, men også med en nedgang i migrasjon.
Konklusjon /Betydning
Vårt arbeid viser at claudin-7 er betydelig oppregulert i EOC og at det kan være funksjonelt involvert i ovarialcancer invasjon.
CLDN7
kan derfor representere potensiell markør for påvisning eggstokkreft og et mål for terapi
Citation. Dahiya N, Becker KG, Wood, WH III, Zhang Y, Morin PJ (2011) claudin -7 ofte overexpressed i Eggstokkreft og fremmer invasjon. PLoS ONE 6 (7): e22119. doi: 10,1371 /journal.pone.0022119
Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 15 desember 2010; Godkjent: 16 juni 2011; Publisert: 15.07.2011
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet utelukkende av egenutført Research Program av National Institutes of Health, National Institute on Aging. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den sjette største årsaken til kreftdødsfall hos kvinner over hele verden [1]. Eggstokkreft er vanligvis diagnostisert som avansert sykdom når behandlingsalternativene er begrenset og prognosen svært dårlig. De siste årene har sett en rekke fremskritt i vår forståelse av de molekylære mekanismene som er involvert i kreft progresjon eggstokkene [2], [3], selv om mye av detaljene forblir ukjent. Blant de gener hvis ekspresjon blir ofte endres i eggstokkreft, er de som koder for claudin familie med stramme koblings proteiner [4] – [7]. Claudins danner ryggraden i TJS og er derfor vesentlig i epithelial oppdeling i seksjoner, og i å kontrollere oppløsningsmaterialet overføring over cellemonolagene [8] – [10]
I kreft, normal TJ funksjon og struktur er vanligvis endres og TJS seg selv. ofte er demontert [11], [12]. Nylige genekspresjon profilering studier har endret ekspresjon av en rekke TJ proteiner i flere kreftformer, inkludert flere claudin-proteiner [4], [6]. For eksempel er claudinet claudin-3 og-4 forhøyet i eggstokkene, prostata, livmor og bryst kreft, mens claudin-1 reduseres i bryst og prostata cancer.
claudin-7 har blitt funnet nedregulert i flere kreftformer inkludert esophageal [13], [14], hode og nakke [15] og prostata kreft [16]. Tap av claudin-7 ble korrelert med dedifferentiation i flere forskjellige krefttyper [16] – [19]. Brystkreft, ble claudin-7 uttrykk også funnet å bli redusert og omvendt korrelert med tumor karakter og metastatisk sykdom [17], [18], selv om det er bevis for at claudin-7 kan bli re-uttrykkes i metastaser [20], [21]. Det har derfor vært foreslått at tap av claudin-7 er forbundet med et tap av celleadhesjon og økt metastase [14], [17]. Imidlertid har claudin-7 har også blitt vist å være forhøyet i flere krefttyper. For eksempel er claudin-7 kjent for å være forhøyet i eggstokk-kreft [22] – [27], så vel som på andre maligniteter [28], [29]. Årsaken til de ulike mønstre av endringer observert i ulike kreftformer er foreløpig ukjent, men kan være relatert til den eksakte roller claudin-7 i ulike kreftformer, noe som gjør belysning av disse rollene et viktig mål.
I denne rapporten vi først vurdere claudin-7 uttrykk nivåer i eggstokkene vevsprøver og cellelinjer ved hjelp av western blotting, RT-PCR og immunhistokjemi og finner ut at claudin-7 er mye uttrykt i ovarietumorer. Ved hjelp av mikromatriser, finner vi at mange gener er uttrykt forskjellig følgende
CLDN7
knockdown og analyse av disse genene antyder flere veier gjennom hvilke
CLDN7
kan fungere i eggstokkreft. Vi viser at
CLDN7
knockdown fører til en reduksjon i fosfor-Erk og en økning i Raf-1-nivå, noe som tyder på en mulig vei for claudin-7 signalisering i eggstokkreft. I tillegg finner vi at
CLDN7
uttrykket er assosiert med økt invasjon, men redusert migrasjon i flere cellelinjer som gir en funksjonell kobling til
CLDN7
uttrykk i ovarialcancer.
