Abstract
Mange levetid gener har blitt oppdaget i modellorganismer og endre deres funksjon resulterer i lengre levetid. I pattedyr, har noen spekulert i at noen helsemessige fordelene avledet fra å manipulere disse samme trasé kan bli motvirket av økt kreftrisiko på grunn av deres tilbøyelighet til å øke celleoverlevelse. Den SIR2 /SIRT1 familie av NAD
+ – avhengige deacetylases foreslås å ligge til grunn de helsemessige fordelene av kalori begrensning (CR), en diett som grovt undertrykker kreft hos pattedyr. Her viser vi at CR induserer en dobling SIRT1 uttrykk i tarm hos gnagere og at ektopisk induksjon av SIRT1 i et β-catenin-drevet musemodell for tykktarmskreft reduserer tumordannelse, spredning og dyr sykelighet vesentlig i fravær av CR. Vi viser at SIRT1 deacetylates β-catenin og undertrykker dets evne til å aktivere transkripsjon og drive celleproliferasjon. Videre fremmer SIRT1 cytoplasma lokalisering av den ellers kjernefysisk-lokaliserte onkogen form av β-catenin. I samsvar med dette ble det en signifikant invers korrelasjon funnet mellom tilstedeværelsen av atom SIRT1 og onkogene form av β-catenin i 81 humane tykktarmskreftprøver analysert. Samlet utgjør disse observasjonene viser at SIRT1 undertrykker tarmsvulstdannelse
in vivo Hotell og øke muligheten for at behandling rettet mot SIRT1 kan være av klinisk bruk i β-catenin-drevet malignitet
Citation. Firestein R, Blander G, Michan S, Oberdoerffer P, Ogino S, Campbell J et al. (2008) SIRT1 deacetylase undertrykker Tarm tumorigenesis og Colon kreft vekst. PLoS ONE 3 (4): e2020. doi: 10,1371 /journal.pone.0002020
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA
mottatt: 5 mars 2008; Godkjent: 11 mars 2008; Publisert: 16 april 2008
Copyright: © 2008 Firestein et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. RF var støttes av NIH T32 Grant. GB ved en Estee Lauder postdoktorstipend. PO av en National Space Biomedical Research Institute Grant. DAS, SO, CSF og LG med tilskudd fra NIH; RD delvis av den egenutført Research Program av NIH /NIA. DS er også støttet av en gave fra Paul F. Glenn Foundation
Konkurrerende interesser:. Leonard Guarente og David Sinclair er konsulenter til Sirtris Pharmaceuticals. William Hahn er konsulent for Novartis Pharmaceuticals.
Innledning
Kreft er den nest største årsaken til aldersrelatert dødelighet hos mennesker. Calorie begrensning forlenger levetiden på alle organismer som ble testet og hos pattedyr utøver sterke kreft undertrykkende effekter [1]. I lavere eukaryoter,
SIR2
genet er foreslått å formidle de helsemessige fordelene av CR [2], [3]. SIRT1, pattedyr ortolog av
SIR2
, er indusert av CR i flere vev hos pattedyr, og har vist seg å lindre degenerative sykdommer forbundet med aldring, slik som neurodegenerering og metabolsk nedgang [4]. Mens CR er kjent for å inhibere både spontan og indusert tumordannelse, er fortsatt en rolle for SIRT1 i denne prosessen for å bli demonstrert [5]. Det er motstridende data
in vitro
om hvorvidt SIRT1 vil bli funnet å fungere som et onkogen eller som en tumor suppressor men hittil har det ikke vært noen
in vivo
studier som adresserer dette spørsmålet. På den ene side er SIRT1 oppregulert i tumorer og kreftceller som mangler tumorsuppressorgen, HIC1 [6], kan hemme apoptose [7], [8], [9], [10] og nedregulerer ekspresjon av tumor suppressor gener [11], som fører mange til å konkludere med at SIRT1 vil vise seg å være et onkogen
in vivo
. På den annen side kan SIRT1 være pro-apoptotiske [12] og anti-proliferativ [13], [14], og følgelig blitt foreslått å oppføre seg som en tumor suppressor
in vivo
. Dessuten har enkelte hevdet at pattedyr levetid gener som forsinker aldersrelaterte atrofisk sykdommer kan omvendt disponere mennesker til en høyere forekomst av kreft på grunn av sin anti-apoptotisk funksjon [15]. Denne studien løser dette omstridt spørsmål ved å teste effekten av SIRT1 på tumordannelse og vekst.
