Abstract
Cancer-testikkel (CT) gener blir uttrykt i forskjellige krefttyper, men ikke i andre tilfeller enn i celler av kimlinje normale vev. Selv om DNA demetylering av promoter-proksimale CPGs av CT-gener er knyttet til deres uttrykk i kreft, mekanismene som fører til demetylering er ukjent. For å belyse slike mekanismer vi valgte å studere Caco-2 tykktarmskreft cellelinje i løpet av sin spontane differensiering
in vitro
, som vi fant CT gener, spesielt
side2, -2b
og
Spanx-B
, for å være oppregulert i løpet av denne prosessen. Differensiering av disse cellene resulterte i en mesenchymale-til-epitelial overgang (MET) som gjenspeiles av forsterkningen av epiteliale markører CDX2, claudin-4 og E-cadherin, og et samtidig tap av mesenchymale markører vimentin, Fibronectin-1 og Transgelin. Side 2 og SPAN-X oppregulering ble ledsaget av en økning i Ti-eleven trans-2 (TET2) ekspresjon og cytosin 5-hydroksymetylering samt dissosiasjon av heterochromatin protein 1 og polycomb undertrykkende komplekset 2-proteinet EZH2 fra promoter-proksimale regioner av disse genene. Tilbakeføring av differensiering resulterte i nedregulering av
side2, -2b Hotell og
Spanx-B
, og induksjon av epitel-til-mesenchymale overgang (EMT) markører, demonstrere dynamikken i CT genregulering i denne modellen
Citation. Yilmaz-Ozcan S, Sade A, Kucukkaraduman B, Kaygusuz Y, Senses KM, Banerjee S, et al. (2014) epigenetiske mekanismene bak Dynamisk Expression of Cancer-testikkel Genes,
side2
,
-2b Hotell og
Spanx-B
under Mesenchymale til epithelial Transition. PLoS ONE ni (9): e107905. doi: 10,1371 /journal.pone.0107905
Redaktør: Keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA
mottatt: May 17, 2014; Godkjent: 22 august 2014; Publisert: 17.09.2014
Copyright: © 2014 Yilmaz-Ozcan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av bevilgning nr. 112S023 fra den vitenskapelige og teknologiske Forskningsrådet Tyrkia (TUBITAK) til AOG, en Young Investigator Award fra Den tyrkiske Academy of Sciences i SB, og ved TUBITAK-BIDEP stipend til SYO og BK. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Cancer-testikkel (CT) eller kreft-kimlinje-genene blir uttrykt i tumorer med opprinnelse fra forskjellige vev, så vel som i normale germline og trophoblast celler, men er generelt stille i andre normale vev i voksen [1] – [3]. Mer enn 100 ulike CT-gener kan grupperes etter homologi inn i familier [2]. Til tross for mangel på sekvenslikhet mellom CT-gener fra forskjellige familier, og re-ekspresjon av alle CT-gener i tumorer blitt forbundet med demetylering av CpG-rester i deres promotor-proksimale soner [4]. Denne delte mekanisme uttrykk regulering er sannsynligvis grunnen til deres koordinere ekspresjon in cancer [5] – [7]. Men den nøyaktige mekanisme ved hvilken DNA-demetylering opptrer ved CT-genpromoteren-proksimale regioner i kreftformer er ukjent. CT-gener viser for det meste en heterogen uttrykksmønster i tumorer [8] – [10]; i motsetning til deres ekspresjon i testikkel, som er avgrenset og velordnet [11]. En studie der stilk-like og ikke-stammen som celler av brystkreft ble selektivt drept, viste at CT genuttrykk er generelt en funksjon av mer differensierte, ikke-stamceller [12]. Tilsvarende, i melanom, en undergruppe av celler med flere epitelceller har hurtig CT-gener, når cellene med mesenchymale egenskaper ikke [13]. Interessant, kan melanomaceller veksle mellom disse to klassene
in vivo
, noe som tyder på at tumor heterogenitet, som definert av CT-genekspresjon, kan representere en overgangsfase i likhet med bryteren mellom epitelceller og mesenkymale fenotyper. Faktisk er mesenchymale-til-epitelial overgang (MET) assosiert med induksjon av CT-genekspresjon [14]. Slik definerer mekanismene som er involvert i regulering CT genuttrykk i kreft og i løpet av MET, valgte vi å studere Caco-2 spontan differensiering modell som viser trekk ved MET og EMT under differensiering og de-differensiering, henholdsvis. Våre data indikerer at den dynamiske regulering av de to CT-gener,
PAGE Hotell og
Spanx-B
i denne modellen systemet, innebærer endringer av polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2) og heterochromatin protein 1 ( HP1) belegg innenfor sine promoter-proksimale regioner, med samstemmige endringer i TET uttrykk og cytosin hydroksymetylering (HMC) nivåer.
Metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP, induksjon av differensiering og de-differensiering
Caco-2 cellelinje ble hentet fra SAP Enstitusu (Ankara, Tyrkia). HCT116 (kolorektal) og Mahlavu (hepatocellulær) kreftcellelinjer ble hentet fra LGC Standards, Middlesex, Storbritannia. En lungekreft cellelinje (SK-LC-17) var fra Memorial Sloan Kettering Cancer Center, NY, USA. Caco-2-celler ble dyrket i EMEM og andre i RPMI, supplert med 20% FBS, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 1,5 g /l natriumbikarbonat og 1 mM natriumpyruvat. Alle cellekulturmedier og kosttilskudd ble kjøpt fra Biochrom AG, Berlin, Tyskland. Den første dagen cellene nådd konfluens ble betegnet dag 0. Celler dyrket i parallelle kulturer ble brukt for å bestemme fenotypiske forandringer på dagene 0, 5, 10, 20 og 30, post-konfluens. Ytterligere tiltak for differensiering av celler som er benyttet i denne undersøkelsen er rapportert andre steder [15]. Å indusere dedifferentiation ble cellene på den 20. dagen av differensiering frittliggende og replated på ca 50% samløpet og RNA og protein ble høstet 5 dager etter replating.
I silico
analyse av CT og EMT genekspresjon
Expression data i GSE1614 [16] var GC-RMA normalisert ved hjelp GeneSpring v. 11.0. CT genekspresjon ble analysert basert på 31 probesets i tilsvarende 23 CT gener fra 7 familier (Figur S2). En tolkning ble generert med en enhet liste bestående av EMT relaterte gener som definert av Loboda et al. [17], ved tre forskjellige tidspunkter. Gener for validering ble valgt blant dem for hvilke signifikante forskjeller uttrykks (p 0,05) ble observert av en vei ANOVA test og Bonferroni FWER korreksjon, når prolifererende celler ble sammenlignet med de på dag 15.
Kvantitativ RT PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp av Trizol reagens (Ambion, Foster City, CA, USA) og behandlet med DNAse i (Ambion, Foster City, CA, USA). 200 ng av RNA ble revers transkribert ved hjelp Revert-Aid første tråd cDNA syntese kit (Thermo Fisher Scientific, Boston, MA, USA). PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av en ABI 7500 termosykler (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Alle reaksjoner ble utført i henhold til produsentens anbefalinger. TaqMan Gene Expression Analyser (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) ble brukt for følgende: GAPDH (4352934E), Spanx-B (Hs02387419_gH), side2 og -2b (Hs03805505_mH), GAGE (Hs00275620_m1), SSX4 (Hs023441531_m1), NY-ESO-1 (Hs00265824_m1), og MAGE-A3 (Hs00366532_m1). SYBR Grønn mester mix med ROX henvisning fargestoff (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) ble benyttet for å bestemme
CDH1, CDX2, CLDN4, VIM, FN1 Hotell og
TAGLN
uttrykk (tabell S1) . Sykkelforholdene for disse analysene var 50 ° C i 2 min., 95 ° C i 10 min., Etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 15 sek., 60-65 ° C i 1 min. Relativ ekspresjon ble beregnet ved ΔΔCt metoden [18]. Alle prøvene ble analysert in triplo og alle forsøk ble gjentatt minst to ganger.
