Abstract
Autoimmune pankreatitt (AIP) er definert av karakteristisk Lymfoplasmacytær infiltrere, duktale strikturer og en bukspyttkjertel utvidelse eller masse som kan etterligne kreft i bukspyttkjertelen (Paca). Skillet mellom denne godartet sykdom og kreft i bukspyttkjertelen kan være utfordrende. Imidlertid kan en nøyaktig diagnose forkjøpet feildiagnostisering av kreft, slik at nødvendig medisinsk behandling av AIP, og dermed redusere antall unødvendige bukspyttkjertelen stasjonsberegninger.
massespektrometri (MS) og to-dimensjonale differensial gel elektroforese (2D-DIGE) har blitt brukt til å analysere serumprotein endringer i forbindelse med AIP og Paca, og å identifisere protein signaturer som indikerer sykdommer. Pasient sera ble immunodepleted fra de 20 mest fremtredende serumproteiner før videre 2D-DIGE og bildeanalyse. Identiteten av de diskriminerende proteiner detektert, ble utført av MS og ELISA ble anvendt for å bekrefte deres ekspresjon. Serum profilering dataanalyse med 2D-DIGE avslørte 39 proteintopper i stand til å skille mellom AIP og Paca. Proteiner ble renset og ytterligere analysert ved hjelp av MALDI-TOF-MS. Peptide mass fingerprinting ført til identifisering av elleve proteiner. Blant dem apolipoprotein AI, apolipoprotein A-II, transthyretin, og tetranectin ble identifisert og funnet som 3.0-, 3,5-, 2- og 1,6-ganger redusert i PACA-sera, henholdsvis, mens haptoglobin og apolipoprotein E ble funnet å være 3.8- og 1,6 ganger høyere hos Paca sera. Med unntak av haptoglobin ELISA-resultatene av de identifiserte proteiner bekreftet 2D-bildeanalyse dige egenskaper. Integrering av de identifiserte serumproteiner som AIP markører kan ha et betydelig potensial for å gi tilleggsinformasjon for diagnostisering av AIP å velge riktig behandling
Citation. Felix K, Hauck O, Fritz S, Hinz U, Schnölzer M , Kempf T, et al. (2013) serumprotein Signatures Skille Autoimmune Pankreatitt versus bukspyttkjertelkreft. PLoS ONE 8 (12): e82755. doi: 10,1371 /journal.pone.0082755
Redaktør: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Tyskland
mottatt: 02.01.2013; Godkjent: 04.11.2013; Publisert: 09.12.2013
Copyright: © 2013 Felix et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av den tyske Research Foundation (DFG) FE 940 /2-1. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
autoimmune pankreatitt (AIP) er en tydelig klinisk entitet, beskrevet som en kronisk inflammatorisk prosess i bukspyttkjertelen med autoimmune mekanismer. Klinisk og histologisk, to undergrupper av autoimmun pankreatitt (type 1 og type 2 AIP) eksisterer og bør skilles [1] – [4]. Den type 1 AIP, en Lymfoplasmacytær sklerose pankreatitt (LPSP), viser noen typiske trekk: periductal Lymfoplasmacytær infiltrere, fibrose, oblitererende venulitis, og infiltrasjon av IgG4-positive plasmaceller. Den type 2 AIP idiopatisk duct-sentriske pankreatitt (IDCP) er preget av massiv infiltrasjon av granulocytter i bukspyttkjertelen parenchyma og duktale epitelceller lesjoner (GEL). Disse funksjonene er beskrevet i Mayo HISORt kriterier, som vi bruker i vår klinikk [5]. Type 1 AIP hovedsakelig påvirker voksne menn med 90% av pasientene blir mer enn 40 år [6]. Den mest vanlige kliniske presentasjon av type 1 AIP er akutt obstruktiv gulsott, som er rapportert i opp til 75% av pasientene [7]. I tillegg kan en bukspyttkjertelen utvidelse eller masseligne kreft i bukspyttkjertelen hos opptil 80% av pasientene [1]. I nærvær av en ny start av diabetes og vekttap, kan forskjellen mellom AIP og kreft i bukspyttkjertelen være utfordrende. I tillegg på en CT scan eller magnetisk resonans imaging (MRI), en viss «pølse-formet» utvidelse av bukspyttkjertelen med forsinket perifer ekstrautstyr (rim ekstrautstyr) er beskrevet [8] – [10]. Endoskopisk Retrograd Cholangio-Pancreatography (ERCP) avslører typisk segmental innsnevring og flere strukturer, som kan bidra til å skille mellom kreft i bukspyttkjertelen og primær skleroserende kolangitt [11] – [13]. Type 1 AIP presenterer flere serologiske egenskaper. Den mest fremtredende av dem er forhøyet serumnivå av IgG4, noe som er avgjørende for diagnose i fravær av histologi i henhold til de Mayo HISORt kriteriene [5]. Videre antinukleære antistoffer, anticarbonic anhydrase, og antilactoferrin kan økes også. AIP kan ofte være vanskelig å skille fra Paca som pasientenes demografi, samt kliniske og bildefunksjoner (f.eks bukspyttkjertelen utvidelse, obstruktiv gulsott i 76%, vekttap hos 35% av pasientene), er like. Derfor er det ønskelig å kjenne igjen AIP siden 2,5 til 11% av alle pasienter som gjennomgår kirurgi for mistenkt PACA faktisk har en godartet inflammatorisk sykdom i bukspyttkjertelen [14] – [16]. AIP kan behandles med steroider, og den høye respons på denne behandlingen er et viktig diagnostisk kriterium. Derfor er det ekstremt viktig å diagnostisere AIP å velge riktig behandling og unngå unødvendig kirurgi.
Formålet med denne første studien var å identifisere serumproteiner (serum biomarkører) som gjør det mulig å skille AIP fra Paca. For dette formål vi brukt et proteomikk strategi som skissert i figur 1. identiteten av proteinene detektert ble bestemt ved en kombinasjon av flere teknikker, inkludert serumproteinfraksjonering ved immunoaffinitetskromatografi subtraksjon av fremtredende proteiner, 2D-gel-elektroforese og massespektrometri og endelig bekreftet og vurdert de serumproteinnivåer ved hjelp av enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).
Seks sera fra hver gruppe (AIP, PACA og Ctr) ble først underkastet en reduksjon av serum kompleksiteten ved fjernelse av de 20 mest tallrike serumproteiner ved immunodepletion kolonner. Den immunoaffinitetskolonnerensing-behandlet sera ble utsatt i parallell til 2D-DIGE og 2 D PAGE, og forskjellig uttrykt proteiner identifisert gjennom DIGE bildeanalyse ble matchet med preparativ gel, ble Protein flekker Bolts som gel plugger, forberedt for tryptisk fordøyelse og identifisert av MS. Konformasjon og pilot validering av identifiserte proteiner ble utført av ELISA.
Materialer og metoder
Prøvetaking
bukspyttkjertelen vevsprøver ble prospektivt samlet inn mellom januar 2003 og mars 2010 på Kirurgisk avdeling, Universitetet i Heidelberg. Diagnosen kronisk pankreatitt (CP), ble Paca eller AIP bekreftet av histopatologi. Ved AIP ble de Mayo Clinic (HISORt) kriterier som brukes [5]. Histologisk undersøkelse av formalinfikserte, parafininnstøpte og H E-farget bukspyttkjertelen vevssnitt ble utført av en patolog ved Patologisk Institutt, Universitetet i Heidelberg
Preoperativ blod ble samlet inn fra pasienter diagnostisert med adenokarsinom. bukspyttkjertelen (PACA, 270 prøver), alkoholisk kronisk pankreatitt (CP, 290 prøver), autoimmun pankreatitt (AIP, 32 prøver), en kontrollgruppe av friske frivillige (Co, 127 prøver), og andre gastrointestinale cancere (GICA, 165 prøver ). På opptak spesifikke pasientkarakteristika (alder, kjønn, kroppsmasseindeks (BMI) kliniske symptomer, vekttap, andre organ engasjement, komplikasjoner, blodprøver, og behandlinger, etc.) ble dokumentert. Alle sera ble oppnådd i henhold til en standardisert prøvetaking og koding protokollen [17]
Etikk erklæringen. Studien ble godkjent av etisk komité ved Universitetet i Heidelberg, og et skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Påvisning av total IgG og IgG4-antistoffer
en karakteristisk trekk ved AIP er tilstedeværelsen av høye nivåer av serum IgG, spesielt IgG4 underklasse. For å vurdere den diagnostiske verdien av total IgG og IgG4 nivåer i AIP videre, påvisning av antistoffer ble utført. Den totale IgG og IgG4 undergruppeserumnivåene ble bestemt ved tidspunktet for diagnose ved nefelometri, ved hjelp av en BNII nefelometer (Dade Behring) som en standard assay test for å måle serum immunoglobuliner. Totalt IgG og IgG4 serumnivåer ble ansett for å være forhøyet når konsentrasjonen nådde verdier av ≥ 16,0 g /l og ≥ 1,4 g /l henholdsvis [18].