resultater
CLDN7
transkripsjon og proteinnivåene er forhøyet i eggstokkreft vev
Nyere arbeider viser at i tillegg til
CLDN3 Hotell og
CLDN4
gener,
CLDN7
ofte forhøyet i eggstokkreft [22] – [26], [30]. For å klart definere
CLDN7
uttrykk mønstre i eggstokkreft, microdissected ovarietumorer av ulike undergrupper, samt cellelinjer ble analysert ved real-time RT-PCR.
CLDN7
mRNA ble funnet å være sterkt oppregulert i alle de fire store ovarialcancer undertyper (dvs. serøs, mucinous, klar celle, og endometrioid) sammenlignet med normale vev ovarie (Figur 1a). Nivået av overekspresjon varieres enormt, og ble funnet å være hvor som helst fra 2-fold til 50 000 ganger. Faktisk ble 2-dobling i løpet SLANGE-B observert i to av de normale eggstokk kontroller mens 50.000 ganger overekspresjon ble sett i 3 serøs eggstokkreft vev.
CLDN7
er utbredt i normale humane vev og dets transkript ble funnet ved forholdsvis høye nivåer i nyre, tarm, lunge, tynntarm, testikler, placenta, spyttkjertel, skjoldbruskkjertelen, binyrene, pankreas, prostata, lever , mage, ovarie og hud (figur 1B). På den annen side, muskel, hjerne, hjerte, milt, uterus, blodleukocytter, benmarg, føtal hjerne, og føtal lever uttrykte lavere nivåer av
CLDN7
mRNA.
A. De angitte ovarian carcinoma-undertyper ble testet for
CLDN7
-ekspresjon ved RT-PCR og nivåene er vist i forhold til HOSE-B-celler (en ovarial overflate epitelcellelinje udødeliggjort med E6 og E7 [52]). B.
CLDN7
uttrykk i normalt vev. De følgende vev ble analysert: 1, muskel; 2, Brain; 3, Hjerte; 4, Nyre; 5, Spleen; 6, Liver; 7, Colon; 8, Lung; 9, tynntarm; 10, mage; 11, testikler; 12, Placenta; 13, spytt; 14, Thyroid; 15, binyrene; 16, bukspyttkjertel; 17, Livmor; 18, eggstokk; 19, prostata; 20, Skin; 21, Plasma blodleukosytter; 22, Bone Marrow; 23, fosterets hjerne; 24, Fetal Liver. Nivåene er vist i forhold til muskler og vev med nivåer høyere enn fire ganger vises på grafen. C. Immunoblot-analyse av claudin-7-ekspresjon i 2 normal eggstokk-vev (N1 og N2), 7 serøs (S1, S2, S3, S4, S5, S6 og S7), en klar celle (C1) og en endometrioid (E1 ) eggstokkene karsinomer. I alt 29 prøver ble testet ved immunblotting og representative eksempler er vist. D. Immunohistokjemi av serøse eggstokkene karsinomer. Valgte eggstokkreft karsinom (S3, S4, S5, S6) og en normal eggstokk sample (N) er vist. Eggstokkreft prøver farget med claudin-7 antistoff (Cl-7) viser sterk farging i forhold til negative kontroller flekker mangler primært antistoff (-).
For å undersøke claudin-7 proteinnivåer i eggstokkreft , et panel av 29 primær eggstokkreft prøver samt 4 normale eggstokkene vev ble studert av immunoblotting (figur 1C, Tabell S1). Claudin-7 var fraværende i alle de vanlige ovarian vev, men ble funnet ved høye /moderate nivåer i 66% (19/29) av kreftprøvene. Claudin-7 ble funnet uttrykt i lave nivåer i 24% (7/29) av tilfellene, og var ikke påvises i 10% (3/29).
