Abstract
Mikro RNA (mirnas) er viktige regulatorer involvert i ulike fysiske og patologiske prosesser, blant annet kreft. Den miRNA-302 familien har blitt dokumentert som å spille en avgjørende rolle i kreftutvikling. I denne studien undersøkte vi rollen som miRNA-302a i tykktarmskreft. MiRNA-302A uttrykk ble påvist i 44 tykktarm kreft vev og 10 normale tykktarm vev, og deres clinicopathological signifikans ble analysert. Celleproliferasjon og cellesyklusanalyse ble utført på tykktarm kreft celler som stabilt uttrykte miRNA-302A. Målet genet av miRNA-302a og nedstrøms veien ble videre undersøkt. Sammenlignet med vanlig kolon vev, ble miRNA-302a uttrykk nedregulert i tykktarm kreft vev. Overekspresjon av miRNA-302a indusert G1 /S cellesyklus arrest i tykktarm kreft celler, og undertrykt tykktarmskreft cellevekst både
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre miRNA-302a hemmet
AKT
uttrykk ved direkte binding til sin 3-utranslaterte område, noe som resulterer i påfølgende endringer av
AKT-GSK3p-cyclin D1
veien. Disse resultatene viser miRNA-302a som en tumor suppressor i tykktarmskreft, noe som tyder på at miRNA-302a kan brukes som et potensielt mål for terapeutisk intervensjon i tykktarmskreft
relasjon:. Sun S, Zhang G, Wu Z, Shi W, Yang B, Li Y (2014)
mikroRNA-302a
Fungerer som en antatt Tumor lyddemper i tykktarmskreft med målretting
Akt
. PLoS ONE 9 (12): e115980. doi: 10,1371 /journal.pone.0115980
Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 15 september 2014; Godkjent: 02.12.2014; Publisert: 26.12.2014
Copyright: © 2014 Sun et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. De clinicopathological funksjoner er ikke tilgjengelige for publikum, men kan gjøres tilgjengelig på forespørsel til tilsvarende forfatteren. Alle data som trengs for å replikere studien er til stede i papir
Finansiering:.. Forfatterne har ingen finansiering eller støtte til rapporten
Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Ifølge den kinesiske kreft~~POS=TRUNC Annual Report (2012), har tykktarm /endetarmskreft blitt den nest vanligste kreftformen og den andre og fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødelighet hos kvinner og menn, henholdsvis i Kina [1]. Faktisk er tykktarmskreft en av de vanligste kreftformene globalt, og står for om lag 9% av kreftrelaterte dødsfall [2], hovedsakelig på grunn av metastatisk progresjon [3]. Dette nødvendiggjør identifisering avanserte molekylære markører for diagnose som ville hjelpe til med tidlig diagnostisering og forebygging av metastatisk progresjon i tykktarmskreft. Kirurgi er fortsatt behandling av valget for tykktarmskreft; men i det siste, har en mer tverrfaglig tilnærming som omfatter neoadjuvant kjemoterapi blitt kjennemerket for behandling [4]. Det kanskje ikke kan understrekes nok skjønt behovet for å overvåke svulsten respons på behandlingen i orden for å velge de beste kandidatene for kirurgi for å sikre positive resultater, og der ligger behovet for å forstå den underliggende patologiske mekanismen av tykktarmskreft utbruddet og progresjon. De kritiske hendelser som styrer hele prosessen med tykktarmskreft metastaser er fortsatt i stor grad ukjent.
Økende bevis indikerer at microRNAs (mirnas), en type endogen, små ikke-kodende RNA, delta i ulike cellulære prosesser. Gjennom spesifikt bindende og spalte mRNA eller hemme deres oversettelse [5], mirnas funksjon som enten onkogener eller tumor suppressors [6].