Immunrespons mot 15
H. pylori
proteiner
I likhet med magekreft utvikling, en patogen rolle
H. pylori
infeksjon har vært diskutert i bukspyttkjertelen sykdom [19]. Vi undersøkte sammenhengen av antistoffer mot 15 forskjellige
H. pylori
proteiner og bukspyttkjertel sykdom sammenlignet med
H. pylori
-associated magesykdom. Vi analyserte sera fra pasienter med autoimmun pankreatitt (AIP, n = 32), kronisk pankreatitt (CP, n = 290) og kreft i bukspyttkjertelen (PACA, n = 269), og sammenlignet med friske kontroller (CO, n = 127) og annen GI-tarmkanalen kreft (Gică, n = 165) med
H. pylori
multiplex serologi [20] som tillater samtidig påvisning av antistoffer mot 15
H. pylori
-spesifikke antigener (urea, katalase, GroEL, Napa, CagA, CagM, Cagδ, HP0231, Vaca, HpaA, Cad, HyuA, OMP, HcpC, HP0305). Multipleks-metoden er basert på et glutation S-transferase-fangst immunsorbent analyse i kombinasjon med fluorescerende-bead teknologi [21], [22]. Rekombinant GST
H. pylori
fusjonsproteiner ble anvendt som antigener, lastet og affinitetsrenset på spektralt tydelig glutation-kasein-koplet (GC) fluorescens-merkede polystyrenkuler (SeroMap, Luminex, Austin, Texas). Antistoffer bundet til kulene via de GST-
H. pylori
fusjonsproteiner ble farget med biotinylert geite anti-human IgA, IgM, IgG (Dianova, Hamburg, Tyskland) og rapportør konjugat R-fykoerytrin-merket streptavidin. En Luminex 100 analysator identifisert den indre vulst farge og derfor antigenet som bæres av vulsten. Mengden av bundne antistoffer ble bestemt som median reporter fluorescensintensitet (MFI) på minst 100 perler per perle sett per serum.
For alle 15 antigener, antigen-spesifikke cut-off-verdier bestemt i en valideringsstudie [20] ble brukt fra MFI verdiene av 20 ekstra sera negativ i Helicobacter-R-Biopharm ELISA som gjennomsnitt pluss 3 standardavvik unntatt positive uteliggere. Study data ble normalisert til dette tidligere valideringsstudie ved å dividere de antigen-spesifikke antistoff reaktivitet av bakken av regresjonslinjer av data par av et panel av 77 kvalitetskontroll sera med en definert
H. pylori
status løp i denne og den forrige valideringsstudie. Alle sera ble analysert gang ved 1:100 fortynning innenfor en enkelt assay dag.
H. pylori
sero-positivitet ble definert som sero-positivitet til . 3 proteiner, noe som har vist god avtale (kappa = 0,70) med kommersiell serologisk analyse klassifisering [20]
Proteome analyse
2D-DIGE Forut for to-dimensjonal differensiering analyse av AIP, PACA og kontrollsera, et separasjonstrinn for å fjerne de 20 mest fremtredende serumproteiner ble utført for å oppnå en bedre tilgang til de mindre fremtredende serumproteiner. For dette formålet, ble pasientenes sera utsatt for et immunodepletion trinn bruker ProteoPrep 20 kit og bruksanvisning (Sigma, Deisenhofen, Tyskland). Den utarmede og fortynnede sera ble deretter justert til den ønskede proteinkonsentrasjon på 1,0 mg /ml ved den proteinutfelling protokollen til Wessel og Flügge, og proteinbunnfall ble rekonstituert i lysis buffer (8 M urea, 20 mM Tris, 4% CHAPS, pH 8.5) [23]. Prøvene som brukes for 2D-DIGE analyse ble merket med CyDye DIGE Fluor minimal fargestoffer (GE-Healthcare GmbH, Freiburg, Tyskland) før 2D gel analyse. For dette formål ble 50 ug protein blandet med 400 pmol CyDye oppløst i DMF, vortex-blandet, sentrifugert og inkubert i mørke på is i 30 min. Overskudd av fargestoff ble bundet ved å tilsette 1 pl 10 mM lysin til blandingen. En detaljert protokoll er beskrevet i brukerhåndboken Ettan DIGE System (GE-Health 2005) og [24].