Immunohistochemistry (IHC) eksperimenter bekreftet at claudin-7 ble uttrykt i høye nivåer i kreft i eggstokkene (figur 1D). IHC studien viste at claudin-7 overekspresjon var begrenset til kreftceller og ikke involvere stroma. I tillegg, mens visse svulster viste signifikant membranfarging (S3 og S4), viste andre redusert flekker på membranen og høye nivåer av cytoplasma farging.
CLDN7
er forhøyet i eggstokkreft cellelinjer og kan være plassert i membranen eller i cytoplasma
for å evaluere
CLDN7
ekspresjon i cellelinjer, ble 7-cellelinjer undersøkt ved hjelp av RT-PCR og immunoblotting (figur 2A, B) .
CLDN7
avskrift ble ikke påvist i den ikke-ondartet overflaten epitel Lange-B, men ble funnet i alle eggstokkreft cellelinjer, bortsett UCI101 og OVCA432 (figur 2A). Tilsvarende claudin-7 protein ble ikke påvist i HOSE-B, men var til stede i de fleste eggstokkreft cellelinjer (men ikke i HEY og UCI101) (figur 2B). Interessant, HEY celler viste høye
CLDN7
mRNA nivåer, men lave proteinnivåer, mens OVCA432 utstilt svært lavt
CLDN7
transkripsjonsnivåer, men høy claudin-7 protein uttrykk. Disse data viser at mens claudin-7 transkripsjon blir opprettholdt i cellelinjer, kan claudin-7-proteinnivåer reguleres ved post-transkripsjonelle mekanismer.
A. Claudin-7 immunoblotting avslører høye nivåer av uttrykk i de angitte eggstokkreft cellelinjer. B. RT-PCR-analyse av
CLDN7
mRNA i cellelinjene. C. Immunfluorescens av utvalgte kreftcellelinjer viser sterk claudin-7 ekspresjon på celle knutepunkt i BG-1, OVCA433, OVCA420 og OVCA432, samt punctata cytoplasmatisk farge i BG-1 og OVCA420. Claudin-7 ble påvist med et anti-claudin-7-antistoff og visualisert med sekundært antistoff konjugert med Alexa fluor. Kjerner av celler ble motfarget med DAPI. Bilder ble slått sammen for å bestemme riktig lokalisering.
Ved hjelp av immunfluorescens, claudin-7 farging ble funnet lokalisert hovedsakelig på cellemembranen, med punktformet flekk i cytoplasma av eggstokkreft cellelinjer BG-1, OVCA420 og OVCA433 (Figur 2C). I OVCA432, vi også observert membranfarging, men lite uttrykk i cytoplasma.
endrer Gene uttrykket etter
CLDN7
knockdown i eggstokkreft celler
For å undersøke mulige roller
CLDN7
i eggstokkreft, undersøkte vi genuttrykk endringer følgende
CLDN7
knockdown. Disse knockdown forsøkene ble utført i cellelinjer OVCAR-2 og OVCA420, som begge oppviser moderate endogene nivåer av claudin-7 uttrykket (figur 3A).
CLDN7
siRNA behandling førte til en betydelig reduksjon i claudin-7-protein 72 timer etter transfeksjon (figur 3A), og dette tidspunkt ble valgt for microarray analyse. I OVCAR-2-celler, som danner TJS i kultur,
CLDN7
knockdown fører til en reduksjon i transepitelial motstand (TER, et mål på TJ tetthet) og en samtidig økning i permeabilitet over monolaget (figur 3B). Dette viser at
CLDN7
knockdown har en funksjonell effekt på TJ i disse cellene. I OVCA420 celler, som ikke danner TJ i kultur, ble TER ekstremt lavt og forble upåvirket av
CLDN7
knockdown (figur 3B). I samsvar med dette funnet, permeabilitet var også upåvirket av
CLDN7
knockdown.