Den miRNA-302 familien ble først identifisert i humane embryonale stamceller (hESCs) og menneskelig embryonale karsinom celler i 2004. Siden da, har forskjellige studier på miRNA-302 familie fokusert på den potensielle rolle i reprograming somatiske celler i induserte pluripotente stamceller, samt embryonisk selvfornyelse [7]. Flere transkripsjonsfaktorer som kommer til uttrykk tidlig i kreftstamcelle utvikling og vedlikehold, slik som
Oct4
,
Sox2
, og
Nanog
, ble funnet avgjørende for transkripsjonen regulering av miRNA-302 familie [8]. Interessant, Fareh et al. viste at stabile uttrykk for miRNA-302 var i stand til å indusere tap av
Oct4
,
Sox2
, og
Nanog product: [9]. Rollen til miRNA-302 i tumorigenesis har vært diskutert nylig, som motstridende konklusjoner har blitt trukket av ulike forskningsmiljøer. For eksempel ble endogen miRNA-302 ikke påvist i cervikale kreftceller, og ektopisk ekspresjon av miRNA-302 hemmet celleproliferasjon og tumordannelse [10]. I kontrast, transfeksjon av miRNA-302b i tykktarm kreft celler resulterte i en økning i stemness av CD133 + HT 29 celler
in vitro product: [11]. Men til dags dato, ingen studier har blitt gjennomført for å undersøke hvilken rolle miRNA-302 i kolon kreftpasienter og /eller i tykktarmskreft patogenesen i xenograft modeller, som var den viktigste formålet med studien.
materialer og metoder
Pasientprøver prøver~~POS=HEADCOMP
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP vev og godartet tykktarm vev ble oppnådd fra vevet bank på General Hospital i Folkets frigjøringshær. Clinicopathological funksjoner av disse pasientene ble hentet fra Institutt for Oncology database. Studien protokollen ble godkjent av Institutional Forskning Review Board på General Hospital i Folkets Frigjøringshær og signert informert samtykke ble innhentet fra alle deltagerne. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med Helsinkideklarasjonen og relevante retningslinjer i Kina.
Cell kultur
Mennesketykktarmskreft cellelinjer, HCT8 og HCT116 og humane embryonale nyre 293T celler ( HEK293T) ble kjøpt fra Shanghai Bioleaf Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kina). HCT8, HCT116 og HEK293T-celler ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum. Celler ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2.
RNA, miRNA ekstraksjon, og kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon
Total RNA ble isolert fra dyrkede celler og tumor vev ved hjelp Trizol reagens. Første kjede-cDNA ble syntetisert ved bruk av RevertAid First Strand cDNA-syntesesett (Liv Technology, Carlsbad, CA), som deretter ble anvendt for sanntids-polymerase kjedereaksjon (PCR), sammen med forover og revers primere, og strøm SYBR grønn PCR master Blande. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll for
AKT
transkripsjonsnivåer. Primersekvensene som ble brukt var som følger:
AKT
-forward: GGGTTTCTCCCAGGAGGTTT, omvendt: GTCCATGGTGTTCCTACCCA; β-actin-forward: ACCGAGCGCGGCTACAG, omvendt: CTTAATGTCACGCACGATTTCC. Ifølge produsentens instruksjoner, miRNA fra vev og celler ble ekstrahert med Mirvana miRNA isolasjon kit (Livet Technology, Carlsbad, California), og ble oppdaget uttrykket nivåer av miRNA-302a av TaqMan miRNA analyser (Livet teknologi, Carlsbad, California) ved hjelp U6 liten kjernefysiske RNA som en intern kontroll.
Vector konstruksjon, lentivirus produksjon og stabil transfeksjon
den modne HSA-miRNA-302a sekvensen ble syntetisert og innført i PLKO.3G vektor å produsere PLKO.3G-MIR-302a. Luciferase-3 «uoversatt region (UTR) reporter vektor ble generert gjennom subkloning av
AKT
3’UTR, som bærer en antatt miRNA-302a bindingssete i vektor MT01. Alle de konstruerte vektorer ble verifisert ved sekvensering. PLKO.3G-MIR-302a blandet med psPAX2 og PMD2-G ble transfektert inn HEK293T celler ved hjelp Lipofectamine 2000 reagens (Life Technologies, Carlsbad, CA) i henhold til produsentens protokoll. Førti-åtte timer senere, lentivirus ble høstet og brukt til å infisere HCT8 og HCT116-celler. Deretter ble cellene sortert ved strømningscytometri (Coulter Beckman, Brea, CA) for å etablere stabile cellelinjer som konstitutivt uttrykker miRNA-302a (HCT8-302a og HCT116-302a celler).