Immobiline DryStrips på 24 cm og pH 3-10 NL (GE Healthcare) ble passivt lastet med 300 mikrogram av proteinprøver resuspendert i 350 pl i en blanding av 150 ul lysebuffer (7 M urea, 2 M tiourea, 4% vekt /volum CHAPS) og 200 ul destreak oppløsning (2% vekt /volum IPG-amfolytt, 2% w /v ditiotreitol DTT). IEF ble utført med en Ettan IPGphor IEF enhet system (GE Healthcare) og en spenning stigning på opp til 8 kV (totalt 35,5 KVH). Før den andre dimensjonen kjøres på en 15% PAGE, ble IPG strimlene trinnvis ekvilibrert i 15 min i en Tris /HCl-buffer (pH 8,8, 6 M urea, 30% glycerol, 2% SDS) med 1% DTT, fulgt med 2,5% iodoacetamide. En molekylvekt markør (SM0671 Sigma) ble brukt, og elektroforese går over natten i faste 12 W. geler ble skannet med en Typhoon 9410 skanner (GE Healthcare). Proteinkvantifisering tvers av alle prøvene ble utført ved hjelp DeCyder 2D 6.5 programvare (GE Healthcare). Bruk av en DIA modul, Cy2 merket intern standard tillatt normalisering av protein flekker på tvers av alle gels. Med BVA modul, en t-test (uparet, to tailed) ble brukt til å beregne signifikant (p 0,05) forskjeller i en relativ protein mengde /flekk i seks AIP sera sammenlignet med seks Paca sera. Spots det ble funnet å være statistisk signifikant ble kartlagt og isolert for videre undersøkelser som beskrevet nedenfor.
Identifisering av proteiner fra 2D geler ved MALDI-TOF MS.
Etter å samkjøre sølvfarget gels med tilsvarende fremstillings gels ble tilbakevendende og matchende flekker merket med et ID-nummer. De utvalgte protein flekker ble stanset ut fra 2D-geler, som er lagt inn i individuelle ID-merket 200 pl rør, og vasket to ganger med 70% acetonitril (ACN), 40 mM NH
4HCO
3. Etter reduksjon med 10 mM DTT i 1 time ved 56 ° C og alkylering med 55 mM jodacetamid i 30 minutter ved romtemperatur, ble gelen pluggene ble vasket tre ganger avvekslende med 40 mM NH
4HCO
3 og etanol. Etter tørking med acetonitril, ble en in-gel trypsin fordøyelse utført ved tilsetning av 100 ng trypsin i 40 mM NH
4HCO
3 over natten ved 37 ° C. De resulterende peptider ble ekstrahert fra gelen pluggene ved tilsetning av 15 ul ekstraksjon oppløsning (1% ACN, 1% maursyre).