Vi valgte å teste effekten av SIRT1 i APC
min /+ modell av kreft i tykktarmen for en rekke grunner : det fysiologisk sammenfatter de tidlige hendelsene i tykktarmskreft hos mennesker, mekanismen for tumorigenesis er godt karakterisert, og CR er tidligere blitt vist å redusere raten av tumordannelse i denne modellen [16]. APC
min /+ mus inneholder en germline mutasjon i adenomatøs polypose coli (APC) tumor suppressor genet [17]. Somatiske tap av andre allelet fører til konstituerende kjernefysiske lokalisering av β-catenin og adenom formasjon [18], [19].
β-catenin er den sentrale effektor i den kanoniske Wnt signalveien som styrer stamcelle vedlikehold , utvikling og karsinogenese [20]. Konstitutiv aktivering av β-catenin veien har blitt funnet i 90% av kolorektal kreft [21], [22]. I tillegg er denne veien avvikende aktivert i mange andre kreftformer, inkludert prostata, bryst, eggstokk og melanom. Interessant nok har to nylige studier vist at økte Wnt signalisering er forbundet med akselerert aldring, noe som tilsier at en dempning på Wnt signalering kan ligge til grunn for CR og være fordelaktig ikke bare for behandling av kreft, men for større utstrekning å dempe sykdommer av aldring [23], [24] .
Vi rapporterer her at SIRT1 undertrykker intestinal tumorigenesis i APC
min /+ musemodell og hemmer tykktarm kreft vekst. Vi gir betydelig bevis for at anti-tumorigen virkninger av SIRT1 være avhengig av dens deacetylase-aktivitet og blir mediert gjennom hemming av β-catenin. Disse funnene identifisere en svulst undertrykkende funksjon for SIRT1, gir mekanistisk innsikt, og foreslå en terapeutisk rolle for SIRT1 deacetylase aktivatorer i tykktarmskreft.
Resultater
Tidligere studier har vist en dramatisk svulst undertrykkende effekt av CR men den molekylære mekanismen (e) er foreløpig ukjent. Vi observerte at rotter på en CR diett har ca. 2 ganger høyere nivåer av SIRT1 i tarmepitelet forhold til
ad lib
-fed kontroller (Fig. 1a). For å teste effekten av å øke SIRT1 uttrykk i intestinale epitelceller, genererte vi en floxed SIRT1 transgen mus (Fig. 1B). SIRT1 transgene mus ble krysset til APC
min /+ mus etterfulgt av avl til Villin-Cre belastning [25]. Dermed genererte vi trippel transgene mus (SIRT1
ΔSTOP, Vil-Cre, APC
min /+) som overuttrykker SIRT1 spesielt i tarmen villi (referert til som SIRT1
ΔSTOP). De SIRT1 nivåer i tarmen av SIRT1
ΔSTOP mus var omtrent syv ganger (fig. 1E) og morfologi av villi dukket ellers normal (Fig. 1F).
(A) Western blot analyse viser uttrykk nivåer i tarmen epitel SIRT1 i ad Libitum foret (AL) eller kalorifattig (CR) rotter. β-actin tjente som lasting kontroll i alle baner. (B) Skjematisk representasjon av den strategi som brukes for generering av den floxed SIRT1 mus embryonale stamceller (MES) celler. SIRT1 ble klonet nedstrøms for et konstituerende CAGGS promoter etterfulgt av en transkripsjons loxP-STOP-loxP kassett. Denne konstruksjonen ble spesielt rettet i 3′-UTR av kollagen A1 locus (ColA1) av mus embryonale stamceller (MES) celler ved FLP rekombinasjon. De målrettede MES-celler ble injisert inn i blastocyster. Røde piler indikerer plasseringen av SIRT1-Tg genotyping primere. (C) Southern blot viser bekreftelse på SIRT1
STOPP enkelt integrering i Col1A locus av MES celler. (D) PCR bekrefter germline overføring av SIRT1
STOPP transgen til kimærer «avkom. (E) Western blot viser nivåene av SIRT1 i trippel gene mus overekspresjon SIRT1 (SIRT1
ΔSTOP) og kontroller (SIRT1
STOP). β-actin tjente som lasting kontroll i alle baner. (F) mucin flekken og immunhistokjemi av SIRT1 i tynntarmen av eksperimentelle (SIRT1
ΔSTOP) og kontroller (SIRT1
STOP) dyr.
