Abstract
5-Fluorouracil (5-FU) og dens pro-drug Capecitabine har vært mye brukt i behandling av tykktarmskreft. Imidlertid vil ikke alle pasienter responderer på stoffet, dermed er det et behov for å utvikle pålitelige tidlige prediktive biomarkører for 5-FU respons. Her rapporterer vi en roman potensielt funksjonell enkeltnukleotidpolymorfi (pfSNP) tilnærming for å identifisere SNPs som kan tjene som prediktive biomarkører av respons på 5-FU i kinesisk metastatisk kolorektal kreft (CRC) pasienter. 1547 pfSNPs og en variabelt antall tandem gjentagelse (VNTR) i 139 gener in 5-FU medikament (både PK og PD-veien) og kolorektal kreft sykdoms banene ble undersøkt i 2 grupper av CRC-pasienter. Krymping av levermetastaser målt ved RECIST kriterier ble anvendt som klinisk synspunkt ende. Fire non-responder-spesifikke pfSNPs ble funnet å utgjøre 37,5% av alle ikke-respondere (P 0,0003). Fem ekstra pfSNPs ble identifisert fra en multivariat modell (AUC etter ROC = 0,875) som ble brukt for alle andre pfSNPs, med unntak av ikke-responder-spesifikke pfSNPs. Disse pfSNPs, som kan skille de andre ikke-respondere fra respondere, hovedsakelig bor i tumorsuppressorgener eller gener involvert i kolorektal kreftrisiko. Derfor kan et totalt 9 nye SNPs med potensial funksjonell betydning kunne skille non-responders fra respondere til 5-FU. Disse pfSNPs kan være nyttige biomarkører for å forutsi respons på 5-FU
Citation. Wang J, Wang X, Zhao M, Choo SP, Ong SJ, Ong SYK, et al. (2014) Potensielt Funksjonelle SNPs (pfSNPs) som Novel Genomisk Prediktorer for 5-FU Response i metastatisk kolorektalcancer. PLoS ONE 9 (11): e111694. doi: 10,1371 /journal.pone.0111694
Redaktør: Anthony W I. Lo, Queen Mary Hospital, Hong Kong
mottatt: 22 juli 2014; Godkjent: 29 september 2014; Publisert: 05.11.2014
Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning (SERC 112 148 0008) fra Singapore biomedisinsk forskning Council – Science and Engineering Research Council (BMRC-SERC) til A /Professors Caroline Lee, Simon Ong, Yik Ying Teo og Samuel Chong. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Hvert år, mer enn én million mennesker over hele verden vil utvikle tykktarmskreft [1], sto for 10% av den globale kreftbyrden. Tykktarmskreft (CRC) er den hyppigst diagnostisert kreft i Singapore (7,909 nye tilfeller mellom 2005-2009) [2]. Mer enn halvparten av CRC pasientene utvikler metastatisk sykdom (stadium 4) enten ved diagnose eller tilbakefall etter innledende kurativ hensikt terapi. Dette betyr en betydelig andel av pasienter som trenger behandling for metastaser eller tilbakefall av tykktarmskreft.
5-fluorouracil (5-FU) og dens pro-drug, Capecitabine, er mye brukt i behandling av CRC. Det har blitt foreslått at det er to forskjellige moduser av handlingen for 5-FU. Først, den fungerer som anti-metabolitt der sin aktive form, FdUMP, produsert av tymidinfosforylase (TYMP), hemmer tymidylatsyntase (TYMS). Sekund, kan det indusere celledød, hvorved inkorporering av dens aktive produkter FUTP og FdUTP inn i RNA og DNA, henholdsvis, som fører til etterfølgende celle apoptose [3]. Uridinmonofosfat syntetase (umps, også kjent som OPRT) er ansvarlig for konvertering av 5-FU til FUMP, som er det første skrittet for å produsere FUTP og FdUTP. Imidlertid kan de to reaksjonsveier overlapper hverandre, fordi det mellomliggende produkt i «celletoksisitet» -veien, FUDP, kan også omdannes til FdUDP og deretter FdUMP og delta i «anti-metabolitt» -veien. 5-FU blir katabolisert inn i den inaktive form av DHFU ved Dihydropyrimidindehydrogenase (DPYD), og DPYD er det hastighetsbegrensende enzym i nedbrytning av 5-FU.
