Abstract
En hypoksisk mikromiljøet i tumorer har blitt anerkjent som en årsak til kreft eller resistens mot ulike kreftbehandlinger. I motsetning til nyere fremskritt i forståelsen av den akutte responsen av kreftceller til hypoksi, egenskapene til tumorceller i kronisk hypoksi forbli unnvikende. Vi har identifisert en bukspyttkjertelkreft cellelinje, ASPC-1, som er usedvanlig i stand til å overleve i flere uker etter 1% oksygenbetingelser mens de testes cancercellelinjer dø etter bare noen dager under disse betingelser. Ved kronisk hypoksi, ASPC-1 celler inngått en tilstand av dvalen preget av ingen spredning, ingen død, og metabolsk undertrykking. De reversibelt byttet til aktiv status etter å ha blitt plassert på nytt i optimale dyrkningsforhold. ATP omsetning, en indikator på energietterspørsel, var markant redusert og ledsaget av redusert AKT fosforylering. Tvunget aktivering av AKT resulterte i økt ATP omsetning og massiv celledød
in vitro Hotell og redusert antall sovende celler
in vivo
. I motsetning til de fleste kreftcellelinjer, primære-kultiverte kolorektal kreft celler lett inn den sovende status med AKT undertrykkelse etter hypoksi kombinert med vekstfaktor-utarmet forhold. Primære kolorektal kreft celler i dvalen var resistente mot cellegift. Dermed blir evnen til å overleve i en skadet mikromiljøet ved å inngå dvalen etter kronisk hypoksi kan være et felleseie mellom kreftceller. Målrette reguleringsmekanisme indusere denne sovende status kan gi en ny strategi for behandling av kreft
Citation. Endo H, Okuyama H, Ohue M, Inoue M (2014) Dormancy av kreftceller med bekjempelse av AKT aktiviteten bidrar til overlevelse i kronisk hypoksi. PLoS ONE 9 (6): e98858. doi: 10,1371 /journal.pone.0098858
Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 27 januar 2014; Godkjent: 08.05.2014; Publisert: 06.06.2014
Copyright: © 2014 Endo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av KAKENHI (25461937) (www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/, HE, MI), den Charitable Trust Osaka Cancer Forsker-funnet (HE), Japan Foundation for Applied Enzymologi (www.mt- pharma.co.jp/jfae/, HE, HO, MI), Takeda Science Foundation (www.takeda-sci.or.jp/, MI), og The Naito Foundation (www.naito-f.or.jp/, MI). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
mikromiljøet innenfor en solid svulst kan være svært heterogen [1]. På grunn av ufullstendige blodkarnett og ubalansen mellom proliferasjon og angiogenese, kan mikromiljøet i enkelte deler av en fast tumor være hypoksisk og dårlig forsynt med næringsstoffer [2], [3]. Avhengig av deres mikromiljø, kan kreftceller vise helt andre kjennetegn ved celleaktivitet, inkludert spredning, onkogene pathway aktivering, og metabolisme [4]. Tumorceller i et hypoksisk område fjernt fra blodkar viser redusert proliferasjon [5] og resistens overfor kjemo- eller radioterapi [6], [7]. Nylig, ved hjelp av en
in vivo
gen-tagging metode, ble det vist at kreftceller i hypoksiske områder kan være opprinnelsen til tilbakefall etter strålebehandling [8]. Det ble også rapportert at endring av genuttrykk i kronisk hypoksi ble assosiert med høye tilbakefall i pasienter med kolorektal kreft [9]. Gransker biologi av tumorceller i hypoksiske forhold kan være avgjørende for å bedre terapeutisk effekt og for utrydding av kreft. Etter oppdagelsen av hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α), transkripsjonsregulering som reaksjon på akutt hypoksi har blitt ganske godt belyst [10]. I motsetning til de svarene av kreftceller til akutt hypoksi, men hvordan kreftceller svare på det viktige, men forskjellig tilstand av kronisk hypoksi [11] forblir unnvikende.