Promoter metylering analyse
Genomisk DNA ble isolert ved hjelp av proteinase K-behandling, etter en fenol-kloroform-ekstraksjon protokollen. Bisulfitt behandling av 200 ng genomisk DNA ble utført ved hjelp Zymo DNA Metylering Gold Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Bisulfitt modifiserte DNA ble lagret ved -20 ° C og anvendt for PCR i løpet av 2 måneder. To runder med DNA-amplifikasjon ble utført ved hjelp av en Taq Hot Start-DNA polymerase (New England Bioscience /NEB, Ipswich, MA, USA) med en Perkin Elmer 9700 termosykler (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Primere anvendt er gitt i tabell S1. PCR-produktene ble ekstrahert gel ved hjelp av QIAGEN gel utvinning kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og klonet inn i pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Plasmid DNA ble renset ved hjelp av QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) fra minst ti kloner og sekvensen analysert av IONTEK (Istanbul, Tyrkia).
5-hydroksymetyl cytosin analyse
Caco-2 genomisk DNA (gDNA) ble skåret av probe ultralydbehandling (30 sek. på, 30 sek. av, 5 sykluser) for å oppnå 200-600 bp. fragmenter bedømt ved 1% agarosegel elektroforetisk analyse. Immunpresipitasjon ble utført ved hjelp av hMEDIP kit (Abcam, Cambridge, UK) i henhold til produsentens instruksjoner. 5 pg av kontroll-DNA ble tilsatt til 500 ng av gDNA til bruk som en intern kontroll. Positive og negative kontroller i settet ble inkludert i alle forsøk. 2 ul fra det eluerte DNA ble anvendt som templat for kvantitativ RT-PCR ved bruk av 2 x SYBR grønn konsentrat-blandingen med ROX henvisning fargestoff (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) med primerne som er gitt i tabell S1 og S2. Primer effektivitet ble kontrollert. Sykkelbetingelsene var 50 ° C i 2 min., 95 ° C i 10 min. etterfulgt av 40 sykluser ved 94 ° C i 15 sek., 60 ° C i 1 min. Felles genomisk DNA ble inkludert i kvantitativ RT-PCR for å beregne% innspill.
immunfluorescens mikros
Celler festet til glassplater ved sentrifugering ved hjelp av Shandon CytoSpin3 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ble øyeblikkelig fiksert i 2% formaldehyd /PBS ved romtemperatur i 15 min. Fikserte celler ble permeabilisert i 0,2% Triton X-PBS i 10 min. etterfulgt av blokkering med 1% BSA i 0,1% PBS-Tween i 1 time. Inkubasjoner med det primære antistoff, fortynnet til 1:50, ble utført over natten ved 4 ° C. Sekundært antistoff ble tilsatt ved 1:200, etter vasking i 0,1% PBS-Tween i 5 minutter. til 3 ganger, og inkubert med cellene i 45 minutter. ved romtemperatur (se tabell S3 for den komplette antistofflisten). Stained prøver ble montert med montering medium (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) som inneholder DAPI løsning. Cellelinjer som benyttes som positive kontroller var Mahlavu (PAGE-2, -2b og SPANXB), MDA-MB 231 (VIM), MCF-7 (TAGLN) og SW620 (CDX2, FN1). Negative kontroller var kombinasjoner av primære antistoffer med un-relaterte sekundære antistoffer. Alle bildene ble oppnådd ved hjelp av en AxioCam MRC5 bildeopptaksenheten (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland).
Western analyse
Cellelysater (ekstrahert med RIPA buffer) separert på 4-12% Novex Bis tris SDS-geler (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ble overført til Immobilon-PSQ membraner (Millipore Corp. Bedford, MA, USA) med en Invitrogen western blotting system (Invitrogen. Carlsbad, CA, USA). Etter blokkering med 5% tørrmelk i 0,02% PBS-T, ble blottene inkubert med primært antistoff over natten ved 4 ° C. Primære antistoffer fortynninger var 1:1000 for CDX2, fibronektin, vimentin og transgelin, 1:2500 for β-aktin og 1:100 for Spanx-B og PAGE-2, -2b antistoffer. HRP-konjugert sekundært antistoff (Abcam, Cambridge, UK) ble anvendt ved en 1:5000 fortynning og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Signaler ble påvist ved hjelp av ECL luminescens analysen (BioRad, Hercules, CA, USA).