A. Immunoblot analyse av ovčar-2 og OVCA420 celler etter
CLDN7
knockdown i 72 timer. B. Effekter av
CLDN7
knockdown på TJ og permeabilitet. Transepitelial motstand (TER) ble målt på flere tidspunkter etter
CLDN7
knockdown. Permeabiliteten ble målt ved å evaluere evnen til fluorescein-isotiocyanat-dekstran (40 kDa) til å krysse den monolaget. Fluorescensmålingene reflektere mono permeabilitet og resultatene speile TER målinger. Forsøk ble utført i tre paralleller, og resultatene er vist som gjennomsnitt +/- S.E.M. En stjerne (*) viser en p-verdi 0,05, og en dobbel stjerne (**), en p-verdi 0,01. C. hierarkisk clustering analyse av genuttrykk følgende
CLDN7
knockdown i begge cellelinjer. Den grønne fargen representerer nedregulering, mens rød representerer oppregulering. Totalt 20 klynger av gener som utviser tydelige mønstre ble identifisert.
Microarray analyse ble brukt for å undersøke effektene av
CLDN7
knockdown på genuttrykk i både OVCAR-2 og OVCA420 celle linjer. Clustering analyse viste flere mønstre av endringer Følgende
CLDN7
knockdown og disse mønstrene var representert ved 20 ulike grupper av gener som er identifisert av ukontrollert mønster clustering bruke JMP programvare (Figur 3C).
CLDN7
var den eneste gen i klynge 3 og, som forventet, var sterkt nedregulert i begge cellelinjer. Av de 1327 genene differensielt uttrykt i de to linjer (Tabell S2), 297 (200 oppregulert og 97 nedregulert) ble delt av OVCAR-2 og OVCA420 (figur 4). Dette representerer en 23% overlapping av alle differensielt uttrykte gener, et tall mye høyere enn det som forventes ved en tilfeldighet alene (p 0,001). I OVCAR-2, ble totalt 553 gener oppregulert og 415 ble nedregulert og i OVCA420, ble 404 gener oppregulert og 252 ble nedregulert. De 20 beste genene oppregulert og nedregulert i hver cellelinje (så vel som i begge samtidig), er angitt i figur 4.
I Venn-diagrammet, tallene i rød representerer gener som oppregulert og nummer i grønt representerer gener nedregulert. De 20 beste genene i hver kategori er angitt i tabellen nedenfor Venn-diagrammet.
For å validere og forlenge microarray data, 15 gener som ble betydelig endret av
CLDN7
knockdown i en eller begge cellelinjer, ble valgt for validering av RT-PCR-analyse (figur 5). Mens fold uttrykk syntes å være undervurdert av microarray analyse bekreftet real-time PCR trendene for alle de genene som ble testet (figur 5A, B). I tillegg protein nivåer for flere av disse genene (
CA12
,
RRAS2
,
PRSS8
,
APOE
,
AGT
,
SPRR3
, og
CLDN7
) ble testet ved ulike tidspunkt etter
CLDN7
knockdown (figur 5C). Resultatene av disse eksperimentene var i overensstemmelse med endringene observert ved RT-PCR. Samlet våre data viser en utmerket korrelasjon mellom endringene oppdages av mikromatriser og de tilsvarende protein uttrykk nivåer.
A. Brett endringer av de forskjellige angitte genene i OVCA420 og ovčar-2 celler etter
CLDN7
knockdown. B. RT-PCR validering av genene som er vist i (A). C. Immunoblotting analyse av utvalgte deltagere på ulike tidspunkter etter
CLDN7
knockdown. GAPDH kontroll ble tatt med for å bekrefte lignende lasting i alle banene.