PI3K /AKT signalering spiller en sentral rolle i å overleve, spredning, og metabolisme i kreftceller [12]. På grunn av de upassende aktivering av reseptor-tyrosinkinase (RTK) eller PI3K, eller tap av funksjon PTEN er konstitutiv aktivering av AKT hyppig observert på flere humane krefttyper [12]. Aktivert AKT fremmer glykolytiske eller biosyntetiske veier ved å aktivere GLUT1, heksokinase to, eller ATP-citrate lyase. En av de nedstrøms molekyler av PI3K /AKT er mTOR kompleks 1 (mTORC1), som fremmer proteinsyntesen og cellevekst. Dermed AKT /mTORC1 trasé spiller viktige roller for tumorvekst og metabolisme; men de tilgjengelige materialer for biosyntese er ikke alltid rikelig i heterogene svulstens mikromiljø. I hypoksisk regionen fjernt fra blodkar, vedvarende aktivering av AKT /mTORC1 vei kan føre til kritisk utarming av næringsstoffer og energikrise.
Evnen til å undertrykke basal metabolic rate og inngå en hypometabolic status er en livet-sparer for mange organismer når energikilden for eksempel oksygen og næring er begrenset [13], [14]. Faktisk er nedregulering av mTORC1 aktivitet i akutt hypoksi kjent [15] – [17], og undertrykkelse av mTORC1 er angivelig viktig for tumorcelleoverlevelse under stressbetingelser [4], [18], [19]. Ikke desto mindre, som nevnt, den kroniske reaksjon av kreftceller er mindre godt forstått.
En faktor som hindrer forbedret forståelse av responsen av kreftceller til kronisk hypoksi er mangel på etablerte
in vitro-modeller
. De fleste studier ved hjelp av cancercellelinjene er blitt utført i løpet av 24 timer, eller inntil noen dager, fordi de fleste kreftcellelinjer ikke kan overleve den alvorlige reduksjon av oksygen eller næringsstoffer for en lengre periode. I denne studien fant vi at en kreft i bukspyttkjertelen cellelinje, ASPC-en, kan stabilt overleve ved å inngå en inaktiv status, dvalen, for uker under hypoksiske forhold. I behandlingen av cellulær respons overfor denne kronisk hypoksi, har vi funnet at fosforylering av AKT ble nedregulert, slik at ASPC-1 celler for å redusere energibehovet og overleve under stressbetingelser. I tillegg fant vi at primær kolorektal kreft celler lett kunne gå inn dvalen etter hypoksisk og vekstfaktor-fratatt forhold, der de viste bemerkelsesverdig kjemoresistent tegn.
Resultater
Survival av celle linjer under kronisk hypoksi
for å undersøke effekten av langvarig hypoksi på kreftceller
in vitro
, vi undersøkte flere bukspyttkjertelkreft og tykktarmskreft cellelinjer dyrket i 1% oksygen i mer enn en uke å representere den kroniske tilstand, i motsetning til den korteste ramme av en dag eller så etter den akutte tilstand (figur S1). De fleste av de testede cellelinjene viste ingen betydelig reduksjon i celleformering og døde innen 7 dager. Således var det generelt vanskelig å dyrke cancercellelinjer enn en uke etter hypoksiske betingelser.
I motsetning til dette, ASPC-1, en bukspyttkjertelkreft cellelinje, var usedvanlig i stand til å overleve under forlengede hypoksiske betingelser (figur 1A og C). I den akutte fase, ASPC-1 celler i hypoksi vokste så vel som i normoksisk forhold, men formeringshastigheten gradvis reduseres inntil dag 7, og celletallet plateaued rundt dag 10 på mindre enn 80% konfluens i forsøksbetingelsene. Cellene i normoxia viste massiv celledød etter 14 dager, sannsynligvis på grunn av uttømming av vekstfaktorer eller næringsstoffer (figur 1B og C). I motsetning til dette, ble cellene i hypoksi var levedyktige i mer enn tre uker, uten noen tegn på celledød mens mediet ikke ble endret i det hele tatt. Cellesyklus analyse viste at S-fase celler drastisk redusert på dag 7 i hypoksi sammenlignet med i dag en i normoxia eller hypoksi (figur 1D). Cellene ble samlet i enten G0 /1 eller G2 /M-fasen. Dette redusert spredning var reversibel; etterhvert som nytt oxygenized og re-belagt i frisk medium, de ASPC-1 celler viste en gjenvinning av formeringshastigheten til kontrollnivåer med en liten forsinkelse, selv etter å ha blitt dyrket i 14 dager i hypoksi (figur 1E). Resultatene indikerte at ASPC-1 celler kan reversibelt angi en inaktiv status, dvalen under langvarig hypoksiske forhold.