APC
min /+, SIRT1
STOP kontroll mus som ikke overuttrykker SIRT1 (referert til som SIRT1
STOP) viste de typiske tegn på svulst sykelighet ved 16 ukers alder, som dokumentert av overt anemi og kakeksi, mens APC
min /+ mus overekspresjon SIRT1 (SIRT1
ΔSTOP) vises ingen klare tegn på tumorassosiert morbiditet (fig. S1 A, B). Undersøkelse av tarmen fôr på fire måneders alder viste at SIRT1
ΔSTOP transgene mus hadde betydelig mindre og færre svulster langs tarmkanalen (Fig. 2A). Kvantifisering av tumorbyrden viste en 3 til 4 ganger reduksjon i antallet og størrelsen av adenomer i tynntarmen og tykktarmen av de SIRT1
ΔSTOP mus (Fig. 2B). Ki-67 er en granulær komponent av den kjerne som er uttrykt utelukkende i prolifererende celler, og anvendes som en prognostisk markør i humane neoplasier. Adenomer av SIRT1
ΔSTOP mus hadde en betydelig reduksjon i antall mitoser (per høy effekt felt) og Ki-67 flekker, som viser at det var en nedgang i adenom spredning (Fig. 2C). Disse dataene viser at overekspresjon av SIRT1 i tarmen på samme nivåene som indusert av CR er tilstrekkelig til å etterligne svulsten undertrykkende effekt av CR i APC
min /+ mus.
(A) Bilder av hele duodenal og ileale avsnittene viser brutto tarmsvulster hos mus overekspresjon SIRT1 (SIRT1
ΔSTOP) og kontroller (SIRT1
STOP). Solid linje angir gastro-duodenal veikryss. Pilene viser adenomer. Hvit bar betegner en mm skala. (B) Gjennomsnittlig antall svulster i henhold til intestinal beliggenhet i SIRT1
STOPP kontroll (n = 8) og SIRT1
ΔSTOP eksperimentelle mus (n = 11). (C) Ki-67 farging av adenomer og spredning priser. Bildene viser Ki-67 immunhistokjemisk farging av adenomer fra SIRT1
STOPP og SIRT1
ΔSTOP. Spredning indeks er uttrykt som prosent av Ki-67 farget adenom-celler (i gjennomsnitt minst 10 adenomer per gruppe). Mitotisk rente er beregnet som antall histologisk identifiserbare mitotiske tall per 10 høyeffekts felt (400 ×). Verdier i B og C er midler ± s.d.
For å få innsikt i de mekanismer som SIRT1 reduserer cellulær proliferasjon, undersøkte vi effekten av SIRT1 på veksten av flere godt karakteriserte kreftcellelinjer. Spredning av LNCaP prostatakreftceller ble sterkt redusert ved overekspresjon av SIRT1 og effekten var lik undertrykke β-catenin seg selv (fig. 3A). Denne observasjon antydet at SIRT1 og β-catenin funksjon i samme cellulære sammenheng. For ytterligere å utforske denne muligheten, overexpressed vi SIRT1 og en katalytisk inaktiv SIRT1 mutant (SIRT1
ΔHY) i ulike menneskelige tykktarmskreft cellelinjer som Veksten er drevet av konstitutivt aktiv β-catenin (HCT116 og DLD1). En human koloncancer cellelinje hvori β-catenin er inaktiv (RKO) tjente som en negativ kontroll. Økt ekspresjon SIRT1 sterkt redusert proliferasjon i begge koloncancercellelinjer med konstitutivt aktiv β-catenin, men ikke i den β-catenin-inaktive cellelinje (Fig. 3A-D). Den SIRT1
ΔHY katalytisk mutant hadde ingen signifikant effekt på cellulær proliferasjon i en hvilken som helst av de cellelinjer (Fig. 3B-D). Således undertrykker SIRT1 β-catenin-drevet proliferasjon og dens katalytiske aktivitet er tydeligvis nødvendig for å oppnå denne effekten.