Pathway analyse
Ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA), vi analyserte trasé og mulige funksjoner knyttet til genuttrykk endringer følgende
CLDN7
knockdown. Mange av de beste nettverkene identifiserte involvert kreft, cellevekst og spredning, men de var ikke tydelig bevart mellom cellelinjene (tabell S3). Interessant, «integrin signale» ble funnet i begge cellelinjene blant de mest signifikante kanoniske veier er identifisert (tabell S3). Den øverste biologiske funksjoner, inkludert en rekke funksjoner som cellevekst og celledød, og interessant, cellulær bevegelse. De fysiologiske systemer identifisert inkludert hematologiske og immunrespons, så vel som utvikling av bindevev (tabell S3). Gene ontologi analyse av endrede gener identifisert vesentlige kategorier som «strukturell molekyl aktivitet», «signal svinger aktivitet», «transkripsjon regulator aktivitet», «oversettelse regulator aktivitet» og «transporter aktivitet» (tabell S4).
de mulige funksjonelle forhold mellom de forskjellige differensielt uttrykte gener ble deretter bestemt ved anvendelse av en rekke tilnærminger. De 5 mest signifikante vanligste KEGG baner (som bestemt ved Webgestalt) var «regulering av aktin cytoskjelettet», «fokal adhesjon», «MAPK signalveien», og «insulin-signalreaksjonsveien». Tabell S5 liste alle veier identifisert. Den øverste gener av de 5 viktigste trasé nevnt ovenfor ble brukt til å søke på Pathway Studio database for kjente protein-protein interaksjoner (Figur 6A). Tabell S6 viser protein-protein interaksjons detaljer og tilhørende referanser. Interessant en av de mest fremtredende trasé identifisert gjennom denne tilnærmingen var RAS-RAF-MAPK veien (figur 6A). Vi deretter studert denne reaksjonsveien i OVCA420 celler ved å undersøke Erk og Raf-1-ekspresjon og fosforylering i disse cellene (Figur 6B). Claudin-7 knockdown førte til en økning av fosforylert Raf-1 (Ser-338) som ble avspeilet ved en økning i den totale Raf-1 på hvert tidspunkt, noe som tyder på at nettopp denne reaksjonsveien kan bli påvirket av claudin-7. ERK1 /2 plan ble ikke påvirket av claudin-7 knockdown, men fosforylert Erk viste en svak nedgang, spesielt på senere tidspunkter.
A. Pathway Studio analyse. Direkte interaksjoner av 33 signifikant oppregulert (rød pil oppover) eller nedregulert (grønn nedadgående piler) gener blir vist. Legenden om de forskjellige typer interaksjoner er vist nedenfor kartet. B. immunoblotanalyse av ERK1 /2, fosfor-ERK1 /2 (p-Erk) og Raf-1 og fosfor-Raf (Ser-338) i OVCA420 på angitte tidspunkter etter
CLDN7
knockdown.
claudin-7 protein uttrykk er assosiert med celle invasjon, men omvendt korrelert med migrasjon
Fordi vår genet analysen ovenfor avslører celle bevegelse som en funksjon muligens påvirket av
CLDN7
, bestemte vi oss for å teste mulige roller
CLDN7
i eggstokkreft celle migrasjon og invasjon. Vi først utført transient siRNA-mediert knockdown av
CLDN7
uttrykk i to eggstokkreft cellelinjer (OVCAR-2 og OVCA420) og testet migrering ved hjelp av Oris celle migrasjon analysen.
CLDN7
knockdown førte til en reproduserbar økning i celle migrasjon i begge cellelinjene ved hvert tidspunkt testet (figur 7A). Celle invasjon ble så evaluert ved anvendelse av en Boyden kammer analyse og, som vist i figur 7B, inhibering av claudin-7-ekspresjon i OVCAR-2 og OVCA420 cellene betydelig redusert invasiv potensialet til disse cellene. For å bekrefte rollen claudin-7 i invasjonen videre, claudin-7 ble overexpressed i OV-90 celler (som mangler endogen claudin-7 uttrykk) og fant at stabile overekspresjon av dette proteinet ført til økt invasjonen i forhold til mock-transfekterte celler eller foreldre OV-90 celler (figur 7C).