For massespektrometrisk identifikasjon av de tryptiske fordøyinger av peptid masse fingeravtrykk, prøver ble fremstilt på PrespottedAnchorChip (PAC) mål i henhold til protokollen gitt av produsenten (Bruker-Daltonik, Bremen, Tyskland). a-cyano-4-hydroxycinnamic syre ble anvendt som en matrise [25]. Masse spektra ble registrert i den positive ion reflektor modus med forsinket utvinning på en Ultraflex I time-of-flight instrument (Bruker-Daltonik, Bremen, Tyskland). Ion akselerasjon ble satt til 25,0 kV, reflektoren til 26,3 kV, og den første uttrekkingsplaten til 21,75 kV. Massespektra ble oppnådd ved å summere opp 500-1500 individuelle laser skudd. Kalibrering av spektre ble utført eksternt av en kvadratisk form ved hjelp av et peptid kalibrering standard blanding som inneholder bradykinin (1-7) ved m /z 757,399, angiotensin II ved m /z 1046,542, angiotensin jeg på m /z 1296,685, neurotensin på m /z 1672.917, renin substrat ved m /z 1758.933, ACTH klipp (1-17) ved m /z 2093,086, ACTH klipp (18-39) ved m /z 2465,198, ACTH klipp (1-24) ved m /z 2932,588, og ACTH klipp (7-38) ved m /z 3657,929. Enkeltvis belastet monoisotopic peptid massene ble brukt som innganger for databasesøk. Søk ble utført mot NCBInr database (utgitt 2009-09-09) ved hjelp av Mascot søkealgoritmen versjon v2.2 (Matrix Science, London, UK). Taksonomi ble pattedyr, proteinmasse ble begrenset til 100 kDa, og isoelektriske punkter fikk lov til å variere fra 0 til 14. Carbamidomethylation av cystein var inkludert som en fast modifikasjon, og oksydasjon av metionin ble tillatt som variabel modifikasjon. Opp til en savnet tryptisk spaltningssetet ble vurdert, og massen toleranse for monoisotopic peptid massene var satt til +/- 75 ppm.
Enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA)
Fast-fase- fangst sandwich-ELISA ble utført ved hjelp av kommersielt tilgjengelige kits for apolipoprotein AI (ALerCHEK Inc., Portland, Maine). Apolipoprotein A-II, apolipoprotein E og haptoglobin var fra AssayPro (AssayPro, St. Charles, MO), tetranectin fra USCN Life Science Inc. (Wuhan, PRC), og transthyretin fra Immundiagnostik AG (Bensheim, Tyskland). Den haptoglobin ELISA fra AssayPro er også en sandwich-ELISA, men med en konkurrerende enzyme immunoassay teknikk. De seks benyttet ELISA kvantifisere summen av alle antigener som binder antistoffet, og derfor ikke avsløre den relative bidraget av isoformer eller post-translasjonelt modifiserte former. Alle sera ble fortynnet i henhold til produsentens instruksjoner med buffere som tilbys eller TBS buffer, og analysene ble utført i henhold til produsentens protokoller. Karbohydrat antigen 19-9 (CA 19-9) ble bestemt i serum ved en sandwich-immunoassay med bruk av en elektrokjemiluminescens immunoassay (ECLIA, Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland).
Biometrisk analyse
Statistisk analyse ble utført av GraphPad Prism 5-programvaren (GraphPad programvare, Inc., San Diego, California, USA) og SAS programvareversjon 9.1 (SAS Institute, Cary, North Carolina, USA).
Biometrisk analysen ble utført for å undersøke styrken i sammenhengen mellom kliniske parametre body-mass-index (BMI) og svulsten markør med nivåer av ELISA-baserte valideringer av de seks protein markører CA 19-9. Avhengig av karakteren av de fordelinger av de kvantitative parametre i hver gruppe korrelasjonskoeffisienten r med dens tilsvarende p-verdi av Pearson og Spearman ble anvendt for å analysere de korrelasjoner. Tegnet av fordelingen av de kvantitative parametre ble bestemt ved hjelp av Shapiro-Wilk test og en normal sannsynlighetsplott.
Resultater
Serologiske unormalt
To kliniske mønstre skiller hos pasienter med diagnosen AIP: klassifisert som type 1 og type 2. Vi analyserte vår pasient kohort tilsvarende. Et kjennetegn på AIP type 1 er heving av gammaglobulin og dens undergruppe, immunglobulin G4 (IgG4) serumnivåer; Derfor analyserte vi våre prøver for disse avvikene. Fra de analyserte prøvene (n = 32), tre pasienter ble preget med unormal total IgG av 16 g /l, og 18 prøver (59%) viste forhøyet IgG4 nivåer (øvre grense 1,4 g /L), som strekker seg mellom 1,8 og 16,6 g /l (fig. 2).
Serumnivåer nivåer~~POS=HEADCOMP av IgG og IgG4 ble bestemt ved automatisert immunonephelometry, og vurderes forhøyet når ≥16.0 g /l og ≥1.4 g /l henholdsvis (stiplede linjer).
H. pylori og AIP
Siden
Helicobacter pylori
infeksjon har vært forbundet med patogenesen av AIP, undersøkte vi foreningen av antistoffer mot 15 forskjellige
H. pylori
proteiner i 32 AIP sera og sammenlignet med andre bukspyttkjertelen sykdommer og kontroller. Antistoffanalyser ble utført med multiplex serologi basert på rekombinant uttrykte og affinitetsrenset
H. pylori
proteiner i kombinasjon med selvlysende perle (Luminex) teknologi.