(A-D) Stabil LN-CAP, DLD1, HCT116 og RKO cellelinjer som uttrykker de angitte produkt ble sådd og celletallet ble overvåket ved forskjellige tidspunkter. Western blot ble utført med SIRT1, aktin eller β-catenin antistoffer. (E) DLD1 stabile cellelinjer som uttrykker Topflash-LuciferasePEST ble infisert med de angitte konstruksjoner. Celler ble analysert ved western blot med antistoffer mot SIRT1 og β-catenin. Luciferase aktiviteten ble normalisert for total prøve protein og representerer tre uavhengige eksperimenter utført i fire eksemplarer.
For ytterligere å forstå mekanismen som SIRT1 undertrykker β-catenin drevet spredning, vi konstruert den DLD1 cellelinje til å inneholde et stabilt integrert reporter med β-catenin responselementer (Super8XTopflash-Luciferase
PEST). Knockdown av β-catenin dramatisk redusert rapportøraktivitet, noe som viser avhengigheten av reporter på endogen β-catenin aktivitet (fig. 3E). Overekspresjon av SIRT1 redusert rapportøraktivitet, ved ~ 2-fold, mens den SIRT1
ΔHY katalytisk mutant hadde ingen effekt (fig. 3E), noe som tyder på at anti-proliferative effekter av SIRT1 formidles av dens evne til å undertrykke den transkripsjonelle aktivitet av endogen β-catenin og at dette krever SIRT1 deacetylase aktivitet.
acetylering av β-catenin av p300 /CBP forsterker sin onkogenisitet ved å øke β-catenin /TCF grådighet på målet genet arrangører [26]. For å teste om SIRT1 modifiserer β-catenin, ble HEK293T celler transfektert med en mutant form av β-catenin som konstitutivt lokaliserer til kjernen (S33Y-β-catenin) [27]. I disse cellene SIRT1 ko-immunopresipitert med β-catenin (fig. 4A) og vice versa (Fig. 4B). Et samspill mellom endogen SIRT1 og β-catenin var også tydelig (Fig. 4C).
(A) Menneskelige 293T celler ble transient transfektert med HA-S33Y-β-catenin i kombinasjon med enten FLAG-merket SIRT1 eller vektor kontroll. Alikvoter av totalt protein, ble underkastet immunoutfelling med anti-FLAG antistoff (IP FLAG). Immunoutfelt proteiner ble immunoblottet med anti-HA (øvre panel) og anti-FLAG (nedre panel). Venstre kjørefelt, ubehandlet ekstrakter (input). (B) Menneske 293T celler ble transfektert som i panel A. Proteiner immunoutfelt med anti-HA antistoff og immunoblottet med anti-FLAG (øvre panel), og anti-HA (nedre panel). Venstre kjørefelt, ubehandlet ekstrakter (input). (C) Immunpresipitasjon av SIRT1 fra LN-CAP celleekstrakter som bruker anti-SIRT1 antistoff eller normal kanin IgG som en kontroll (IgG). 10% av det immuno-protein ble deretter blottet med anti-SIRT1 (øvre panel), mens de resterende 90% ble blottet med anti-β-catenin antistoffer. (D) 293T-celler ble transfektert som angitt og lyseres 48 timer senere. Sammenlignbare nivåer av β-catenin ble immunopresipitert og blottet for acetylerte-lysin rester (IP: HA IB: Ac-K, øvre panel). Blottet ble reprobed for HA for å demonstrere omtrent like nivåer av HA-β-catenin (IP: HA IB: HA, nedre panel). (E-F) 293T celler ble transfektert som angitt sammen med TOP-FLASH luciferase og PRL-TK Renilla luciferase konstruere. Nikotinamid (NAM) eller retrovirale SIRT1 shRNA (RNAi) ble tilsatt som angitt. Dataene er normalisert med hensyn til Renilla luciferase-aktivitet. Dataene er midler ± s.d. fra prøver utført in triplo. (G) Indirekte immunfluorescens farging av DLD-en tykktarm kreft celler infisert med tom retrovirus eller virus som inneholder SIRT1 shRNA (RNAi) eller SIRT1 cDNA (overekspresjon, O /E). Prosent av celler med høy, middels eller lave nivåer av kjernefysisk β-catenin farging for ubehandlet: 6,5, 80,6, 12,9; SIRT1 O /E: 0, 29,4, 70,5; SIRT1 RNAi: 60,0, 32,0, 0,8. Bilder ble tatt på 100 × forstørrelse.