En. Migrasjons analyser i ovčar-2 og OVCA420 celler. Migrasjon av celler med
CLDN7
slått ned (mørke søyler) eller kontrollceller (hvite søyler) ble målt på ulike tidspunkt etter begynnelsen av analysen. B. Boyden kammer invasjon analysen av ovčar-2 og OVCA420 celler med og uten
CLDN7
knockdown. Antallet av invaderende celler ble målt hver time i 6 timer. C. Invasion analyser i en modell av
CLDN7
overekspresjon. To stabile linjer, OV90-CLDN7 og OV90-CiNeo, samt utransfekterte foreldre OV90 celler ble brukt til å teste endringer i invasjonen følgende
CLDN7
overekspresjon. For alle resultatene som er vist i denne figur, ble forsøkene utført in triplo, og resultatene er vist som gjennomsnitt +/- S.E.M. En stjerne (*) indikerte en p-verdi 0,05, og en dobbel stjerne (**), en p-verdi. 0,01
Diskusjoner
Våre data viser at
CLDN7
er hevet både mRNA og proteinnivåer i de fleste eggstokkreft vev og cellelinjer. Av vestlige analyse, primær eggstokk tumorvev utstilt variabel uttrykk for claudin-7 som strekker seg fra moderat til høy ekspresjon i 66%, lav i 24%, og umulig å oppdage i 10% svulst vevsprøver. Grunnen til denne variasjonen er uklar, som den transkripsjonelle regulering av
CLDN7
forblir stort sett ukjent. Interessant, hypermethylation har være innblandet i nedregulering av
CLDN7
uttrykk i brystkreft [17] og to transkripsjonsfaktorer, Tcf-4 og Sox9, har vist seg å samarbeide i
CLDN7
undertrykkelse i kolon celler [31]. Det er ukjent om disse mekanismene er involvert i
CLDN7
regulering i eggstokkreft, men disse mulighetene er for tiden under etterforskning.
Vi finner at
CLDN7
er forhøyet i alle hoved subtyper av eggstokkreft: serøs, endometrioid, klarcellet og mucinous. Disse resultatene er i samsvar med tidligere microarray data [22], [26] og IHC eksperimenter [27], [30] viser at CLDN7 er vanligvis overuttrykt i epitelial eggstokkreft. Faktisk, en tidlig studie viste at claudin-7 er overuttrykt i alle ovarialcancer subtyper, men er ikke overexpresssed i sex ledning og stromale tumorer [23]. Videre er en detaljert analyse av Tassi et al. [24] har vist at
CLDN7
er universelt oppregulert i epitelial eggstokkreft på både mRNA og protein nivå. Vår studie viser også overekspresjon i de vanligste ovarialcancer undergrupper (serøs, klarcellet, endometrioid, og mucinous) på både mRNA og proteinnivåer ved hjelp QRT-PCR, IHC, og immunoblotting. Bruken av immunblotting og QRT-PCR tillater oss å vise at mRNA nivåer og proteinnivåer ikke alltid korrelert, noe som tyder på post-translasjonell regulering av claudin-7 i eggstokkreft.
Interessant, mens vi fant at de fleste claudin -7 farging ble lokalisert til membranen, flere eggstokkreft prøvene oppviste sterk cytoplasmatisk farging (figur 1D). Det faktum at claudin proteiner kan finnes i cytoplasma er blitt rapportert og i særdeleshet, har punktformet cytoplasmisk farging av claudin-7 blitt observert i eggstokk-kreft [24]. Mekanismene og årsakene til claudin cytoplasma lokalisering fortsatt uklare, men flere linjer med bevis tyder på at fosforylering av Claudins kan påvirke deres lokalisering. For eksempel har en mutasjon av PKA fosforyleringssetet i claudin-3 blitt vist å føre til en økt cytoplasmisk lokalisering i eggstokk-kreft [32]. På samme måte, claudin-4 ble funnet å bli fosforylert av proteinkinase C, og dette fosforylering ble funnet å føre til translokasjon av claudin-4 fra membranen til cytoplasma og en reduksjon i TJ funksjon [32]. Claudin proteiner er også kjent for å bli regulert av palmitoylation, som claudin-14 palmitoylation har vist seg å være avgjørende for dets riktige lokalisering [33]. Det er foreløpig uklart om claudin-7 kan modifiseres og om endringer kan påvirke dens lokalisering.