levedyktig celle nummer (A) og prosent celledød (B) av ASPC-1 celler dyrket i normoxia ( 20% O
2) eller hypoksi (1% O
2). C) Fase kontrast og PI-farget bilder av ASPC-1 celler dyrket under de angitte betingelser. Scale bar = 50 mikrometer. D) Celle syklus analyse av ASPC-1-celler på dag 1 i normoxia eller dag 1 og dag 7 i hypoksi. Cellene ble pulset med BrdU i 2 timer og analysert ved flow-cytometri etter farging med anti-BrdU-antistoff og PI. Prosenter av cellene i S-fasen, er angitt. E) Re-vekst av ASPC-1-celler i en sovende status. ASPC-1 celler ble dyrket i hypoksi i 14 dager, og celletall ble overvåket etter re-seeding i normoksisk forhold.
Fordi de fleste cytostatika målrette voksende kreftceller, celler dvelende i dvalen ville være motstandsdyktig mot disse cytotoksiske reagenser. Faktisk, ASPC-1 celler dyrket i hypoksisk forholdene var resistente mot alle tre chemo narkotika undersøkt (Figur S2A). Både oksygennivå og proliferasjonsrate påvirke effektiviteten av radioterapi [20]. ASPC-1 celler i hvilestatus var mer resistente overfor røntgenbestråling sammenlignet med celler i normoxia eller i akutt hypoksi (figur S2B). Dermed ASPC-1 celler i dvale status var resistente mot konvensjonell kjemoterapi eller radioterapi.
Evaluering av energiomsetningen i henhold kronisk hypoksi
Vi har vurdert status for energiomsetningen av kreftceller videre i sovende tilstand. Som forventet, ASPC-1-celler forbrukes mer glukose og laktat produsert mer i den akutte fasen av hypoksi, sammenlignet med normoxia. I motsetning til dette, etter 7 dager med hypoksi, glukoseopptak og laktatproduksjon gradvis dempes (figur 2A, S3A og S3b). Oksygenforbruket hastighet ble også redusert i henhold til kronisk hypoksi (figur 2A). Vi beregnet ATP omsetningen fra laktat produksjonsrate og oksygenforbruk rate (figur 2A) og fant at redusert ATP omsetning i henhold kronisk hypoksi. Dette funnet ble også støttet av en langsommere reduksjon av cellulære ATP-nivåer etter tilsetning av en cocktail av inhibitorer for glykolyse og oksidativ fosforylering (figur S3C og S3D) [21].
A) Laktat produksjonsrate (til venstre) ble beregnet ut fra laktatkonsentrasjonen og integrert celle nummer på angitte perioder. O
2 forbrukshastighet (i midten) ble målt ved hjelp av en Clark typen oksygen-elektrode. ATP omsetning (til høyre) ble beregnet ut fra laktat produksjonsrate og O
2 konsumrate (mørk grå: laktat, lys grå: oksygen). N1, normoxia en dag; H1, hypoksi en dag; H7, hypoksi 7 dager. **
p
0,01, ***
p
0,001. B) Kvantitativ RT-PCR av en glukosetransportør og glykolytiske enzymer i ASPC-1 celler dyrket i hypoksi for de angitte dager.
I tillegg til disse analysene, vi undersøkte genuttrykk nivåer av glykolytiske enzymer og transportører (figur 2B). Etter eksponering for akutt hypoksi, uttrykk for
GLUT1
,
HK2
, og
PDK1
økt. I motsetning til dette uttrykket nivåer av disse genene ble redusert i kreftcellene i uvirksom. Disse resultatene var i samsvar med nedsatt glukoseopptak i kronisk hypoksi (figur S3A). Til sammen funnene indikerte at den sovende kreftceller produsert mindre ATP mens forbruker mindre ATP sammenlignet med aktivt delende celler, noe som tyder på en redusert energibehov. Således, undertrykkelse av den metabolske prosess er et annet karakteristisk for kreftceller i den sovende tilstand.