For å teste om SIRT1 hemmer β-catenin ved å modulere sin acetylering, transfektert vi 293T celler med S33Y-β-catenin, den acetyltransferase P300, og økende mengder SIRT1 . Vi har funnet at p300 acetylert β-catenin (fig. 4D) og forsterkes dens transkripsjonelle aktivitet, som er blitt tidligere rapportert [27] (fig. 4E). Tilsetningen av SIRT1 imidlertid opphevet den acetylerte form av β-catenin og betydelig redusert β-catenin aktivitet når den ble ko-transfektert med p300 (fig. 4D, E). Omvendt, behandling av cellene med det SIRT1 inhibitor nikotinamid (NAM) [28] eller undertrykke SIRT1 med en retroviral vektor shRNA (fig. 4F) øket luciferase reporter-aktivitet. Disse data viser at SIRT1 fremmer deacetyleringen av β-catenin, noe som reduserer dens evne til å virke som en trans-aktivator.
konstitutive Tilstedeværelsen av β-catenin i kjernen er forbundet med dets onkogene funksjon og klinisk med en dårlig pasient prognose [29]. For å teste om SIRT1 kan undertrykke β-catenin ved å endre sin lokalisering, immunfluorescens ble utført på celler transfektert med shRNA eller overekspresjon konstruksjoner for SIRT1. Undertrykkelse av SIRT1 i DLD1 tykktarm kreft celler økt mengden av kjernefysisk β-catenin mens overekspresjon av SIRT1 i samme cellelinje førte til en dramatisk reduksjon i kjernefysisk β-catenin basseng (Fig. 4G).
for å analysere den kliniske relevansen av funnene våre, analyserte vi SIRT1 og β-catenin subcellulære uttrykk i en vev microarray som inneholder 81 humane tarmkreft prøver. Vi har funnet at en undergruppe av coloncancere uttrykker SIRT1 i kjernen (47/81 tilfeller; 58%). Når β-catenin uttrykk ble scoret i de samme tykktarm kreft, en meget signifikant invers korrelasjon mellom nivået på SIRT1 uttrykk og kjernefysisk β-catenin lokalisering ble klart (p≤0.003, odds ratio 0,24 med 95% konfidensintervall 0,093 til 0,63) ( fig. 5A, B). Sammen er disse observasjonene tyder på at modulering av β-catenin subcellulære lokalisering er en viktig del av anti-tumorigen effekter av SIRT1 med potensial diagnostiske og terapeutiske klinisk relevans.
(A) Representative bilder som illustrerer SIRT1 og β-catenin subcellulære uttrykk i menneskelige colontumorer. For hver tykktarmskreft tilfellet vist en tekstboks innsats indikerer oppdaget protein (Bilde forstørrelse 200 ×). (B) Korrelasjon av SIRT1 og β-catenin uttrykk i humane colontumorer. Søylediagrammet viser kumulative farging data fra en vev microarray av 81 tykktarm kreft tilfeller. Nuclear uttrykk ble scoret som enten ingen uttrykk, svak uttrykk, eller moderat /sterkt uttrykk. Positivitet i kjernen ble definert som moderat /sterkt uttrykk. Alle lysbildene ble tolket av to bord sertifisert patolog blindet fra andre kliniske og laboratoriedata.
Diskusjoner
Her beskriver vi en fysiologisk relevant svulst undertrykkende rolle for SIRT1 i tykktarmskreft formasjon og vekst. Vi observerte at SIRT1 uttrykk i den normale tarm forekommer spesielt i enterocyttene, forløpercellene som gjennomgår neoplastisk transformasjon i coloncancere, og at SIRT1 blir oppregulert i gnager tarmen som svar på CR. Vi viser at overekspresjon av SIRT1 reduserer spredning i tykktarm kreft cellelinjer, og at overekspresjon SIRT1 i enterocyttene av APC
min /+ dyr ligner tumor undertrykkende effekten av CR på denne tykktarmskreft modell. Disse observasjonene er konsistente med en fersk
in vitro
studie som impliserer SIRT1 som et næringsstoff følsom vekst suppressor [30]. Mens SIRT1 er uttrykt i vår transgene mus på et høyere nivå enn sett i tarmen hos CR behandlet gnagere (7 ganger (SIRT1) versus to ganger (CR)), dette nivået av overekspresjon er, likevel, i tråd med funn som SIRT1 kan være fysiologisk oppregulert 5-10 ganger
in vivo product: [31]. Siden tumor undertrykkende effekter mediert av SIRT1 formørkelse de sett av CR (70% reduksjon (SIRT1) versus 40% reduksjon (CR)) [16] Vi kan ikke utelukke at SIRT1 hemmer også tumorvekst av en CR-uavhengig mekanisme. Likevel, våre data gi
in vivo
bevis for at overekspresjon av SIRT1 på fysiologisk relevante nivåer, kan undertrykke tumordannelse og vekst.