Chromatin Immunpresipitasjon
Chromatin Immunpresipitasjon (chip) ble utført som tidligere beskrevet [15]. Kort sagt ble formaldehyd-tverrbundne cellebestanddeler utfelt ved proten A sepharosekuler koblet til antistoffer mot EZH2, HP-1 eller H3K27m3 (Abcam, Cambridge, UK), samt isotype-spesifikk kontroll. Utfelt DNA ble forsterket ved hjelp av primere spesifikke for
side2
,
-2
eller
Spanx-B
promotersekvenser (tabell S1 og S2), etter de-kryssbinding.
Resultater
CT genuttrykk under Caco-2 spontan differensiering (Caco-2 SD)
udifferensiert tykktarmskreft cellelinje Caco-2 gjennomgår enterocytic differensiering ved oppnådd samløpet
in vitro product: [19], [20]. Gradvis differensiering har blitt observert i opptil 30 dager post-konfluens som vist ved oppregulering av forskjellige differensierings-assosierte gener inkludert sukraseisomaltase-, alkalisk fosfatase og carcinoembryogenic antigen (CEA), (fig S1) [15]. En
i silico
analyse av CT genuttrykk som definert av 31 probesets i GSE1614 datasettet, som inneholder genuttrykk data for Caco-2 SD modell innhentet under differensiering (prolifererende (2
nd dag), post-spredning-udifferensiert (8
th dag), og post-spredning differensiert (15
th dag)) [16], avslørte beskjeden oppregulering av nesten alle CT gener under differensiering (figur S2). Vi valgte å bekrefte endringen i uttrykket av seks CT gen /gener familier ved kvantitativ RT-PCR i differensierende Caco-2 celler
in vitro
.
GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1 Hotell og
SSX4
transkripsjoner var umulig å oppdage på den første dagen i samløpet, så vel som på senere tidspunkter (data ikke vist). Men betydelig oppregulering av
side2 product: (
2 og 2B
), og
Spanx-B
gener var tydelig (figur 1).
relativ mRNA uttrykk for CT gener (
side2
,
-2b Hotell og
SPANXB
) (A), epitelceller gener (
E-cadherin (CDH1)
,
claudin 4 (CLDN4)
,
CDX2
) (B), og mesenchymale gener (
fibronektin 1 (fn1), vimentin (VIM)
,
transgelin (TAGLN)
) (C) som bestemmes av kvantitativ PCR på dager 0, 10, 20 og 30 etter samløpet. Data representerer gjennomsnittet av to eksperimenter. Endring i uttrykket nivåer for alle gener mellom dag 0 og 30 er statistisk signifikant (P 0,0001, etter toveis ANOVA med Tukey sin post hoc test)
side2 Hotell og
Spanx-B
uttrykk følg MET i Caco-2 SD modell
Spontan differensiering av Caco-2
in vitro
har blitt rapportert å resultere i MET [21], [22 ]. For å finne ut om dette skjedde i parallell til oppregulering av
side2 Hotell og
Spanx-B
, analyserte vi GSE1614 datasettet for uttrykket av gener som representerer EMT i tykk- og endetarmskreft [17], og valgt 6 gener som skal godkjennes i vår modell. Analyse av mRNA og protein uttrykk av disse viste en nedgang i mesenkymale gener (
vimentin, fibronektin 1 Hotell og
transgelin
) med en samtidig økning i uttrykket av epitel gener (
CDX2, claudin -4 Hotell og
E-cadherin
) som cellene differensiert, viser at økningen i CT genekspresjon skjer samtidig med MET i denne modellen (Figur 1 . Figur S3)
side2, Spanx-B og EMT genuttrykk
in situ
for å undersøke om endringene i protein uttrykk for CT og EMT gener skjedde samtidig i de samme cellene, utførte vi dobbelt immunfluorescens farging under Differensiering. En gradvis tap av mesenchymale markører ble observert som celler differensiert, med en samtidig økning i epitelceller gener og CT gener. Spanx-B og PAGE-2 var ofte co-uttrykkes med epithelial markør CDX2 i de samme cellene, men nesten aldri med VIM eller FN1 (figur 2, 3 og figur S4, S5, S6, S7).