H. pylori
seroprevalence var 43,8% i AIP og 56,9% i CP sammenlignet med 64,7% i PACA, 69,7% i forskjellige GI kreft og 50,4% i kontrollgruppen (oppsummert i tabell 1).
H. pylori
seropositive pasienter med AIP viste signifikant lavere antistoffresponsen til 3 antigener (Cagδ, CagA, HP0231) og pasienter med kronisk pankreatitt til 9 (Cad, Cagδ, CagA, CagM, HP0305, HpaA, HyuA, Omp, og Vaca) sammenlignet med
H. pylori
seropositive pasienter med andre mage-tarmkanalen kreft som en referanse, med det er en betydelig økning av antistoff reaktivitet til Vaca
H. pylori
seropositive pasienter med AIP og Napa i de med kreft i bukspyttkjertelen. Blant bukspyttkjertelen sykdom pasienter, ikke våre data støtter ikke en signifikant sammenheng med
H. pylori
infeksjon med AIP
Serum protein expression profilering søker immunodepletion og 2D-DIGE. For å finne og identifisere potensielle diagnostiske biomarkører for differensialdiagnose av AIP og Paca, analyserte vi sera fra seks AIP og seks PACA pasienter i henhold til strategien som vist i figur 1. for dette formål er den sera ble først immunodepleted av høy-overflod proteiner, deretter merket med fluorescens fargestoffer og separert ved to-dimensjonal gelelektroforese. Statistisk analyse av de oppnådde gel bilder med en DeCyder programvarepakke avslørte 39 vesentlig endret (p 0,05) proteiner mellom AIP og Paca grupper. De samsvarende protein flekker med høyest differensial regulering (n = 14) ble fjernet fra fremstillings 2D-PAGE-geler og utsatt for i-gel tryptisk fordøyelse. Tryptiske peptid blandinger ble analysert med MALDI-TOF-MS og identifisert ved søk i en database ved hjelp av maskoten algoritme. En liste over de identifiserte, forskjellig regulert proteiner i AIP og Paca er oppsummert i tabell 2. En flekk gikk tapt under utarbeidelse, men senere identifisert som apolipoprotein A-II. For sin identifikasjon av Cy2-farget gel ble senere sølv-farget, ble stedet kuttet ut, fordøyd med trypsin og utsatt for massespektrometri analyse.
Vi identifiserte apolipoprotein AI, apolipoprotein A-II og transthyretin med en AIP /PACA-forhold av 3, 3,5 og 2, respektivt. I AIP vi også funnet forhøyede serumnivåer for tetranectin og immunglobuliner, mens i Paca sera, apolipoprotein E og haptoglobin (Paca /AIP forhold på 1,6 og 3,8 henholdsvis) ble funnet forhøyet.
konformasjon av differensial uttrykk for kandidat biomarkør proteiner
for å evaluere den diagnostiske nøyaktigheten av biomarkører kandidater funnet av 2D-DIGE og MS, vi målte serumnivåer av apolipoprotein-AI, apolipoprotein-A-II, apolipoprotein-E, transthyretin, tetranectin, og haptoglobin nivåer av kommersielt tilgjengelige ELISA i en kohort av 32 AIP, 30 Paca, og 30 friske kontroller av tilfeldig plukket prøver. Med disse analysene vi var i stand til å diskriminere på AIP sera fra Paca gruppen, og bekreftet massespektrometri resultater. Med unntak av haptoglobin (p = 0,1), alle testede markører her viste signifikante forskjeller (p 0,05). Figur 3 viser plott av protein resultater for hver gruppe. Verdier er vist som en gjennomsnittlig med SEM.
Prikkplott av apolipoprotein A-I, apolipoprotein A-II, apolipoprotein E, transthyretin, tetranectin, og haptoglobin for hver gruppe. Statistisk analyse ble utført med GraphPad Prism5 søker Mann Whitney test (to halet). Verdier er vist som en gjennomsnittlig med SEM.