I denne studien har vi også til stede bevis for at SIRT1 samhandler med og undertrykker β-catenin, den transkripsjonsfaktor som driver tumorer i APC
min /+ modell og en rekke humane tumorer. Vi finner at SIRT1 overekspresjon hemmer veksten av tykktarmskreftceller avhengig av β-catenin aktivitet, undertrykker lokalisering av β-catenin til kjernen, og i betydelig grad demper dens evne til å aktivere transkripsjon. Disse effektene ble ikke observert i SIRT1-HY mutant som viser at SIRT1 deacetylase aktivitet er nødvendig, og øke muligheten for at SIRT1 direkte rettet β-catenin for deacetylering.
Tidligere studier har vist at β-catenin acetyleres av P300 /CBP, og den acetylerte form av protein har økt transkripsjonen aktivitet. Dette funn antyder at den antatte deacetylase at motvirke p300 /CBP vil være nyttig som et terapeutisk mål kreft [32]. I denne studien identifiserer vi SIRT1 som deacetylase som motvirker p300 /CBP og deacetylates β-catenin, og dermed bremse cellulær proliferasjon og tumorvekst
in vivo
.
Sammen våre data belyser evne SIRT1 å hemme β-catenin aktivitet og gir mekanistisk innsikt i anti-tumorigen effekter av SIRT1 i en godt karakterisert tykktarmskreft modell. Gitt at SIRT1 ble oppdaget som en homolog av en lang genet, er det interessant å merke seg den økende bevis for en sammenheng mellom Wnt /β-catenin signal og alders assosierte sykdommer. β-catenin har blitt koblet til andre aldersassosiert ondartede sykdommer slik som melanom, multippel myelom, og prostatakreft. Det er også den nylige oppdagelsen at oppregulering av Wnt /β-catenin signale akselererer aldring hos mus [23], [24]. Dermed vil det være verdt å undersøke hvorvidt SIRT1 kan gi beskyttelse mot andre aldersassosierte sykdommer på grunn av dens evne til å undertrykke Wnt /β-catenin signalering.
I sammendrag, ved hjelp av biokjemi, mus genetikk, og klinisk tumor prøver vi har funnet at SIRT1, et diett-responsive genet, er en regulator av β-catenin, og har en tumor undertrykkende funksjon. Vi konkluderer med at pattedyr levetid gener med anti-apoptotiske funksjoner, overraskende ikke nødvendigvis føre til økt tumorigenesis. Faktisk finner vi det motsatte er trolig tilfelle for SIRT1. Disse studiene begynner å svare på et viktig biologisk spørsmål angående funksjonen til en tast lang genet i kreftutvikling og vekst og foreslår en tidligere uidentifisert terapeutisk potensial for SIRT1 aktivatorer i kreft.
Materialer og metoder
gnagere
en Cre-induserbar SIRT1 uttrykk konstruksjon ble generert der en
loxP
flankert transkripsjonen STOP element ble satt inn mellom en CAGGS promotoren og SIRT1 cDNA. Denne konstruksjon ble rettet inn mot mus Collagen A1 locus ved bruk av FLP rekombinase-mediert genomiske integrasjons som beskrevet tidligere (1). MES celler som bærer en enkelt kopi av SIRT1
STOP-konstruksjon ble identifisert ved resistens overfor det antibiotiske markør hygromycin og Southern blotting. PCR primere og konstruere kart er tilgjengelig på forespørsel. To kloner ble injisert i blastocyster og begge generert unger, ~90% av disse viste bakterie nettoverføring. Tumorbærende mus som ble analysert var blitt backcrossed minst fire generasjoner i C57 /BL6. APC
min /+ og Villin-Cre transgene musestammer ble oppnådd i C57 /BL6 bakgrunn fra Jackson Labs (Bar Harbor, ME). SIRT1
STOPP dyr ble backcrossed to generasjoner til C57BL /6 mus før krysset til APC
min /+ til å generere SIRT1
STOP; APC
min /+ doble transgene. Disse dyrene ble avlet for å Villin-Cre transgene mus for å generere en kohort av SIRT1
ΔSTOP; Vil-Cre; APC
min /+ dyr. Dyrene ble opprettholdt ved Harvard Medical School og eksperimenter ble godkjent av Animal Care komité Harvard Medical School.