immunofluorescent farging av differensierende Caco-2 celler med DAPI kontra avslører en gradvis økning i kjernefysisk Spanx-B (grønn) med en samtidig reduksjon i cytoplasma vimentin uttrykk (rød); (20 x forstørrelse) (A). Mindre enn 1% av Spanx-B-positive celler viste farging for vimentin på dag 0 (B).
Immunofluorescent farging av differensierende Caco-2 celler med DAPI kontra avslører overlapp Spanx-B (Alexa Fluor 488 : grønn) og CDX2 (Alexa Fluor 568: rød) uttrykk; (20 x forstørrelse) (A). Mer enn 60 til 80% av cellene viser dobbel-merking når analysert kvantitativt (B).
side2 og Spanx-B uttrykk korrelerer med økt HMC og 1011 trans metylcytosin dioxygenase (TET) opp -regulation
uttrykk av alle CT gener studert så langt inkludert
side2 Hotell og
Spanx-B
har vært forbundet med demetylering av CpG rester innenfor regioner proksimalt for transkripsjon start nettstedet [1], [2], [23] – [26]. I denne linjen, både
side2 Hotell og
Spanx-B
kan være oppregulert med 5-aza 2′-deoxycytidine behandling (figur S8). Men bisulfite sekvensering av promoter-proksimale regioner av begge
side2 Hotell og
Spanx-B
viste ingen forskjeller på ulike stadier av Caco-2 SD (figur 4). Som bisulfite sekvensering er ute av stand til å skille metyl cytosin (MC) fra HMC, vi spurte om endringen i CT genekspresjon kan være relatert til endrede HMC /MC-forhold innenfor sine arrangører. Faktisk kromatin immunpresipitering (chip) med en HMC spesifikt antistoff viste en økning i HMC under differensiering i både
side2 Hotell og
Spanx-B2
arrangører (figur 5). Vi neste spørsmål om økningen i HMC var relatert til en økning i TET1, -2, -3 og uttrykk som disse proteinene er ansvarlig for konvertering av mC til HMC [27], [28]. Faktisk, økningen i HMC av
side2 Hotell og
Spanx-B2
arrangører var korrelert med en oppregulering av
TET2
mRNA uttrykk, sammen med beskjedne økninger i
TET1 Hotell og
3 plakater (Figur 6A). Double immunfluorescens farging viste at flertallet av celler som uttrykker side2 eller Spanx-B var positive for TET2 farging; indikerer disse to tilfellene forekom i de samme celler (figur 7). Det er derfor sannsynlig at økningen i TET2 ekspresjon fører til økt HMC i disse genene. Interessant nok var bare en lav molekylvekt translasjonsprodukt (~ 25 kD) av TET2 økt i de differensierende celler, når det ble ikke observert noen klar forskjell i nivåene av full-lengde TET2 protein (figur 6B 0,001, 0,02 og 0,001 for EZH2; 0.003, 0,001, og 0,0001 for H3K27m3; og 0.001, 0,001, og. 0,001, for HP1, henholdsvis
side2 Hotell og
Spanx-B
oppregulering reverseres i løpet av EMT
Vi antok at dersom epigenetiske forandringer liggende CT genuttrykk skjedde parallelt med MET, at denne prosessen kan reverseres dersom cellene angitt EMT. For å teste denne hypotesen, ble differensierte Caco-2 celler frittliggende og lov til å spre seg i 5 dager. Dette resulterte i sin hurtig de-differensiering som vist ved nedregulering av SI. De differensierte celler nedregulert
side2 Hotell og
Spanx-B
, samt
CDX
, som de oppregulert
TAGLN
, i linje med løpende EMT (figur 9). Selv transkripsjon av alle tre
TET
gener redusert i løpet av de-differensiering (figur 9), gjorde vi ikke observere en nedgang i HMC i denne perioden (data ikke vist). Vi har derfor konkludere med at oppregulering av CT genekspresjon er reversibel i denne modellen.