I dag finnes det ingen pålitelig tester for tidlig forutsigelse av respons på 5-FU. Utvikling av en pålitelig tidlig prediktiv biomarkør respons på vanlig kjemoterapi, som 5-FU, i metastatisk kolorektalcancer har potensial til å føre til riktig tilpasning av behandling for den enkelte pasient og bidra til å flytte oss nærmere en virkelig personlig omsorg. Totalt økonomiske kostnadene fordeler er realisert i begge spådd respondere og non-respondere. Reagert får riktig behandling med tillit av forventet respons. Forut non-respondere på konvensjonell behandling unngå bortkastet bekostning av 3 sykluser med fåfengt behandling, unødvendige toksisitet som selv krever rettsmidler og tidstap i form av nytteløs behandling og tap av et vindu av muligheter for effektiv behandling. Disse pasientene kan bli valgt som kandidater for nye behandlingsformer og kombinasjonskjemoterapi.
Så langt varianter bare i «5-FU PD» gener ble rapportert å være signifikant assosiert med 5-FU effekt målt ved tumor svinn i noen studier [4] – [7]. Dessverre forblir replikasjon av et slikt rapportert sammenheng mellom «5-FU PD» gen-varianter og tumorkrympning utfordrende [4], [6], [8] – [13], som tyder på mulig tilstedeværelse av andre loci for å bestemme 5-FU virkning .
Det var interessant å merke seg at de variantene i «5-FU PK» gener ble hovedsakelig undersøkt for deres tilknytning til 5-FU toksisitet, ikke effekt [14] – [17], til tross for uttrykket nivåer av disse genene er blitt tidligere assosiert med 5-FU effekt [18]. Begrenset innsats [8], [19] forsøkt å utforske mulig sammenheng for effekt, men mislyktes.
Videre har de fleste studier på responsen til 5-FU behandling fokusert primært på SNPs i noen kandidat gener. Bare én studie undersøkte 21 varianter hovedsakelig i kodende område av 11 gener involvert i metabolismen /action av 5-FU og andre relaterte farmakologiske trasé [19]. Men denne studien fortsatt ikke omfattende avhøre alle mulige varianter som kan være involvert i 5-FU respons.
En annen begrensning av aktuelle studier er at bare univariate analyser, så langt, vært ansatt og dette kan ikke ha tilstrekkelig kraft for påvisning av sammenslutning av narkotika respons med mindre vanlige /sjeldne SNPs med liten utvalgsstørrelse. Multivariate modellen ble vellykket ansatt for å beregne riktig dose av warfarin basert på kliniske og genetiske data [20].
Derfor, i denne studien, ansetter vi en ny tilnærming avhør potensielt funksjonelle SNPs (pfSNPs) i relevant stoff og sykdom vei å identifisere tilknytning til legemiddelrespons. 1,547 potensielt funksjonelle SNPs + 1 VNTR (Variable Number Tandem Repeat) fra 139 gener i stoffet (både PK og PD-veien) og sykdoms trasé ble undersøkt. Potensielt funksjonelle SNPs ble identifisert ved hjelp av pfSNP Web Resource (https://pfs.nus.edu.sg/) [21] som inkluderte SNPs som tidligere ble rapportert å være funksjonelle eller assosiert med sykdom /medikamentrespons; SNP som ble utledet til å være potensielt funksjonell fra genetiske fremgangsmåter så vel som de som er forutsagt å være potensielt funksjonell fra sekvensmotiver.
Ettersom antallet av samples er begrenset, en to-trinns studiedesign ble benyttet. I den første fasen, undersøkte vi 62 pasienter som var bare på kapecitabin, et pro-legemiddel av 5-FU, for å identifisere interessante SNP’er som er marginalt forbundet med legemiddelrespons som målt ved tumorkrympning. Disse SNPs ble deretter undersøkt i en annen gruppe på 27 pasienter som ble behandlet med 5-FU og oxaliplatin. Kombinert Multivariate og skjuling (CMC) analyse ble benyttet for å vurdere den mindre vanlige (≤5%), non-responder-spesifikke pfSNPs for deres tilknytning til 5-FU narkotika respons mens en logistisk regresjon basert multivariat modell ved hjelp av trinnvis Akaike Information Criterion (stepAIC ) prosedyre ble brukt til å avhøre de andre pfSNPs for deres tilknytning til 5-FU legemiddelrespons hos pasienter som ikke bære non-responder-spesifikke pfSNPs.