Mann Fischer-344 (F344) rotter ble avlet og oppdratt i et vivarium på Gerontology Research Center (GRC, Baltimore, MD). Fra avvenning (2 uker), ble rottene plassert individuelt i standard plastmerder med beta chip tre senger. Kontrolldyrene ble foret med en NIH-31 standarddiett ad libitum (AL). Ved en måneds alder den kalorifattig (CR) ble dyrene gitt en vitamin og mineral forsterkede versjon av den samme dietten i en mengde på 40% mindre mat (i vekt) enn AL-rotter som forbrukes i løpet av den foregående uken. Filtrert og surgjort vann var tilgjengelig ad libitum i begge grupper. Vivarium ble opprettholdt ved en temperatur på 25 ° C med en relativ luftfuktighet på 50% på en 12/12-timers lys /mørke syklus (lys på ved 06:00) Alle dyrene var 6 måneders alder og ofret mellom 09:00 og 11.00 tarmen ble raskt fjernet og grundig spylt med iskald PBS og plassert i flytende nitrogen og deretter lagret ved -80 ° C inntil behandlet for Western blotting ved anvendelse av standard fremgangsmåter.
Animal Pathology, Histopatologi og Immunhistokjemisk analyse
For grov tumoranalyse, ble hele tarmen skåret ut umiddelbart etter avliving, åpnet i lengderetningen og vasket med kald fosfatbufret saltløsning (PBS), mens låste ned en fast bærer. Adenomer større enn 0,5 mm fra den proksimale (10 cm distalt for pylorus), distal (10 cm proksimalt til cecum) og midtre (~ 50% av total tarm lengde) tynntarmen, så vel som i tykktarmen ble scoret. Tarmen ble utarbeidet ved hjelp av rullekake-metoden ved å vri dem rundt et glass pipette. Vev ble fikset og i parafin ved hjelp av standard histologi protokollen. Presis tumorstørrelse ble scoret mikroskopisk på hematoxylin /eosin farget muse tarmen ved hjelp av et mikroskop med et okular mikrometer. Immunhistokjemisk analyse av gnager vev ble utført med kanin anti-SIRT1 antistoff (Upstate Biotechnology, katt # 07-131), kanin anti-β catenin (Abcam # 2982), mus anti-β-catenin (Clone 14, BD transduksjon labs) og rotte anti-mus Ki-67 (Dako).
Immunhistokjemisk og Statistiske analyser
microarray (TMA) ble konstruert som tidligere beskrevet [33] med Automated Arrayer (Beecher Instruments, Sun Prairie , WI USA). For β-catenin og SIRT1 immunhistokjemi, ble antigen gjenfinning utført; deparaffinized vevssnitt ble behandlet av en mikrobølgeovn i 15 min i citratbuffer (BioGenex, San Ramon, California) i en trykkoker. Vevssnitt ble inkubert med 3% H
2o
2 (15 min) for å blokkere endogen peroksidase og deretter inkubert med 10% normalt geiteserum (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i PBS (10 min), fulgt av 10 min inkubasjon i serumfritt proteinblokk (DAKO, Carpinteria, CA). Primært antistoff mot β-catenin (klon 14, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ) (fortynning 1:400) eller SIRT1 (# 1104; Epitomics) (fortynning 1:100) ble påført i en time ved romtemperatur. Sekundært antistoff (BioGenex) (20 min), og deretter streptavidin-peroksidase konjugat (BioGenex) ble påført (20 min). Snittene ble visualisert ved diaminobenzidin (DAB) (2 min) og metyl-grønn counterstain. Nuclear uttrykk ble registrert som enten ingen uttrykk, svak uttrykk, eller moderat /sterkt uttrykk. Positivitet i kjernen ble definert som moderat /sterkt uttrykk. Alle β-catenin-farget TMA skred ble tolket av en patolog (S.O.) blindet fra andre kliniske og laboratoriedata. Alle SIRT1-farget TMA skred ble tolket av en patolog (R.F.) blindet fra andre kliniske og laboratoriedata. For statistisk analyse, ble chi-kvadrat test utført for kategoriske data ved hjelp av SAS programvaren (versjon 9.1, SAS Institute, Cary, NC). P-verdien var tosidig, og statistisk signifikans ble satt til p ≤ 0,05.