intracellulære signal i celler i hvilestatus
Deretter undersøkte vi intracellulær signalisering i den sovende tilstand kreft- -celler (figur 3A). Fosforylering av AKT redusert etter 7 dager med hypoksi, selv under vedvarende aktivering av oppstrøms RTK’er (fig S4A). Fosforylering av S6, en nedstrøms molekyl av mTORC1, ble redusert fra et tidligere tidspunkt, slik det ble tidligere rapportert [15], [16]. Oppregulering av fosfo-p38MAPK og nedregulering av fosfo-ERK har blitt rapportert å være et molekyl bryter for induksjon av latent status i flere kreftcellelinjer [22], [23], men vi har observert liten endring i deres nivå, og fosfo-p38MAPK ble ganske redusert i kronisk hypoksi. Fosforylering av eIF2α, som senere nedregulerer global proteinsyntese [24], ble oppregulert ved akutt hypoksi, men redusert i kronisk hypoksi (figur S4A), noe som tyder på en avgjørende forskjell i celleresponsen under disse to betingelser. Nivåene av PHLPP, en AKT Ser473 spesifikke fosfatase [25], [26], ble gjensidig økt med AKT de-fosforylering (figur 3A).
A) Immun av AKT /mTORC1 eller ERK /p38 MAPK veien i ASPC-1 celler dyrket i hypoksi. B) Immun av AKT signalisering og HIF-1α i ASPC-1 celler som uttrykker vektor kontroll, AKT-vekt, eller AKT-3A (inaktiv). C) Cellesyklusstatus av cellene ved dag 7 i hypoksi. Prosenter av cellene i S-fasen, er angitt ovenfor plottet og i den høyre grafen. D) ATP omsetningen målt ved tilsetning av inhibitor cocktail for glykolyse og oksidativ fosforylering. N1, normoxia en dag; H1, hypoksi en dag; H7, hypoksi 7 dager. E, F) Levedyktig celletall (E) og prosent celledød (F) av ASPC-1 celler dyrket i hypoksi. *
p
0,05, **
p
0,01, ***
p
. 0,001
Fordi redusert AKT fosforylering sammenfalt med induksjon av sovende tilstand, undersøkte vi den funksjonelle rollen AKT fosforylering i dvalen. Vi transdusert tre AKT-konstruksjonene inn i ASPC-1-celler: wt-AKT, AKT-3A (inaktiv form av AKT), og AKT-mΔPH (konstitutiv aktiv form for AKT) [27]. Når wt-AKT eller AKT-mΔPH ble overuttrykt, ble AKT-fosforylering opprettholdt selv ved kronisk hypoksi (figur 3B, S4B). I kontrollceller, uttrykk for GLUT1 økt i akutt hypoksi, men redusert i langvarig hypoksi, igjen fremhever en motsatt reaksjon under de to forholdene. I motsetning til i WT-AKT-overekspresjon celler, holdt seg høy selv i kronisk hypoksi (figur 3B) GLUT1 nivåer, ledsaget av kontinuerlig glukoseforbruk (figur S4C). På den annen side ble S6 fosforylering i kronisk hypoksi ble redusert til og med i WT-AKT-overuttrykkende celler (figur 3B). Cellesyklus analyse viste at wt-AKT-overekspresjon celler i kronisk hypoksi viste en høyere spredning hastighet i forhold til kontrollcellene (Figur 3C, Figur S4D). I ASPC-1-celler som uttrykker kontroll vektor eller inaktiv AKT-3A, redusert ATP omsetningen etter 7 dagers dyrking i hypoksi (figur 3D); imidlertid vedvarende WT-AKT-uttrykke celler høy ATP omsetning selv i kronisk hypoksi. Resultatene indikerte at vedvarende aktivering av AKT signale hemmet ASPC-1 celler fra å komme inn i en sovende tilstand i kronisk hypoksi, noe som tyder på en rolle for AKT undertrykkelse i å legge inn dvalen. Den levedyktig celle nummer redusert, mens dødeligheten økt etter 14 dager i WT-AKT-uttrykke celler (Figur 3E og F). AKT-mΔPH-uttrykkende celler viste massiv celledød på tidlige tidspunkter henhold hypoksiske forhold (figur S4E og s4F). Til slutt, når PTEN, en fosfatase av PI3K, ble slått ned, ble det observert en liten økning i AKT-fosforylering, ledsaget av en økning i celledød i kronisk hypoksi (figur S5). Samlet utgjør disse funnene tyder på at undertrykkelse av AKT fosforylering er funksjonell i overlevelse av kreft celler i sovende status.