luciferase assays
Førtiåtte åtte~~POS=HEADCOMP timer etter transfeksjon, ble cellene lysert ved anvendelse av 50 ul av passiv lyseringsbuffer. Deretter ble en dual-luciferase assay utført som anvist av produsenten (Promega, Madison, WI). Forholdet mellom ildflue til Renilla luciferaseaktivitet ble anvendt for å gi uttrykk for luciferase-aktivitet. Alle forsøk ble utført in triplo. Data representert som gjennomsnitt ± standardavvik (sd).
Protein høste og western blot
Totalt proteiner ble høstet ved hjelp av CelLytic Extraction kit (Roche, Basel, Sveits) som inneholder proteasehemmere og deretter kvantifisert ved hjelp av BCA Protein Assay Reagent kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter separering av proteiner ved anvendelse av natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese, ble proteinet overført til polyvinylidenfluorid membraner og deretter blokkert i 5% fettfri melk. Ved hjelp av de primære antistoffer og anti-kanin-bundet til pepperrot-peroksidase (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas) som det sekundære antistoff ble målproteinene probet og deretter visualisert ved anvendelse av ECL western blotting Plus-system (Thermo Fisher Scientific , Waltham, MA). Blottene ble strippet og probet med α-β-actin-antistoff for å bekrefte tilsvarende lasting. De primære antistoffer omfattet følgende: AKT (1:1000), GSK3p (1:500), cyclin D1 (1:1000), PI3K (1:1000), PTEN (1:500) (Cell Signaling Technology, Boston, MA ) og β-aktin (1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX).
celleproliferasjon og cellesyklusanalyser
CCK-8 og edu analysene ble utført for å påvise celleproliferasjon . Kort sagt ble CCK-8-analyser utføres som følger: celler ble sådd i en 96-brønns plate ved en konsentrasjon på 1 x 10
4 celler /brønn. Etter tilslutning, cellene ble dyrket i friskt medium blandet med CCK-8 (10:01) (Dojindo, Shanghai) i 2 timer, før absorbansen ble målt med en mikroplateleser ved 450 nm. For Edu analyser, ble cellene inkubert i Edu løsning (1:5000) i 2 timer, deretter ble høstet og farget med Cell-Light Edu Apollo 643 In vitro flowcytometrisystemer Kit (Ribobio, Guangzhou, Kina), i henhold til produsentens instruksjoner . Cellene ble så analysert ved hjelp av strømningscytometri
A cellesyklusanalyse ble også utført ved anvendelse av strømningscytometri:. I korthet ble cellene fiksert med 75% kaldt etanol over natten, og deretter vasket med fosfatbufret saltløsning. Deretter ble propidiumjodid (50 ug /ml) tilsatt til cellene for DNA-farging før strømningscytometri-analyse.
kolonidannelse assay
Isolerte celler ble sådd i 60 mm plater ved en konsentrasjon 500 celler /brønn og deretter inkubert i 5% CO
2 ved 37 ° C. Tyve dager senere ble cellene farget med 0,5% krystallfiolett i 30 min. Colony tallene i hver plate ble telt ved hjelp av en invertert mikroskop.
In vivo
tumorigenicity
PLKO.3G-Scr-transfekterte HCT8 celler (HCT-8-Scr celler ) og HCT116-302a celler ble injisert subkutant i hver bakre flanke av den samme 4-6 uker gamle hann naken mus. Tumorvolumet ble beregnet, og tumorvekten ble målt etter ofring på dag 40. Tumorene ble så delt i to deler, hver del fiksert med 10% formalin eller oppbevart i -80 ° C. De dyreforsøk ble utført med godkjenning av dyrestudier Ethics Committee of General Hospital i Folkets frigjøringshær.