Materialer og metoder
Pasientprøver prøver~~POS=HEADCOMP og kliniske parametre
krymping av levermetastatisk CRC tumoren ble anvendt som den kliniske endepunkter for måling av behandlingseffekten. Response evalueringskriterier i solide svulster (RECIST) [22] brukes til å bestemme tumorrespons. I pasienter rekruttert, var det ingen pasienter som tilhører den kategorien «Complete Response». Pasienter med «Partial Response» ble ansett som «reagerer» og pasienter med «progressiv sykdom» eller «stabil sykdom» ble klassifisert som «ikke-respondere» i foreningen analyse.
I alt 89 urelaterte kinesisk metastatisk CRC pasienter ble rekruttert. Alle pasientene hadde levermetastaser, og ble gitt neo-adjuvant kjemoterapi før operasjon for leveren lesjon. Tabell 1 viser egenskapene til pasienter i hver studie.
I gruppe 1, 62 ubeslektede Stage IV CRC kinesiske pasienter ble rekruttert. Disse pasientene ble behandlet med kun Capecitabine og de har aldri tidligere blitt utsatt for dette stoffet. Av disse 62 pasienter, 13 hadde delvis respons, 31 hadde stabil sykdom, og 18 hadde progressiv sykdom. Derfor svarprosenten for denne pasientgruppen er bare ~21%, noe som er typisk for mono behandling [23]. ~79% Av pasientene var menn, og median alder av kullet var 60 år.
I gruppe 2, 27 ubeslektede kinesisk levermetastatisk CRC pasienter som ble behandlet med 5-FU (noen hadde Capecitabine) alene (noen) eller med oksaliplatin regime (de fleste) som sin neo-adjuvant kjemoterapi ble undersøkt. Noen av disse pasientene hadde også tidligere blitt utsatt for disse stoffene. Av disse 27 pasienter, 12 hadde delvis respons, syv hadde stabil sykdom, og åtte hadde progressiv sykdom. Derfor var svarprosenten ~45%, noe som er typisk for pasienter som gjennomgår to-drug kombinasjonsbehandling [24]. To tredjedeler av disse pasientene er menn, og hadde en median alder på 62 år
Etikk uttalelse
Denne studien er godkjent av Singhealth Sentralisert Institutional Review Board (CIRB) (referansenummer.: NC05-22 og 2005/421 /B).
Valg av potensielt funksjonelle SNPs (pfSNPs) for foreningen studie
pfSNP ressurs (https://pfs.nus.edu.sg/) [21] ble benyttet for å identifisere SNPs i gener assosiert med 5-FU /Capecitabine, oksaliplatin samt tykktarmskreft. Omtrent 2800 pfSNPs i 214 gener ble funnet å være assosiert med søkeord inkludert «fluoruracil», «5-FU», «capecitabin», «platina», «oxaliplatin» samt «kolorektal cancer». Som bare 1536 SNPs kan genotypede innenfor en enkelt tilpasset Golden Genotyping Array (Illumina, Inc), ble følgende kriterier benyttes for å velge et delsett av disse 2800 pfSNPs: alle SNPs innenfor promoter, koding, 5 «/3» un-oversatt regioner som har et Golden Score (GGS: mål på analysekvaliteten ved deres plattform) som er større enn 0,5 ble valgt. For de introner, pfSNP med GGS 0.7 ble valgt og monomorfe som rapportert i HapMap CHB befolkningen ble ekskludert, med unntak av de som tidligere er rapportert som funksjonell. For eventuelle tilstøtende SNPs som kan forstyrre hverandre i analysen, valgte vi SNP etter følgende rekkefølge: «Tidligere rapportert → Ikke-Synonymt → Synonymt → UTR → Intron». En liste over alle SNPs inkludert på Golden matrisen er tilgjengelig som tabell S1.