HIF-1a delvis bidrar til induksjon av sovende status i kronisk hypoksi
Deretter undersøkte vi bidraget fra HIF i inaktive kreftceller (figur S6). Protein nivåer av HIF-1α ble økt etter eksponering for hypoksi og opprettholdes inntil dag 7 (figur S6D). Når HIF-1α nivåer ble tvangs redusert med shRNA (figur S6a), reduserte levedyktig celle nummer etter 7 dager, mens dødeligheten økt (figur S6b og S6C), noe som tyder på at vedvarende HIF-1α bidro også til celle overlevelse etter kronisk hypoksi. Knockdown av HIF-1α hadde liten effekt på AKT /mTORC1 signalering og noe økte PS6 nivåer (figur S6D), men overekspresjon av AKT hadde noen virkning på induksjonen av HIF-1α (figur 3B). Resultatene indikerte at HIF-1α og AKT uavhengig regulert sovende status i kronisk hypoksi.
Endring av sovende status
in vivo
av tvungen aktivering av AKT
Vi undersøkte karakteristikk av svulster som stammer fra AKT-mΔPH-uttrykker ASPC-1 celler
in vivo plakater (figur 4). Fosforylering av AKT kunne påvises bare i AKT-mΔPH tumorer, men ikke i kontroll tumorer (figur 4A). Vi observerte nedregulering av S6 fosforylering og bromdeoksyuridin (BrdU) opptaket i pimonidazole-positive området og dets proksimale sone i kontroll svulster, i tråd med vår forrige rapport med en annen kreftcellelinje [4]. Disse områdene antyder at det foreligger en sone med hypoksi-indusert uvirksom
in vivo
. I motsetning til dette, AKT-mΔPH-uttrykkende tumorer sjelden inneholdt den sovende sone i pimonidazole-proksimale region. De pS6- eller BrdU-positive celler ble observert selv ved grensen av nekrose (figur 4A).
A) Immunhistokjemi av xenotumors av ASPC-1-celler som uttrykker styrevektor (øvre) eller AKT-mΔPH (lavere) . N, nekrose; skala bar = 100 mikrometer. B) Prosent av BrdU-positive celler i området distale eller proksimale til pimonidazole-positive sone. C) Bredde på pimonidazole-positive sone i svulster fra vektor eller AKT-mΔPH; *
p
0,05, ***
p
. 0,001
Vi videre kvantifisert BrdU-positive celler i de områdene proksimale eller distale til den pimonidazole-positive sone (figur 4B). Prosentandelen av BrdU-positive celler ble bemerkelsesverdig redusert i området proksimalt for pimonidazole region sammenlignet med den distale området i kontrolltumorer. I motsetning til dette, AKT-mΔPH-uttrykkende tumorer inneholdt høye nivåer av prolifererende celler selv i det proksimale området. Videre er det i AKT-mΔPH tumorer, ble arealet av de pimonidazole-positive celler ble redusert i forhold til kontroll tumorer (figur 4C), noe som indikerer at AKT-mΔPH celler ikke kunne gå inn i en hvilestatus
in vivo og
var mer tilbøyelige til døden etter hypoksiske forhold.
induksjon av sovende status i grunnskolen kolorektal kreft celler
Deretter undersøkte vi om induksjon av sovende status etter kronisk hypoksi ble også observert i primære dyrkede kreftceller . Vi har nylig vist et nytt primærkultursystem, CTOs (kreftvev-stammer sfæroide), kolorektal, lunge, og urothelial kreft [28] – [30]. Vi forberedte CTOs prøver fra pasienter med kolorektal kreft og dyrket dem
in vitro plakater (figur 5A og B). CTOs vekst ble fullstendig inhibert under en kombinasjon av hypoksi og vekstfaktor-belastede forhold, selv om hypoksi alene var ikke tilstrekkelig til å eliminere veksten. Vi testet CTOs fra tre pasienter med kolorektal kreft, og alle prøvene gjen vokste godt umiddelbart etter re-eksponering for oksygen og vekstfaktor-inneholdende medium (figur 5C). Dermed induksjon av dvalen var ikke begrenset til ASPC-1 celler, men også ble observert i primærkreftceller.