Immunohistochemistry
Immunohistochemistry (IHC) farging av parafininnstøpte prøvene ble utført som tidligere beskrevet [12]. I korthet ble kanin anti-AKT-antistoff og anti-mus /kanin pepperrot peroksidase-merket antistoff (Santa Cruz Biotechnology Co Ltd, Shanghai) ble anvendt som det primære og det andre antistoff, respektivt.
Statistisk analyserer
forskjellen mellom kontinuerlige variabler ble analysert ved hjelp av t-test eller analyse av varians. Tosidig P-verdier og 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS versjon 20.0 (IBM Corporation, New York).
Resultater
miRNA-302a uttrykk undertrykkes i tykktarm kreft vev
Colon kreft vev ble anskaffet fra totalt 44 mannlige pasienter med en gjennomsnittsalder på 67 år (fra 49 til 77 år) med nylig diagnostisert, patologisk bekreftet kreft i tykktarmen. Alle pasientene hadde fått kirurgisk reseksjon. Patologisk bekreftet normale kolon vev ble kjøpt fra som hadde fått radikal cystektomi 10 mannlige pasienter med blærekreft.
Vi har oppdaget miRNA-302A uttrykk nivåer i 44 kolon vev og 10 normale tykktarm vev og funnet ut at, sammenlignet med vanlig kolon vev, tykktarmskreft vev uttrykt lavere nivåer av miRNA-302a (fig. 1A). Videre analyserte vi forholdet mellom miRNA-302A nivåer og clinicopathological funksjoner i kolon kreftpasienter. Det var ingen signifikant sammenheng observert mellom miRNA-302A nivåer og alder eller klinisk stadium (data ikke vist).
(A) miRNA-302a uttrykk ble nedregulert i tykktarm kreft vev sammenlignet med vanlig kolon vev. (B) Lave nivåer av miRNA-302a uttrykk ble påvist i fire humane tarmkreftcellelinjer, HCT8, HCT116, HT29, og CaCO2. (C) ble påvist høye nivåer av miRNA-302a uttrykk i HCT8 og HCT116 tykktarm kreft celler som stabilt uttrykker miRNA-302a (* P 0,05)
Overuttrykte miRNA-302a hemmer tykktarmskreft cellevekst. in vitro og in vivo
for å undersøke funksjonen av miRNA-302a i tykktarmskreft, målte vi uttrykk for miRNA-302a i fire humane tykktarmskreft cellelinjer (HCT8, HCT116, HT29, og Caco2) ved kvantitativ real-time PCR. Som vist på fig. 1B, der var lav ekspresjon av miRNA-302a i alle fire cellelinjer. Fordi vi spekulert i at overekspresjon av miRNA-302a kan hemme tykktarmskreft cellevekst, vi stabilt overexpressed miRNA-302a i HCT8 og HCT116-celler (betegnet som HCT8-302a og HCT116-302a celler), som ble bekreftet av kvantitativ revers-transkriptase (QRT ) -PCR (fig. 1C).
De CCK-8, edu og kolonidannende analyser ble gjennomført for å undersøke om miRNA-302a overekspresjon påvirket tykktarmskreft celleproliferasjon
in vitro
. Som vist på fig. 2, var det en signifikant lavere (P 0,05) vekst i HCT8-302a og HCT116-302a celler sammenlignet med kontrollene. Flowcytometrisk analyser indikerte at prosenter av Edu-positive celler i begge HCT8-302a og HCT116-302a celler var lavere enn i kontrollene. I tillegg, sammenlignet med kontrollene, både HCT8-302a og HCT116-302a celler utviklet færre kolonier på det 20. og 15. dager, henholdsvis. Derfor
in vitro
eksperimenter demonstrerte at miRNA-302a som utøves en undertrykkende rolle i colon cancer celleproliferasjon.