Biometrisk analyse
De kategoris CA 19-9 og BMI data fra de tre gruppene er presentert i tabell 3 og tabell 4 og utbredelsesområde er vist som boks-og-whisker plot i figur 4A. For å vurdere styrken av lineær sammenheng mellom nivåene av ELISA-baserte valideringer med kroppsmasseindeks (BMI) og nivåer av CA 19-9 korrelasjonskoeffisienter for alle seks protein markører ble bestemt
A:. Body mass index og CA 19-9 nivåer i AIP-, PaCa- og kontroll-gruppen brukes i ELISA-baserte valideringer. BMI og CA 19-9 verdiene av tre grupper AIP, Paca, og kontroll er presentert som boks-og-whisker plott. Sammenligninger mellom de tre gruppene ble utført ved hjelp av Kruskal-Wallis test som samlet test, etterfulgt av Mann-Whitney U-test for parvise sammenligninger. B: revurdering av ELISA for de seks markører søker en CA 19-9 cut-off av 37 U /ml. Med hensyn til de seks protein markører undergruppene i AIP og Paca definert av en CA 19-9 verdi 37 U /ml ble sammenlignet med ensidig Mann-Whitney U test. Betydning ble akseptert av 95% nivå. Boksplott med max, Q3, median, Q1 og min.
I foreningen analyse av de seks markører og BMI bare tetranectin avslørt for de tre gruppene som helhet en negativ korrelasjonskoeffisienten med en verdi av r = -0,374 og p = 0,01. Denne negative korrelasjonen var enda mer uttalt når Paca gruppen alene ble analysert med r = -0,588 og p = 0,006.
Foreningen analyse av de seks markører og CA 19-9 nivåer for de tre gruppene som helhet avdekket en negativ korrelasjon for apolipoprotein AI og transthyretin med Korrelasjonskoeffisientene r = -0,388 (p = 0,012) og r = -0372 (p = 0,0235), henholdsvis. Analysere Paca alene en negativ korrelasjonskoeffisient ble funnet bare for apolipoprotein A-II med en verdi på r = -0,439; men mislyktes signifikansnivået med p = 0,08.
Fordi alle AIP prøvene viste CA 19.9 serumnivåer under 37 U /ml vi sammenlignet sine ELISA-data med tilsvarende Paca gruppen (n = 21) med CA 19-9 nivåer under 37 U /ml. Statistiske analyser viste fremdeles betydelige forskjeller for apolipoprotein A-I, tetranectin og thransthyretin. Apolipoprotein A-II (p = 0,053) og apolipoprotein E (p = 0,061) litt sviktet signifikansnivået (Fig. 4B).
Diskusjoner
Skille AIP fra Paca gjennom ikke-invasive metoder slik som serum biomarkører, eller avbildning er viktig som opp til 11% av pasienter som gjennomgår kirurgi for kreft i bukspyttkjertelen er diagnostisert til å ha en godartet inflammatorisk tilstand. Serologiske markører som forhøyet y-globuliner, særlig IgG4, ble foreslått som gode kandidater for differensialdiagnose. Forhøyet IgG4 nivåer er ansett som den mest sensitive serum markør for diagnostisering AIP [18]. Imidlertid har det nylig blitt vist at IgG4 kan også være forhøyet hos opptil 10% av PACA-pasienter, og er derfor ikke alltid spesifikk for å skjelne AIP fra PACA [26]. I tillegg seronegative tilfeller av AIP ble beskrevet av Ghazale [27].
Vår her undersøkt AIP studiekohorten viste bare 58% av prøvene med IgG4-verdier over 1,4 g /l. En rekke av autoantistoffer blant dem mot kjerneantigenet, laktoferrin eller karbonsyreanhydrase II (CAII) ble rapportert i AIP hos pasienter sera, men ingen av dem er kjent for å være av IgG4 underklassen. Det er fortsatt uklart om dannelsen av disse autoantistoffer og økte IgG4 nivåer spiller en patogen rolle eller er epiphenomena av AIP [28], [29]. Et forskerteam i Japan lyktes i å få AIP hos nyfødte atymiske mus ved å vaksinere dem med laktoferrin og CAII [30]. En annen forskergruppe påvist antistoffer mot amylase α2 i AIP [31]. Ingen av disse markørene er så spesielt at de kan diskriminere trygt mellom AIP og Paca.