A) CTOs vekst ble målt etter størrelse i forhold til dag 0. C45 CTOs prøvene ble dyrket i medium med (GF +) eller uten (GF-) vekstfaktorer. B) Representative bilder av C45 CTOs dyrket i angitte vilkår. Scale bar = 100 mikrometer. C) Gjengroing av CTOs i sovende status etter re-oksygenering og eksponering for vekstfaktor holdig medium. D) Immunohistokjemi av C45 CTOs dyrket i angitte vilkår for en dag. TUNEL flekker var på dag 14. Scale bar = 50 mikrometer. E) Immun av AKT /mTORC1 signalering og HIF-1α i C45 CTOs dyrket i angitte vilkår.
Videre undersøkte vi intracellulær signalisering i CTOs ved immunhistokjemi og immunoblot (figur 5D og E). Hypoksi kombinert med vekstfaktor uttømming fullstendig blokkert AKT signalering. Disse resultatene var i samsvar med CTOs vekst (figur 5A). Vi målte også oksygen og glukose forbruk i CTOs prøver (Figur S7). Hypoksi og vekstfaktor-belastede forhold alvorlig svekket disse metabolske prosesser, som ble også observert i ASPC-1 celler.
Vi undersøkte chemo-følsomheten CTOs i sovende status (figur 6). CTOs prøvene ble for-dyrket i hypoksi og vekstfaktor-belastede betingelser i 7 dager. Etter at de ble utsatt for 5-FU eller SN38, den aktive metabolitten av irinotecan, i 7 dager, etterfulgt av vasking og dyrking i frisk StemPro hESC. De CTOs prøvene i sovende status viste gjenvekst etter å ha blitt returnert til optimale dyrkningsforhold på en 10 ganger høyere dose enn CTOs prøvene i aktiv status (Figur 6A og B). Disse resultatene indikerte at kreftceller i sovende tilstand var mer resistente overfor kjemoterapi enn de som er i en aktiv tilstand.
A) CTOs prøvene ble dyrket i medium med (GF +) eller uten (GF-) vekstfaktorer, og underkant av 20% O
2 eller 1% O
2 forhold. 5-FU eller SN38 ble lagt til medium og behandlet i 7 dager (angitt med svarte striper). På dag 7, ble mediet forandret til frisk StemPro hESC inneholdende vekstfaktorer (sorte piler), og CTOs prøvene ble tillatt å vokse i henhold til 20% O
2. B) Representative bilder av CTOs prøver i (A). Scale bar = 100 mikrometer.
Diskusjoner
Vi demonstrert i denne studien som en kreftcellelinje og primære kolorektal kreft celler endre spredning og metabolske status etter langvarig hypoksiske forhold. Under kronisk hypoksi, kan cellene inngå en sovende tilstand som involverer fire egenskaper:. 1) ingen spredning, 2) ingen død, 3) metabolsk undertrykkelse, og 4) utvinning til aktiv status etter restaurering av optimale dyrkningsforhold
AKT er en nøkkel molekyl regulerings celleproliferasjon, overlevelse og metabolisme. Det er allment akseptert at aktivering av AKT bidrar til celleoverlevelse og medikamentresistens i akutt hypoksi [1], [31] – [33]. Derimot, som vi demonstrert her, i kronisk hypoksi, er nødvendig for induksjon uvirksom og overlevelse av kreftceller hemming av AKT-aktivitet. På grunn av at tilførselen av både oksygen og næringsstoffer ville være begrenset i et område borte fra blodkar i en ondartet svulst, bevare energikilden ved å redusere energibehovet kan være en strategi med kreftceller til å overleve i en kronisk forverret mikromiljøet.
Den mekanismen som AKT aktivitet er undertrykt i kronisk hypoksi fortsatt et åpent spørsmål. Mulige kandidater omfatter 1) inaktivering av oppstrøms kinaser så som RTK’er og PI3K, 2) tilbakekoblingssløyfe ved S6K aktivering, eller 3) aktivering av fosfataser som PTEN og PHLPP. De to første mulighetene er lite sannsynlig gitt følgende funn i nåværende arbeid: 1) fosforylering av erbB familie RTK og MET holdt seg høy selv i kronisk hypoksi (figur S4A), og 2) mTORC1 aktivitet er undertrykt både akutt og kronisk hypoksi (figur 3A). Den tredje mulighet er støttet av våre funn at nivåene av PHLPP økte parallelt med AKT inaktivering (figur 3A), og at tvangs undertrykkelse av PTEN fremmes død hos kronisk hypoksi (figur S5b). Videre studier vil belyse den nøyaktige mekanismen.