Blant de markører som var uegnet til å bli genotypede av Golden analysen, 14 viktige markører i 5-FU respons prediksjon ble valgt til å være genotypet av andre metoder (som er oppført i Tabell S2). De 14 markører omfatter de tidligere godt studert VNTR med innebygd SNP [25] samt 6bps 3 «UTR Indel i TYMS genet fordi Golden teknologien kunne bare genotype SNPs. Andre markører er SNPs med lave Golden score i TYMS, TYMP og DPYD gener. En tilpasset Sequenom sin MassARRAY panel ble brukt til å genotype 11 av de 14 markører og en SNP ble genotypet ved ABI TaqMan. I tillegg har vi utviklet en ny metode for å genotype den VNTR (rs2853542) og innebygd SNP (rs34743033) i TYMS genet. Dette VNTR kan ha enten 2 eller 3 gjentas, og den SNP kan forekomme i både den andre og tredje repeat [26]. Vi har utviklet en robust metode ved hjelp av Sanger-sekvensering for dette formål. Et fragment av 486 bp ble forsterket ved hjelp av primere (F- CTGCTGGCTTAGAGAAGGCG og R- AGCGGAGGATGTGTTGGATC) og fragment ble sekvensert i begge retninger ved hjelp av forover og bakover primere. Ulike genotyper vil gi tydelige mønstre på forover og bakover sekvense leser (Som vist i figur S1), slik at genotypen til å være lett utledes.
I sammendraget var det 1536 markører (oppført i tabell S1) genotypet med en enkelt tilpasset Illumina Golden SNP genotyping array, 11 (Oppført i tabell S2) ved Sequenom er MassARRAY, 1 (rs11479) av ABI TaqMan og VNTR (rs2853542), med den innebygde SNP (rs34743033) ble genotypet ved hjelp av Sanger-sekvensering.
fordelingen av SNP og gener som er valgt i de tre kategorier (CRC, fluorouracil og platina relatert) er vist i figur S2. Mer enn halvparten av SNPs (863) er fra fluorouracil relaterte gener og 702 SNPs er fra platina-relaterte gener. En betydelig del av SNP (656) er hentet fra CRC-relaterte gener, selv om 40% (32 av 80) av disse genene og 88% (579 av 656) av SNP er relatert til fluorouracil og /eller platina i tillegg .
antallet SNPs i hvert gen region og funksjon kategori omhandlet i denne studien er vist i figur S3. Hver av de fire genområder, nemlig promoter, koding, intron og 3 «UTR, er tilstrekkelig dekket generelt. For arrangøren og 3’UTR, de fleste av SNPs genotypede er de som endres TF bindingssteder. I kodende region, SNPs som endrer ESE /ESS områdene er de mest tallrike, og ikke-synonyme SNPs som forårsaker skadelige effekter er den nest mest tallrike. De intron regionen SNPs er beriket med de med en signatur av nyere positiv utvelgelse.
Fordelingen av SNP mindre allel frekvens for intronic versus ikke-intronic regionen er vist i tabell S3. For koding, 3’UTR, og promoter regioner, har en rekke SNPs ikke tidligere genotypet ved HapMap blitt genotypet i denne studien. Som studien tar sikte på å også utforske sjeldne varianter, ble en rekke SNPs rapportert av HapMap å være monomorfe også genotypet. For intron området, siden det meste av SNP er de med en signatur av nyere positiv utvelgelse, har de MAF mer enn 5%. Vi gjorde ikke genotype mange monomorfe seg innenfor introner.
Enkelt markør forening analyse
Hardy-Weinberg likevekt og mindre allelfrekvens ble analysert ved hjelp av Microsoft Excel-basert SNP Statistikk Kalkulator utviklet. Enkelt markør foreningen analyse ble utført ved hjelp av plink [27]. P-verdi ble beregnet ved permutasjon basert metode, og Odds Ratio (OR) og tilsvarende 95% konfidensintervall ble bestemt ved hjelp av vanlige allele-basert forening analyser, fordi permutasjon baserte metoden ikke gi slike opplysninger. Genotypen av VNTR (rs2853542) og innleiret SNP (rs34743033) i den TYMS genet er re-kodet som et bi-alleliske SNP omfattende høy-ekspresjon allel og den lave ekspresjon allelet ifølge Kawakami et al [26].