CCK-8-analyse ble utført for å måle proliferasjon i (A) HCT8 og (B) HCT116-celler. Data representerer gjennomsnittet ± standardavvik for den optiske tetthet (OD) verdien detektert ved 450 nm fra tre uavhengige eksperimenter. Celleproliferasjon ble påvist i (C) HCT8 og (D) HCT116-celler ved anvendelse EDU-analysen analysert ved flow-cytometri. (E, F) kolonidannelse analyser indikerte færre kolonier i miRNA-302a overekspresjon HCT8 celler. (* P 0,05).
For ytterligere å validere våre observasjoner
in vivo
, ble HCT8-Scr celler og HCT8-302a celler injisert inn i venstre og høyre bakre flanke av nude mus, respektivt. Tumor volum ble målt ved hjelp calipers på ulike tidspunkter etter vaksinasjonen, og tumor vekter ble målt etter avliving. Både volum og masse var særlig lavere i HCT8-302a svulster enn i HCT8-Scr tumorer (P 0,05, Fig. 3). Tatt sammen, åpenbare inhibering celleproliferasjon ble observert etter overekspresjon av miRNA-302a i kolon kreftceller.
HCT8-GFP-celler og HCT8-302a celler ble injisert i venstre og høyre bakre flanke av nakne mus, henholdsvis ( A, B). Tumorvolumet (C) og massen (D) i den HCT8-302a gruppen var særlig lavere enn i den HCT8-GFP-gruppe. (* P 0,05).
Overuttrykte miRNA-302a induserer cellesyklus arrest i tykktarm kreft celler
Nå som veksthemming ble observert i tykktarm kreft celler, utførte vi cellesyklus analyse for å undersøke hvorvidt overekspresjon av miRNA-302a resulterte i cellesyklus endringer. Som vist på fig. 4, øker andelen av celler i G1-fase bemerkelsesverdig i HCT8-302a celler, mens andelen av celler i S-fasen var betydelig mindre enn i kontrollgruppen. Tilsvarende resultater ble observert i HCT16-302a celler, noe som tyder på at miRNA-302a effektivt indusere G1 /s cellesyklus arrest i tykktarm kreft celler.
Andelen av celler i G1-fasen økt betydelig i HCT8-302a celler ( A, C) og HCT116-302a-celler (B, D) sammenlignet med kontroller, mens andelen av celler i S-fasen var betydelig mindre enn kontrollene. (* P 0,05).
miRNA-302a undertrykker AKT uttrykk ved direkte rettet mot sin 3’UTR
For å oppdage de molekylære mekanismer som miRNA-302a utøver sin posttranskripsjonelt regulatoriske funksjoner brukte vi bioinformatikk algoritmer (https://www.targetscan.org) for å søke mulige målgener, og fant at 3’UTR av
AKT
mRNA havner en konservert bindingssete for miRNA-302A. Deretter undersøkte vi ekspresjonen av AKT på mRNA og proteinnivå i HCT8-302a og HCT116-302a celler og kontroller. Som vist på fig. 5A og 6, sammenlignet med kontroller, AKT uttrykk signifikant redusert i HCT8-302a og HCT116-302a celler, både på mRNA og proteinnivå. Videre AKT ekspresjon i HCT8-302a tumorer var betydelig lavere enn i HCT8-Scr tumorer, som bestemt ved sanntids-PCR og IHC-farging (fig. 5B, C). Disse resultatene tyder på at AKT uttrykk er nedregulert av miRNA-302a i tykktarmskreft.
AKT
mRNA uttrykk ble bemerkelsesverdig undertrykt i (A) HCT8-302a og HCT116-302a celler, og (B ) HCT8-302a svulster. (C) Immunhistokjemi farging indikerte lavere ekspresjon av AKT i HCT8-302a tumorer. (D) Relativ luciferaseaktivitet ble særlig undertrykket i villtype AKT-3 «utranslatert region (UTR) transfekterte celler. (E) Skjematisk representasjon av luciferase reporter, som bæres villtype eller mutant
AKT
-3 «UTR. (* P 0,05).