Plasmider
pcDNA3-FLAG-SIRT1, pBABE-Puro-hSir2 (SIRT1), pBABE-Puro -SIRT1
ΔHY, pcDNA-hA-S33Y-β-catenin og pBABE-Puro-S33Y- β-catenin har blitt beskrevet før. SIRT1 RNAi plasmider ble konstruert ved å klone sekvensene inn i pSUPER.retro plasmid (oligoEngine, Seattle, WA). En TOPFLASH plasmid ble kjøpt fra Upstate Bioteknologi (Lake Placid, New York), mens den andre ble generert ved kloning tandem TCF bindingsseter og TA-promoter fra SUPER8xTOPFLASH (gaver av Randall Moon) inn i Luciferase-PEST plasmid pGL4.15 (Promega , Madison, WI).
Cell transfections, Infeksjoner og Immunocytochemistry
293T, LN-CAP, DLD1, HCT116 og RKO celler ble opprettholdt i den anbefalte vev kultur media (American Type Culture Collection ( ATCC), Manassas, VA) og dyrket i en fuktet inkubator inneholdende CO
2 (5% v /v) ved 37 ° C. I over-ekspresjon eksperimenter, ble plasmider transfektert med Fugene 6-metoden (Roche). For stabil cellelinje generasjon, ble DLD1 celler valgt i hygromycin i to uker og enkle kolonier ble plukket og utvidet. For retroviral produksjon, ble 293T celler transfektert med overekspresjon eller RNAi plasmider samtidig med emballasje plasmider gag-pol og VSV-G eller PCL-ampho. At medier som inneholder virus-avkom frigitt for 293T-celler ble samlet opp og brukt til å infisere cellene i 3-6 timer i nærvær av 8 mikrogram /ml polybrene (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Mediet ble endret, og cellene ble inkubert i ytterligere 24-48 timer inkubasjon. De ble valgt med puromycin (Sigma Aldrich) i 24-48 timer og deretter trypsinert og sådd for eksperimenter.
For immunocytochemistry ble cellene sådd ut på 8 mm seks godt Teflon trykte lysbilder (elektronmikros Sciences). Tjuefire timer etter plating ble cellene fiksert ved inkubering med 4% paraformaldehyd i 30 minutter. Fikserte celler ble deretter inkubert med primære antistoffer til SIRT1 (# 1104; Epitomics (fortynning 1:100) og aktiv β-catenin (05-665; Chemicon) (fortynning 1:100) i 2 timer, etterfulgt av inkubasjon med sekundære antistoffer (Alexa Fluor 488 geite-anti-kanin-IgG og Alexa Fluor 568 geit-anti-mus IgG;. Molecular Probes) (fortynning 1:400) celler ble inkubert med 10 ug /ml Hoechst, vasket og montert med et dekkglass minst 20 celler ble scoret. per eksperiment og bildeopptak ble utført ved hjelp av et Olympus BX50 mikroskop.
Protein Extraction og Immunpresipitasjon
Cell ekstrakter ble analysert direkte ved Western blotting ble utarbeidet av cellelyse i 1 × SDS lasting buffer etterfulgt av koking og Western-analyse. celle~~POS=TRUNC ekstrakter~~POS=HEADCOMP for immunpresipitering ble fremstilt ved resuspendering fosfat-bufret salt-vasket cellepelletene i 1 ml Nonidet P-40 (NP-40) ekstraksjonsbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 150 mM NaCl, og 1% Nonidet P-40) supplert med EDTA-fri protease inhibitor cocktail tabletter (Roche) med 10 mM nikotinamid (NAA) og 5 uM Trichostatin-A (TSA). Etter inkubering på is i 30 minutter, ble ikke-ekstraherbart materiale fjernet ved sentrifugering ved 17 000
g
i 10 minutter ved 4 ° C, og de tømte supernatantene ble anvendt for immunpresipitering. Lysates ble immunoutfelt (2 timer), vasket 4 ganger med NP-40 buffer og ble behandlet av Western blotting.
proliferasjonsanalyser
DLD1, HCT116 og RKO cellelinjer infisert med den aktuelle konstruksjonen var utsådd i 24 brønners plater i en tetthet på 10.000 celler.