De-differensiering indusert av vekst under ikke-konfluente angitte forhold ved redusert
sukrose isomaltase plakater (SI ) mRNA nivåer (A), fører til nedregulering av
CDX2
,
side2, -2b Hotell og
Spanx-B
, med samtidig oppregulering av
TGLN product: (B).
TET1 Hotell og
-2
mRNA er også nedregulert i løpet av de-differensiering (C).
Diskusjoner
Tidligere studier viste at CT-genekspresjon korrelert med en epitelial snarere enn en mesenchymale fenotype, og viste oppregulering av CT-gener i løpet av MTT [12], [14]. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten som beskriver endringer i flere epigenetiske mekanismer innenfor arrangører av to CT gener under MET-lignende differensiering konkordant med en dynamisk endring i genuttrykk. Som bisulfite sekvensering av
side2 Hotell og
Spanx-B
arrangører viste ingen endring på differensiering, må den økte HMC strengt involvere denaturert CpG rester. Dette er i samsvar med det faktum at TET enzymer er ansvarlige for omdannelsen av 5-metyl-cytosin i 5-hydroksymetyl cytosin [27], [28]. Omdannelse av HMC til mC er en langt mer komplisert prosess, og kan ikke skje med tilsvarende kinetikk [32], [33]. Dette er trolig grunnen til at vi ikke observere en endring i HMC løpet av fem dagers de-differensiering prosessen Caco-2 celler til tross for en nedgang observert i globale TET nivåer. Våre funn at
side2
,
Spanx-B Hotell og
TET2
induksjon er reversibel er lik en annen studie i embryonale stamceller hvor Vitamin C er vist å indusere TET2 uttrykk, som i sin tur resulterte i opp-regulering av CT-gener. Begge hendelsene var reversible ved Vitamin C tilbaketrekking [34].
Selv om hydroksymetylering innen gen-arrangører har blitt rapportert å avta i løpet av differensiering av normale celler, en fersk undersøkelse viste at ca 20% av alle endrede cytosines i de fleste CT-gener i human hjerne, hvor de ikke er uttrykt, bestå av HMC [35]. Oppregulering av ekspresjon i TET2 kreft har vært forbundet med MET [36], [37]; og derfor en mer differensiert tilstand [30]. I likhet med den inverse sammenhengen mellom EZH2 og CT /TET2 uttrykk vi rapporterer her, andre har vist EZH2 og TET enzymer for å undertrykke og indusere differensiering av nevrale forløpere henholdsvis [38]. CT gener er oppregulert i løpet av den innledende fasen av utviklingen i det menneskelige embryo, men avta etter hvert som vev differensiere ytterligere [39]. Som voksen tykktarm vev ikke viser page2 eller Spanx-B ekspresjon (data ikke vist), hadde Caco-2-cellene evnen til å differensiere ytterligere, kan begge gener er blitt nedregulert fullstendig. På den annen side, det faktum at vi ikke kunne påvise oppregulering av
GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1
eller
SSX4
uttrykk i denne modellen kan være fordi disse genene uttrykkes ved tidligere stadier av differensiering. Vi tror at dette fordi Spanx-B ekspresjon er først og fremst i post-meiotisk celler i testis (dvs. spermatocytter, spermatider, eller sperm), mens GAGE, MAGE-A3, NY-ESO-1 eller SSX ekspresjon er først og fremst i spermatogoniene [11] .
Våre data og som av flere andre «indikerer at kreftceller som uttrykker CT gener har mer av en epitelial snarere enn en mesenchymale fenotype. Vi foreslår at CT gener
side2 Hotell og
Spanx-B
blir indusert i løpet av et vindu av differensiering som korrelerer med oppregulering av epiteliale markører for differensiering. Den Caco-2 SD modellen har gjort det mulig å observere den aktivt skiftende epigenetisk landskapet innenfor promoterene fra disse CT-gener. Men som CT genuttrykk i svulster har nært blitt knyttet til metylering tilstanden deres promoter, prosessen som fører til CT-genet induksjon i
n vivo
kan til slutt resultere i «feste» av epigenetisk stat som ville i sin tur resultere i CpG metylering. Likevel, via dynamisk MET i tumorer [40], er det tenkelig at selv dette kan endre seg i løpet av sykdommen.