Western blot analyser viste downregulated AKT og cyclin D1 nivåer, og oppregulert GSK3p nivåer i miRNA-302a overekspresjon HCT8 celler. PTEN og PI3K nivåer ble ikke påvirket.
For å teste om miRNA-302A regulerer
AKT
av direkte binding til sin 3’UTR, en luciferase reporter vektor som inneholder menneske
AKT
3’UTR som fraktet villtype miRNA-302a bindende sekvensen ble under klonet. En luciferase vektor som bærer den muterte 7-bp region komplementære til 5′-regionen av frø miRNA-302a ble generert som kontrollen reporter (fig. 5E). Sammenlignet med kontrollgruppen, ble den relative luciferaseaktiviteten undertrykket med 36% (P 0,05) i villtype
AKT
3’UTR transfekterte celler (figur 5D.). Derfor hemmer miRNA-302a tykktarm kreft celler via direkte rettet mot
AKT
.
miRNA-302A indusert cellesyklus endringer i tykktarm kreft celler ved å hemme AKT-GSK3p-cyclin D1 veien
for å ytterligere evaluere effekten av miRNA-302a på AKT signalveien, vi har oppdaget uttrykk for oppstrøms (PI3K og PTEN) og nedstrøms (GSK3p og cyclin D1) AKT effektorer av western blot. Sammenlignet med tilsvarende kontrollcellene, GSK3p nivåene var særlig forhøyet, mens cyclin D1 ble særlig redusert i miRNA-302A transfektert HCT8 andHCT116 celler. Men uttrykket av to store oppstrøms effektorer av AKT, PI3K og PTEN, ikke ble påvirket av miRNA-302a transfeksjon (Fig. 6). Gitt den kritiske rollen til AKT-GSK3p-cyclin D1 signalveien i cellesyklusen overgang, våre resultater tyder på at miRNA-302a kan indusere G1 /S cellesyklus arrest i tykktarm kreft celler ved å hemme AKT-GSK3p-cyclin D1 veien, og dermed undertrykke tykktarmskreft celleproliferasjon.
Diskusjoner
i denne studien, observerte vi at miRNA-302a ble nedregulert i tykktarm kreft vev. Overekspresjon av miRNA-302a indusert G1 /S arrest i tykktarm kreft celler, og bemerkelsesverdig undertrykt tykktarmskreft celleproliferasjon
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre
AKT
ble avslørt som en direkte og funksjonell target gen av miRNA-302a.
I løpet av det siste tiåret, mest forskning som involverer miRNA-302 har fokusert på sin rolle i hESCs, som er preget av selvfornyelse og pluripotency. Studier analysere miRNA-302 funksjon i kreftutvikling er begrenset og inkonsekvent. Lin et al. fant at miRNA-302 kan hemme tumordannelse og indusere apoptose i humane brystkreft MCF7 celler, foster teratokarsinomceller Tera-2 celler, og leverkreft HepG2 celler [13]. Tilsvarende ble celleproliferasjon undertrykket i livmorhalskreft Hela og Siha celler, så vel som leverkreft SMMC-7721-celler, via cellesyklusregulering [10], [14]. Imidlertid, Zhu et al. observert en invers fenomen i tykktarm kreft celler, hvor overekspresjon av miRNA-302b førte til økt koloni-dannende evne
in vitro product: [11]. Augmented kolonidannelse evne ble likeledes validert i kreftstamceller fra hode og hals plateepitelkarsinom [15]. For første gang avslører vi undertrykt miRNA-302a uttrykk i tykktarm kreft vev sammenlignet med vanlig kolon vev. Derfor spekulerer vi at miRNA-302a kan spille en viktig rolle i tykktarm kreft utvikling og progresjon.