overekspresjon av Claudins i kreft tyder på at Claudins kan ha funksjonelle roller i tumorigenesis. Flere grupper har studert mulige roller claudin-7 i kreft. Claudin-7 har blitt foreslått å være involvert i reguleringen av prostataspesifikt antigen (PSA) [34], eventuelt gjennom interaksjon med junctional adhesjonsmolekyl A (JAM-A) [35]. Claudin-7 har også blitt rapportert å danne et kompleks med EpCAM-tetraspanin som forstyrrer EpCAM-mediert celle adhesjon egenskaper, og øker motstanden mot apoptose [36] – [38]. Faktisk, i kolorektal karsinom, EpCAM og claudin-7 er funnet i forbindelse med tetraspanins CD9 og /eller CO-029 og markedsmetastasedannelse [37]. I tillegg EpCAM-
CLDN7
komplekset ble foreslått å ha rolle i migrasjon, spredning, apoptose motstand, metastaser, og tumorgenisiteten [37], [39].
I prøver å samle flere ledetråder om
CLDN7
funksjon i eggstokkreft, undersøkte vi genuttrykk endringer følgende
CLDN7
knockdown. Vi antok at nedregulering av
CLDN7
kan påvirke nedstrøms trasé som er berørt av dette proteinet og til slutt føre til uttrykk endringer i genene reguleres av disse banene. Mellom de to eggstokkreft cellelinjer studert identifiserte vi totalt 1296 gener som ble betydelig endret etter
CLDN7
knockdown. Blant disse genene, 297 ble samtidig funnet forskjellig uttrykt i begge linjene. Analyse av disse genene ved hjelp oppfinnsomhet Pathway analyse, førte til identifisering av flere gene nettverk inneholdende gener relatert til de funksjonelle gruppene «cancer», «celledøden», «cellesyklus», «RNA handelen», «cellulær utvikling», «celle signalering «,» cellevekst og proliferasjon «, og» cellulær bevegelse «. Fra Kyoto Encyclopedia of gener og genomer (KEGG) pathway analyse, valgte vi de 5 beste veier som ble endret i begge OVCAR-2 og OVCA420 cellelinjer og genererte et protein-protein interaksjon nettverkskart for disse banene. Ved hjelp av veien Studio, fant vi direkte interaksjon mellom 33 signifikant oppregulert eller nedregulert gener (Tabell S6). Interaksjonen nettverk viste et antall gener som har onkogene eller tumorsupres roller. For eksempel, RRAS2, som koder for et Ras-relaterte GTPase med trans potensial lik H-, K- og N-Ras, er et velkjent oncogen og har vært implisert i patogenesen av kreft hos mennesker. Trasé som medierer RRAS2-indusert tumordannelse er ikke godt etablert, men phosphoinositide 3-kinase, p38 MAPK, og mTOR trasé har vært innblandet [40]. Av spesiell interesse, har RRAS2 og RRAS vist seg å fremme invasjon via intesignalering i bryst epitelceller [41].