Kombinert Multivariate og skjuling (CMC) analyser for non-responder-spesifikke SNPs
Kombinert Multivariate og skjuling (CMC) metoden ble først foreslått som en metode for å analysere sjeldne SNPs [28]. CMC benytter Ling T
2 test for å analysere mer enn 2 grupper av sammenraste varianter. Når bare to grupper av slike varianter er analysert, kan Fishers eksakte test anvendes. I denne studien har vi brukt Fishers eksakte test for å vurdere om den kollapset mindre allel av ikke-responder spesifikke SNPs som er mindre vanlige (≤5% mindre allel frekvens) ville være en god indikator på responsen til 5-FU.
Logistisk regresjon basert multivariat modell ved hjelp Akaike Information Criterion (stepAIC) prosedyre for å forutsi legemiddelrespons hos pasienter som ikke har non-responder-spesifikke SNPs
pasienter som ikke har noen av de ikke-responder spesifikke SNPs, ble delt inn i 2 grupper. Data fra den første gruppen består 80% av pasientene ble brukt til å trene en logistisk regresjon basert multivariat modell ved hjelp av Akaike informasjons Criterion (AIC) i en trinnvis algoritme (ved hjelp av R-pakke «stepAIC»), mens data fra den andre 20% av pasientene som ble anvendt for å validere modellen. Den valgte modellen ble evaluert av arealet under kurven (AUC) av Receiver Operating Characteristic (ROC) kurver. Den optimale cut-off point for logistisk regresjon ble valgt hvor den maksimale summen av sensitivitet og spesifisitet er oppnådd [29], [30].
Diskusjon
En høy konkordans
Resultater og (R
2 = 0,9494) ble observert mellom allelfrekvenser av SNPs i vår undersøkelse og de fra CHB (kinesisk i Beijing) befolkningen i HapMap (Slipp 27) (figur S4) bekrefter kvaliteten på våre genotyping. En stor andel av SNP undersøkt i dette studiet var enten monomorf (36%) eller hadde en høy frekvens mindre allel (MAF≥0.1, 46%) (figur S5). Sytti-to og 66 SNPs i gruppe 1 og 2, henholdsvis, ble funnet å avvike betydelig fra Hardy-Weinberg likevekt og ble ekskludert fra videre analyse.
Genotype ble vellykket (97-100%) tildelt i 9. ut av 11 SNPs genotypede bruker Sequenom er MassARRAY. Sanger-sekvensering er tilordnet genotype av de 2 SNPs til alle prøvene samtidig TaqMan®-analysen er tilordnet genotyper til 96% av prøvene. Alle SNPs hell genotypede av disse metodene ble funnet å være i Hardy-Weinberg likevekt.
Enkelt SNP forening analyse identifisert tre ikke-responder spesifikke SNPs i umps genet som kan representere potensiell prediktiv biomarkør for non-respons 5-FU
Som antall prøver i denne studien var liten, var en kryssvalidering tilnærming ansatt der prøvene ble separert i 2 forskjellige grupper for oppdagelse og validering for å forbedre robustheten våre funn.
i alt 36 SNP i 12 gener ble funnet å være assosiert med medikamentrespons før multippel forsøks korreksjon i gruppe 1 pasienter (tabell 2). Som utvalgsstørrelsen var liten (n = 62), ingen av disse markørene var statistisk signifikant etter Bonferroni korreksjon.
Likevel var det 68 lavfrekvente pfSNPs i gruppe 1 som var unikt finnes bare i ikke -responders (ikke-responder-spesifikke pfSNP). For å vurdere om noen av disse ikke-responder-spesifikke pfSNPs kan representere potensiell prediktiv biomarkør for non-respons på 5-FU, undersøkte vi en annen gruppe på 27 pasienter. Av disse 68 ikke-responder-spesifikke pfSNPs, 24 forble ikke-responder-spesifikk selv i gruppe 2, og disse er vist i tabell 3. Det er imidlertid bare tre av de ikke-responder-spesifikke SNP’er i uridinmonofosfat syntetase (umps) genet, nemlig rs2291078 (E /4 /T1050A C350 *), rs3772809 (E /6 /A1336G H446Y) og rs3772810 (E6 /3UTR /A28G) (tabell 2, SNPs 42-44) (tabell 3, SNPs 1-3) ble funnet for å være statistisk signifikant (p = 0,036 før multippel forsøks korreksjon) i gruppe 2. Når de 2 grupper av pasienter ble kombinert og analysert, forble disse 3 SNPs statistisk signifikant (p = 0,032 før multippel forsøks korreksjon). Observasjonen at av totalt 89 pasienter i den kombinerte gruppe, ble det ikke respondere funnet å bære denne allelet tyder på at dette allel kan være en «årsaks» allel for bestemmelse av responsen til 5-FU. De ikke-statistisk signifikante data innhentet (etter flere test korreksjon) tyder på at dette ikke kan være den eneste «kausale» alleler for 5-FU respons og det er sannsynlig andre alleler som også spiller en rolle i 5-FU respons tyder på «locus heterogenitet «respons til 5-FU.