I vår studie ble det observert en hemmende effekt av miRNA-302a på celleproliferasjon i tykktarm kreft HCT8 og HCT116-celler, gjennom hindrer G1 til S faseovergang, som anses som en viktig hendelse i løpet av celleproliferasjon. I samsvar med tidligere studier [8], [10], [14], også fant vi bemerkelsesverdige nedregulering av cyclin D1 i miRNA-302a overekspresjon tykktarmskreftceller. Interessant er miRNA-302 spådd å målrette mange cellesyklus regulatorer. For eksempel Lin et al. viste at miRNA-302 samtidig undertrykkes både syklin E-CDK2 og cyclin D-CDK4 /6 signalveier [13], og dette målet blokkering ble regulert av flere transkripsjonelle faktorer, for eksempel Oct4 og Sox28. Men kort et al. rapporterte at miRNA-302a fremmet en økning i S-fasen, og en reduksjon i G1 fase i hESCs, selv om cyklin D1 ble også undertrykt [8]. Åpenbart videre forskning belyse de eksakte mekanismene av miRNA-302 funksjonen er garantert.
Våre observasjoner at overekspresjon av miRNA-302a i tykktarm kreft celler indusert hemming av cellevekst
in vitro Hotell og
in vivo
tyder på at miRNA-302a kan poste-transcriptionally regulere en sentral gen som er involvert i celledeling. Som et viktig onkogen,
AKT
påvirker et bredt spekter av fysiologiske funksjoner, inkludert metabolisme, proliferasjon, overlevelse, angiogenese, migrering og invasjon [16]. Våre resultater indikerer at miRNA-302a trykt spredning og tumorgenisiteten av tykktarmskreftceller gjennom AKT-GSK3p-cyclin D1 veien, og ved direkte binding til 3’UTR av
AKT
. Videre uttrykk for PI3K og PTEN, som er hoved oppstrøms effektorer av AKT og har også vist seg viktig i tykktarm kreft utvikling, var ikke påvirket av miRNA-302. Den regulerende rolle miRNA-302 i AKT ble også demonstrert av Cai et al: etter miRNA-302s transfeksjon inn i cervikale kreftceller, de observerte forhøyet ekspresjon av cyklin-avhengige kinase-hemmere p27Kip1 og p21Cip1, sammen med downregulated AKT nivåer [10]. Derfor som et mål av miRNA-302,
AKT
var spesielt undertrykt og utløste endringer i mange nedstrøms signalveier.
Våre funn også gi visse ledetråder med hensyn til mirnas-målrettet kreftbehandling. Tidligere studier viser at enkelte mirnas ble ofte overuttrykt i tumorer, mens de fleste mirnas var.
downregulated [17], [18]. Global miRNA undertrykkelse ble funnet å øke kreftutvikling i både
in vitro Hotell og
in vivo
modeller [19], fremhever pro tumorigene effekter etter miRNA tap-av-funksjon. Liang et al. observert en sensibiliserende rolle miRNA-302 erstatningsterapi hos brystkreftceller for ioniserende stråling [20]. En annen fersk studie rapporterte at viral levering av la-7 miRNA kan hemme tumorvekst i et adenokarsinom modell mus lunge [21]. Likeledes våre resultater validert den hemmende effekten av miRNA-302a erstatning i tykktarm kreft celler. Samlet utgjør disse studiene tyder på at overekspresjon av en eneste miRNA i kreftceller kan gi betydelig terapeutisk effekt.
I sammendraget, vår studie viser at miRNA-302a er avgjørende for tykktarmskreft cellevekst ved å regulere G1-S faseovergangen. MiRNA-302A uttrykk undertrykkes i tykktarm kreft vev. I tillegg, gjennom direkte binding til sin 3’UTR, miRNA-302A hemmer
AKT
uttrykk, noe som resulterer i påfølgende endringer i AKT-GSK3p-cyclin D1 veier. Selv om det er klart at miRNA-302a er med i tykktarmskreft, videre studier er nødvendig for å forklare de nøyaktige mekanismer som ligger under dens rolle i tykktarmskreft progresjon, og dermed bestemme den potensielle verdien som en biomarkør og /eller et terapeutisk mål.