Vi har tidligere vist at eggstokkene epitelceller som uttrykker claudin-3 og -4 viser økt invasivitet
in vitro product: [42], som ble formidlet via MMP-2 overekspresjon. Tilsvarende, i leverkreft-celler, claudin-10 ekspresjon fremmet celleoverlevelse, motilitet, og invasivitet, mens matriks-metalloproteinase 2 (MMP2) ble oppregulert [43]. Men Claudins har også vist seg å redusere invasjon som claudin-fire uttrykk var assosiert med en reduksjon i invasivitet i kreft i bukspyttkjertelen celler [44]. Redusert uttrykk for claudin-7 har blitt korrelert med tumorinvasjon og metastase i plateepitelkarsinom i spiserøret og i endetarmskreft [13], [45]. I denne studien fant vi at
CLDN7
knockdown ført til endringer i uttrykket av gener assosiert med ulike funksjoner, blant annet migrasjon /invasjon. Særlig oppfølging på vei analyseresultater, viste vi at Raf-1, et gen som tidligere innblandet i celle migrasjon [46], [47], ble oppregulert etter
CLDN7
knockdown (figur 6) . Erk-en ble ikke funnet signifikant forhøyet i disse forholdene, noe som tyder på at Raf-1 kan tyde gjennom andre nedstrøms trasé som svar på
CLDN7
knockdown.
Basert på våre uttrykk data, vi deretter undersøkt de mulige roller
CLDN7 Hotell og funnet effekter på invasjon og migrasjon
in vitro
. Faktisk invasjonen kapasiteten ble betydelig redusert etter
CLDN7
knockdown og omvendt, ble det funnet økt etter overekspresjon av
CLDN7
. Interessant, migrasjon ble funnet økt etter
CLDN7
knockdown (muligens fordi en økning i Raf-1), og disse tilsynelatende motstridende funn (invasjon vs migrasjon) kan forklare tidligere observasjoner i felten. Faktisk har de nøyaktige roller claudin om invasjon forble kontroversielt, da noen etterforskere observere positive effekter av Claudins på invasjon og andre har funnet det motsatte. Siden claudin proteiner er kjent for å aktivere MMP’er [42], [48], men har også roller i celle-celle-adhesjon [9] og i migrasjon (som vist her), er nettoeffekten observerte kan representere resultatet av disse motsatte virkninger på invasjon. Våre data tyder på at mens
CLDN7
overekspresjon kan redusere migrasjon, økningen i invasjonen skyldes andre faktorer (for eksempel økt MMP aktivering) er dominant og fører til en netto positiv effekt på celle invasjon i vårt system. De eksakte mekanismene for
CLDN7
roller i celle migrasjon og invasjon er under etterforskning, men våre data kan forklare noen av avvikene i litteraturen.
I sammendraget, finner vi at
CLDN7
er forhøyet i de aller fleste av eggstokkreft. Vi utførte microarray analyse for å identifisere endringer i genuttrykk forbundet med
CLDN7
knockdown i eggstokkreft. Interessant, fant vi at mange gener og stier berørt av
CLDN7
uttrykk er involvert i kreft celle overlevelse, vekst og invasjon. Invasion og migrasjon analyser viste tydelige effekter av claudin-7 på invasiv oppførselen til eggstokkreft celler. Våre microarray analyse gir flere mulige mekanismer som claudin-7 kan påvirke celle migrasjon og invasjon, og disse forskjellige mekanismene blir nå etterforsket. I tillegg til deres stramme koblingsfunksjon, kan claudin-7 spiller viktige roller i en rekke signalveier som er involvert i kreft, cellulær vekst, proliferasjon og cellesyklusen. Gitt sin viktige rolle i eggstokkene karsinogenese,
CLDN7
kan ha et betydelig potensial i diagnostiske og terapeutiske anvendelser.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
All menneskelig vev ble samlet inn gjennom en IRB godkjent protokoll (MedStar Research Institute IRB # 2003-103). Vev ble samlet inn anonymt og denne protokollen ble unntatt fra samtykke kravet.
Cellelinjer og vevsprøver
eggstokkreft linjer som brukes i denne studien, BG-1, UCI-101, HEY, OV90, OVCA420, OVCA432, OVCA433, OVCAR-2, OVCAR-3, og OVCAR-5 har blitt publisert [49] – [51]. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer.