umps genet er viktig for å bestemme 5-FU respons, som konverterer 5-FU i den aktive metabolitten, FUMP, som kan delta både i celletoksisitet skoleveien så vel som i den «anti-metabolitt» -veien. I cellen toksisitet vei, kan FUMP bli ytterligere omdannet til FUTP og FdUTP som deretter inkorporert inn i RNA og DNA hhv. I «anti-metabolitt» bane, kan FUMP konverteres til FdUMP og hemmer TYMS.
Disse 3 alleler i umps genet er i perfekt koblingsulikevekt (LD) og dermed vil skje sammen hele tiden. Den anslåtte molekylære funksjoner av de tre alleler unike for de ikke-responders er alle forbundet med forstyrrelse av umps gen-funksjon og støtte deres unike tilstedeværelse i ikke-respondere (figur 1).
et allel av rs2291078 (umps E /4 /T1050A C350 *) ble spådd å skape et stoppkodon i exon 4 av umps mRNA. Umps mRNA som inneholder denne stoppkodon kan raskt degradert siden stoppkodon vises mer enn 50 bps fra siste ekson-exon krysset ville indusere non-sense mediert nedbrytning av mRNA [31]. Derfor kan pasienter som har denne A-allelet har lavere umps mRNA og protein overflod.
Samtidig forekomst av 3’UTR pfSNP rs3772810 (umps E6 /3UTR /A28G) med denne pfSNP rs2291078 antyder at uttrykket av dette genet kan bli ytterligere svekket. G-allelet av 3’UTR SNP rs3772810 (umps E6 /3UTR /A28G) er spådd å skape bindingssteder for miRNA 23a, 23b og 130a *. Den miRNA 23a er vist å være oppregulert etter hypoksisk tilstand som vanligvis finnes i svulster [32]. Spesielt, en fersk publikasjon rapporterte at miRNA 23a er oppregulert i metastatisk kolorektalcancer [33] tyder på at pasienter med G allel kan være ikke-responsive til 5-FU siden miRNA 23a kan undertrykke uttrykket av umps mRNA inneholder G-allelet .
også co-forekommende med disse 2 pfSNPs, er de ikke-synonyme pfSNP rs3772809 (umps E /6 /A1336G H446Y) som har potensial til å endre funksjonen til umps genet. Derfor disse 3 co-forekommende pfSNPs, som utgjorde 17,2% av alle ikke-respondere har potensial til å være årsaks variantene som påvirker funksjonen av umps og dermed respons til 5-FU selv om ytterligere forsøk er nødvendig for å validere potensialet funksjonalitet av disse pfSNPs.
Kombinert Multivariate og skjuling (CMC) analyser viste at et minimum av fire ikke-responder spesifikke pfSNPs som ikke er i sammenhengen likevekt i betydelig grad kan skille ikke-respondere fra respondere
satte å avgjøre om kombinasjon av ikke-responder spesifikke pfSNPs (tabell 3) kan utgjøre en større andel av 5-FU ikke-respondere enn de ovennevnte 3 non-responder spesifikke umps pfSNPs i perfekt LD som viser statistisk signifikans (før flere test korreksjoner ). Siden 3 non-responder spesifikke umps pfSNPs er i perfekt LD, bare én ble valgt for videre analyser. Vi deretter identifisere minimum antall ekstra non-responder spesifikke pfSNPs fra tabell 3 som kan forklare den høyeste prosentandelen av 5-FU ikke-respondere og ansatt Kombinert Multivariate og skjuling (CMC) analyser [28] for å fastslå statistisk signifikans.