I stressrespons i hypoksi, har nedregulering av mTOR aktivitet, utfoldet protein respons, og transcriptional aktivering av HIF blitt godt undersøkt [10], [34]. REDD1 undertrykker mTORC1 aktivitet gjennom TSC1 /2 i hypoksi, noe som resulterer i hemming av Cap-avhengige mRNA oversettelse [15], [16]. I utfoldet protein respons, en ER bosatt kinase, ekstra fordel, phosphorylates eIF2α og undertrykker mRNA oversettelse [24]. Fordi proteinsyntesen er en energikrevende prosess, kanskje trasé undertrykke det spiller rolle i induksjon av dvalen etter kroniske hypoksiske forhold. Faktisk, observerte vi undertrykkelse av mTORC1 aktivitet og økt fosforylering av eIF2α i akutt hypoksi (figur 3A, figur S4A). Fordi celleproliferasjon og metabolisme ble opprettholdt i akutt hypoksi, de kan være nødvendig, men ikke nok til å indusere dvalen i kronisk hypoksi. HIF-1α og HIF-2α er nøkkeltranskripsjonsfaktorer som regulerer hypoksisk reaksjon [10]. Ved akutt hypoksi, er HIF proteiner stabiliseres og aktiverer transkripsjon av en rekke gener nedstrøms. På den annen side, i langvarig hypoksi, HIF proteiner velig nedregulert av tilbakekoblingsmekanismer. I våre resultater, men uttrykk for HIF-1α ble oppholdt i dvale status under langvarig hypoksi (figur S6D), og knockdown av HIF-1α resulterte i økt celledød i kronisk hypoksi (figur S6a og S6B), noe som indikerer at vedvarende uttrykk for HIF-1α var også nødvendig for overlevelsen av ASPC-1 cellene under kronisk hypoksi.
Selv om ukontrollert spredning er et kjennetegn på kreft, humane tumorer samt xenografter av humane tumorer vise proliferative indeksene så lavt som 20% [ ,,,0],35]. Disse ikke-prolifererende celler i tumorer er ofte blitt betegnet som hvilende celler. Nylig har kreftstamcelle teori, hvori tumorer er antatt å bli opprettholdt ved sine egne stamceller, blitt intenst undersøkt [36]. Fordi quiescence er et kjennetegn på normale voksne stamceller, har hvilende kreftstamceller vært spekulert i, men deres eksistens i menneskelige solide svulster har ikke vært direkte utforsket [36]. Hos voksne stamceller, er quiescence definert som en cellesyklus fase, G0 [37], mens ASPC-1-celler i hvilestatus var til stede i den aktuelle arbeid både G1 /G0 og G2 /M-faser (figur 1C). Den sovende status i denne studien kan avvike fra quiescence, men assosiasjoner forbli åpne spørsmål.
Tumor uvirksom har vært studert som den tilstand der tumorer forbli asymptomatisk i en lang periode, år i noen tilfeller [37], [38]. To modeller finnes for svulst dvalen, tumormasse dvalen og tumorcelle dvalen. Den tidligere antar en likevektstilstand mellom celleproliferasjon og celledød, mens i sistnevnte tilfelle, tumorceller angi cellesyklus-stans og forbli stillestående. Den hypoksi-indusert dvalen identifisert i denne studien, som følge av kronisk snarere enn akutt hypoksi, kan dele funksjoner med sistnevnte, men de viktigste molekylene er identifisert her forskjellig. I en epidermoid-karsinom-cellelinje, for eksempel, balansen av fosfo-ERK og fosfo-p38 MAPK er blitt rapportert å være den molekylære bryteren for induksjon av tumorcelle uvirksom [39]. Signalering fra en ugunstig mikromiljøet eller celleoverflatereseptorer oppregulerer fosfor-p38 MAPK, og cellene deretter inn G1 /G0-fasen. I motsetning til dette nøkkel arrangement for induksjon av inaktive status i den nåværende arbeid var nedregulering av pakt, men ikke aktivering av p38 MAPK (figur 3A).