En mulig samtrafikk mellom
Helicobacter pylori
infeksjon og AIP har blitt rapportert [19]. Flere laboratorier foreslo en molekylær mimikk som en årsak, hvor antistoffer rettet mot
H. pylori
proteiner også bindes til kropps egen peptidsekvenser og indusere en immunrespons i bukspyttkjertelen [32] – [36]. Spesielt, i en fersk arbeid, ble det vist at i 19 av 20 skjermede AIP pasienter, autoantistoffer mot plasminogen-bindende proteiner fra
H. pylori
ble funnet, noe som sannsynligvis var en nyttig serologisk markør for å skille AIP fra Paca og CP [19]. Men screening av alle våre AIP pasienter viste en
H. pylori
seroprevalens på 43,8% og var den laveste av alle grupper som er testet. En forklaring på avviket mellom resultatene av undersøkelsene kan være geografisk og miljømessig forskjellig opprinnelse av pasientene. Våre resultater bekrefter også en tidligere studie hvor i bukspyttkjertelen av 11 AIP pasienter uten
H pylori
urease A og 16S rDNA ble oppdaget av nestet PCR [37].
Profilering av utlignet og subfractionated sera fra AIP og Paca pasienter på ProteinChip i en av våre tidligere studier som gjelder den SELDI-TOF-MS teknikk avdekket 38 potensielle proteinmarkører som varierer mellom 3,14 og 42,23 kDa [38]. For ytterligere å analysere profilering resultatene som oppnås ved SELDI-TOF-MS, vi spilte her en 2D-DIGE studie på immunoaffinitetskolonnerensing utarmet serum til å identifisere merke kandidater for differensialdiagnose av de to sykdommene. Sammenligning av AIP og Paca 2D-Dige protein expression data ved hjelp av DeCyder bildeanalyse, fant vi i sera fra AIP pasienter tre ganger høyere nivåer av apolipoprotein AI, 3,5 ganger høyere nivåer av apolipoprotein A-II og to ganger høyere nivåer av transthyretin (TTH). I AIP vi også funnet forhøyede tetranectin og immunglobuliner, mens i Paca, apolipoprotein E og haptoglobin var høyere. Observasjoner av redusert nivå av apo AI, ble apo A-II og TTH i PACA og CP forhold til normale individer laget i våre tidligere studier [17], [38], [39].
På grunn av det faktum at her er beskrevet observasjoner kan bidra til å bedre differensial diagnostikk av AIP og Paca, utførte vi ELISA for de seks proteiner for å bekrefte 2D-DIGE /MS-data og å vurdere deres generelle ytelsen. Med unntak av haptoglobin, for hvilken ingen signifikant forskjell ble funnet, forholdene mellom de to gruppene viste tilsvarende egenskaper, men de forhold som var mindre fremtredende. De forhøyede serum apolipoprotein E nivåer i Paca pasienter vurdert i denne innledende studie av 2D-DIGE og ELISA er i samsvar med en fersk studie være Chen et al. Appling ulike tilnærminger inkludert ELISA de fant en oppregulering av apolipoprotein E i Paca-vev og forhøyede apolipoprotein E nivåer i Paca pasienter serum [40].
Gruppen av AIP og kontrollsera viste en lignende utbredelsesområde for apolipoproteinene, noe som indikerer at serum innholdet av disse proteinene er sammenlignbare. Det neste skritt vil være å teste om kombinasjonen av de identifiserte markørene gjør oss i stand til å gjøre en pålitelig prediksjon i ukjente seraprøver. Også andre her i studien identifiserte proteinene kan integreres i slike tester. Årsaken til redusert nivå av de ovennevnte proteiner i Paca og CP sera, sammenlignet med friske frivillige eller AIP, er uklart, men noen forklaringer eksisterer. Både CP og PACA-pasienter som lider av feilernæring og kakeksi stimulere syntesen av akutt-fase-proteiner i leveren, men syntese av apolipoproteiner, transthyretin og retinolbindende protein dråper. Imidlertid identifisering av kakeksi var ikke mulig, ingen dramatisk vekttap i pasientens medisinske historie ble registrert, flertallet av pasientene her analysert, viste normal eller svakt forhøyet BMI og bare en PACA pasient hadde en kroppsmasseindeks under 19, som vist i tabell 4. signifikante forskjeller for de enkelte proteinene ble observert i denne studien indikerer en helt annen etiologi av AIP på ett sted og CP og PACA på den andre.