Spesielt tre andre ikke-responder spesifikke pfSNPs sammen med noen av de umps non-responder spesifikke pfSNPs ble funnet å utgjøre 37,5% av alle ikke-respondere fra 2 grupper av pasienter (Tabell 4). CMC analyser avslørte statistisk signifikans (p = 0,0003) av disse fire ikke-responder spesifikke pfSNPs (3 ikke umps pluss ett av de 3 umps pfSNPs) antyder signifikant sammenheng av disse pfSNPs med ikke-respons.
SNP rs3218592 fører til en ikke-konservativ aminosyre forandring i REV3L genet som koder for den katalytiske subenhet av DNA-polymerase Zeta. DNA Polymerase Zeta ble rapportert å være signifikant nedregulert i human kolorektal kreft [34] og er foreslått å være en tumor suppressor [35]. T allel av rs3218592 (E /26 /C8285T, R2762Q) som er unikt funnet i ikke-responder i vårt studium er antatt å være skadelig for proteinet funksjon av både Polyphen [36] og sile [37]. Vi dermed hypotese at pasientene bærer denne skadelige allelet ville ha mer aggressiv sykdom og dermed er mer sannsynlig å være ikke-respondere på behandling.
pfSNP (rs8071253) bor i promoter regionen TK1 og er spådd å skape en xenobiotisk-stress aktivert TGA1a transkripsjon bindingssetet.
den tredje SNP (rs501415) ligger innenfor den første intron av WDR7 og er spådd å forstyrre AML1 (RUNX) transkripsjonsfaktor binder området. Siden hele RUNX familien dele den samme bindingssetet (TGT /cGGT) [19], postulerer vi at denne SNP kan også påvirke binding av RUNX3. RUNX3 hadde blitt hyllet som en tumor suppressor gen og redusert uttrykk for RUNX3 har tidligere vært forbundet med dårligere overlevelse i pasienter med kolorektal kreft [38]. Likevel rolle WDR7 i 5-FU motstand forble uklart. Det ble rapportert å være assosiert med 5-FU ved PharmGKB [39] men publikasjonen [39] ble nylig trukket tilbake [40].
Den logistisk regresjon baserte multivariat modell identifisert ytterligere 5 pfSNPs som ikke er non -responder spesifikke som kan skille respondere fra ikke-respondere
i tillegg til de ikke-responder spesifikke pfSNPs som er knyttet til pasienter som ikke responderer på 5-FU, fortsatte vi å identifisere ytterligere pfSNPs som kan være assosiert med 5-FU narkotika respons ved å trene en logistisk regresjon basert multivariat modell med stepAIC metoden ved hjelp av data fra de andre pfSNPs. Den multivariate modellen identifisert ytterligere 5 pfSNPs, nemlig rs2289310 (DLG5, E /23 /G4442T, P1481Q), rs1047840 (EXO1, E /12 /G1765A, E589K), rs17431184 (PTEN, I /7 /T-400C), rs2236722 (CYP19A1, E /2 /A115G, W39R) og rs17160359 (ABCB1, 5UR //G-4254T) (tabell 5) som kan skille respondere fra ikke-respondere. AUC (areal under kurve) for ROC (Receiver Operating Characteristic) kurve av disse fem SNPs er 0.875 (figur 2). En forutsagte verdi på 0,794 ble identifisert som den optimale skjæringspunktet for å forutsi legemiddelrespons, med sensitivitet på 62,5% og spesifisitet på 100%. Med denne terskelen, kan den logisbaserte multivariatmodell korrekt identifisere 39,1% (25/64) av ikke-respondere. Sammen med 37,5% av ikke-respondere spådd av de ikke-responder-spesifikke SNPs, kan en total på 76,6% (49/64) av ikke-respondere korrekt identifisert ved begge modellene.
AUC for ROC-kurven er 0.875. Poenget med maksimale summen av sensitivitet og spesifisitet er markert med grønn sirkel på ROC-kurven. Det tilsvarende sensitivitet og spesifisitet er 62,5% og 100% henholdsvis.
Det er bemerkelsesverdig at den SNP i multivariatmodell er primært lokalisert innenfor tumorsuppressorgen (PTEN) eller i gener som er hovedsakelig knyttet til kolorektal kreft (DLG5, EXO1, CYP19A1 og ABCB1) (tabell 5). Spesielt, en av de ikke-responder-spesifikke SNP (rs3218592, REV3L E /26 /C8285T, R2762Q) (tabell 4) befinner seg på den genet, Rev3L, har også blitt implisert å være et tumorsuppressorgen [41].