Blant de fem cellelinjer som ble undersøkt, kun ASPC-1-celler kunne angi den sovende status under forhold med kronisk hypoksi (figur 1 og S1). I motsetning til dette kunne alle tre primære kolorektal kreftceller undersøkt inngå i en sovende status i henhold til en kombinasjon av hypoksi og vekstfaktor uttømming (figur 5). Fordi kreft cellelinjer er valgt celler med en vekstfordel i oppdrett med høy oksygen, næring og vekstfaktorer, kanskje de har mistet evnen til å undertrykke spredning henhold forverret forhold. Dermed CTOs kunne gi en plattform for å undersøke dvalen av kreftceller. Selv om hvilende kreftceller ikke bidra direkte til tumorvekst, kan de være et reservoar og en kilde av tumorigene celler og chemoresistance. Mekanismen for Pakt downregulation henhold kronisk hypoksi kan være et mål for nye legemidler er utviklet for å overvinne terapeutisk motstand.
Materiale og metode
Etikk erklæringen
Klargjøring og kultur av primære kolorektal kreft fra pasienter ble godkjent av etikkomiteen, Osaka Medical Center for kreft og hjerte sykdommer (OMCCCD), og kirurgiske prøver ble innhentet etter skriftlig informert samtykke. Dyrestudier ble godkjent av OMCCCD Institutional Animal Care og bruk komité, og utført i samsvar med de institusjonelle retningslinjer.
Celler og cellekultur
En bukspyttkjertelkreft cellelinje, ASPC-1, ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). ASPC-1 ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum. Hypoksisk kultur ble oppnådd ved å inkubere cellene med 1% O
2 og 5% CO
2 i en Multigas Inkubator (ASTEC, Fukuoka Japan). Celler ble sådd ut i en tetthet på 1 x 10
5 celler pr 35 mm skål for telling av celletallet og 2,5 x 10
5 celler pr 60 mm skål for RT-PCR og Western blotting. Celleviabilitet ble vurdert av trypan blått fargestoff eksklusjon analysen eller propidiumjodid (PI) farging.
Primær kultur av tykktarmskreft
Klargjøring og kultur av primære kolorektal kreft celler ble utført ved hjelp av CTOs metode [28]. Kort, kirurgiske prøver eller xenografttumorer av NOD /SCID mus ble delvis fordøyd med Liberase DH (Roche, Mannheim, Tyskland) og filtrert gjennom celle siler. Fragmenter på 100 mikrometer eller 40-mikrometer celle sil (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) ble samlet og dyrket i StemPro hESC (GIBCO). For hypoksisk kultur, ble CTOs prøvene innebygd i BD Matrigel Matrix Growth Factor Redusert (GFR) (BD Biosciences, San Jose, California) og dyrket i StemPro hESC eller basal medium (DMEM F12 /Glutamax, 0,1 mM 2-mercaptoethanol, 2% storfe serum-albumin). For kjemosensitivitet analysen under den inaktive periode, CTOs prøvene ble for-dyrket i basalmedium under 1% O
2 betingelser i 7 dager, og deretter behandlet med 5-FU eller SN38. Etter 7 dager etter eksponering for disse stoffene, de CTOs prøvene ble gjen oksygen, og kulturmediet ble endret til frisk StemPro hESC.
Cell syklus analyse
ASPC-1 celler ble dyrket i de angitte tidsperioder og som er merket med 10 mM BrdU for den siste timen av hver behandling. Cellene ble farget med 5 ug /ml PI og anti-BrdU-antistoff (BD Pharmingen). Cellene ble analysert ved hjelp av en akustisk Attune Fokusering cytometer (Life Technologies, Carlsbad, CA).
Måling av glukose og laktat konsentrasjon
Glukosekonsentrasjonen i kulturmediet ble målt ved anvendelse Glukose Test 2 (Wako Pure Chemical, Osaka, Japan). Laktat ble målt ved anvendelse av F-Kit L-melkesyre (Roche, Darmstadt, Tyskland).
Måling av oksygenforbruk
Oppløst oksygen ble målt ved hjelp av en Clark-type oksygen-elektrode (Model 203 , Instech Laboratories).