PTEN (fosfatase og tensin homolog) genet er et velkjent tumor suppressor gen som nylig ble rapportert å kontrollere DNA-reparasjon og følsomhet for gentoksisk spenning [42]. Jo høyere frekvensen til den C-allel i respondere (26% i de respondere versus 12% i det ikke-respondere) antyder at pasienter med denne allel kan oppvise lavere toleranse for å genotoksiske stress forårsaket av DNA-ødeleggende midler som 5-FU.
DLG5 (Disks stor homolog 5) genet koder for et medlem av membranen-assosiert guanylate kinase (Maguk) familie av stillas proteiner som er involvert i å opprettholde den epiteliale integritet [43]. T allel av rs2289310 (DLG5, E /23 /G4442T, P1481Q) forårsaker en ikke-konservert aminosyre forandring i nærheten av en av de PDZ domenene i dette genet (aa 1391-1472; Prosite ballen 13,531). Denne varianten ble postulert å svekke stillas funksjonene DLG5 [44] og forbedre den stramme junction-mediert gut permeabilitet [45]. Dette polymorfisme har også blitt assosiert med øket risiko for inflammatorisk tarmsykdom [45], som kan føre til økt risiko for kolorektal kreft [46]. Siden ble rapportert forbedret tarm gjennomtrengelighet til å føre til høyere 5-FU absorpsjon i rotter [47], hypoteser vi at T-allelet ville føre til bedre medikament absorpsjonen og således bedre respons. I samsvar med vår hypotese, flere utøvere har T-allelet (MAF på 34% i responder vs 17% i ikke-responder) i denne studien.
EXO1 (eksonuklease 1) genet har vært innblandet å spille roller i DNA replikasjon, rekombinasjon, reparasjon, telomere integritet [48] samt skade signaliserer beslutninger [49]. A-allelet av rs1047840 (EXO1, E /12 /G1765A eller E /13 /G1765A, E589K) forårsaker en ikke-konservert aminosyre forandring og er spådd å ligge innenfor et område som er svært konservert blant XP-G /RAD2 DNA reparasjon Endonuklease Familie (HMMPanther PTHR11081). I Kin-kohorten analyser, har A-allelet er forbundet med høyere risiko for tykktarmskreft i en britisk befolkning [50]. Denne SNP har også vært forbundet med høyere risiko for flere andre kreftformer i den kinesiske befolkningen [51] – [57]. Vi hypotese at den økte kreftrisikoen knyttet til denne SNP kan skyldes mindre effektiv reparasjon av DNA-skader hos personer som bærer A-allelet. Som metabolittene av 5-FU blir inkorporert i DNA-ødeleggende verts DNA, kan de ineffektive reparasjonsmekanismene av individer som bærer A-allel av dette SNP gi større celledød dermed øke effektiviteten av 5-FU-behandling. Dette er i tråd med våre observasjoner at større andel av respondere bærer A-allelet av SNP sammenlignet med ikke-respondere (30% versus 16%).
CYP19A1 (cytokrom P450, familie 19, underfamilien A, polypeptid 1) eller Aromatase er et medlem av cytokrom P450-superfamilien av enzymer og spiller en viktig rolle i metabolismen av østrogener. Østrogen har vært forbundet med lavere risiko for tykktarmskreft [58] – [60]. Selv om flere SNP’er i CYP19A1 genet hadde blitt rapportert å være assosiert med risiko for kolorektal kreft i en kaukasiske befolkning [61], SNP rs2236722 (E /2 /A115G eller E /3 /A115G, W39R) ble ikke undersøkt i denne studie som det er monomorfe i HapMap CEU befolkningen. Ikke desto mindre er dette SNP (rs2236722), som oppstår ved en frekvens på 3,3% i HapMap CHB populasjonen og 9,5% i vårt studium, bevirker en ikke-konservert aminosyre forandring fra hydrofob tryptofan til belastet arginin i CYP_P450 familien domene, og er forutsagt av Polyphen [36] for å være en skadelig forandring. Derfor er det mulig at dette er skadelig endring i CYP19A1 kan føre til lavere østrogennivå fører til høyere kolorektal kreftrisiko.