Fra et klinisk perspektiv, data fra vår lab samt fra andre avslører at sub- gruppering av svulster basert på genuttrykk profiler kan identifisere celler med forskjellige chemo-følsomhet profiler [12], [41], [42]. I denne linjen, spår vi fremtidige studier vil avdekke distinkte narkotikafølsomhets profiler for kolorektal kreft subtyper som muligens er definert av
side2 Hotell og
Spanx-B
uttrykk, der Caco-2 SD-modellen kunne brukes.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Post-samløpet differensiering av Caco-2
in vitro
. Oppregulering av
sukraseisomaltase-product: (A), og karsinoembryonisk antigen (CEA) (B) i celler oppsamlet ved angitte dager etter confluence (DPC) som bestemt ved kvantitativ RT-PCR, og Western-analyse, respektivt . Alkalisk fosfatase-ekspresjon er også oppregulert som bestemt ved immunohistokjemi avsløre differensiering (C). Andre mål på differensiering av cellene som er benyttet i denne undersøkelsen har vært rapportert tidligere (ref. 17). * P 0,001 (ANOVA med Tukey sin post hoc test)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0107905.s001 plakater (docx)
Figur S2.
oppregulering av CT genuttrykk under Caco-2 spontan differensiering
in vitro
. Heat kart basert på 31 probesets i GSE1614 tilsvarer 23 CT gener fra 7 familier. I forhold til prolifererende celler, genekspresjon øker trinnvis inn på samløpet (8
th dag) og videre i perioden etter samløpet differensiering (15
th dag)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0107905. S002 product: (docx)
Figur S3.
Western analyse av forskjellig uttrykt gener under Caco-2 SD. En gradvis økning av Spanx-B og CDX2 parallelt til en nedgang i uttrykk for FN, VIM og TGLN opp til dag 30 etter samløpet. Resultater fra 3 uavhengige differensiering eksperimentene er vist
doi:. 10,1371 /journal.pone.0107905.s003 plakater (docx)
Figur S4.
Spanx-B og Fibronektin uttrykk viser begrenset overlapping i differensierende Caco-2 celler. Immunofluorescent farging av differensierende Caco-2 celler med DAPI kontra avslører en gradvis økning i kjernefysisk Spanx-B (Alexa Fluor 488: grønn) med en samtidig reduksjon i cytoplasma fibronektin uttrykk (Alexa Fluor 568: rød); (20 x forstørrelse) (A). Mindre enn 10% av cellene uttrykker Spanx-B farget for fibronektin på dag 0 (B)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0107905.s004 plakater (docx)
Figur S5.
Side2, -2b og vimentin uttrykk er gjensidig utelukkende i differensierende Caco-2 celler. Immunofluorescent farging av differensierende Caco-2 celler med DAPI kontra avslører en gradvis økning i kjernefysiske side2, -2b (Alexa Fluor 488: grønn) med en samtidig reduksjon i cytoplasma vimentin uttrykk (Alexa Fluor 568: rød); (20 x forstørrelse) (A). Mindre enn 10% av cellene viste dobbelt fluorescens når farging ble analysert kvantitativt ved dag 0. Ved senere tidspunkter, ingen av cellene viste dobbelt farging (B)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0107905.s005
(DOCX)
Figur S6.
Side2, -2b og fibronektin uttrykk er gjensidig utelukkende i differensierende Caco-2 celler. Immunofluorescent farging av differensierende Caco-2 celler med DAPI kontra avslører en gradvis økning i kjernefysiske side2, -2b (Alexa Fluor 488: grønn) med en samtidig reduksjon i cytoplasma fibronektin uttrykk (Alexa Fluor 568: rød); (20 x forstørrelse) (A). Mindre enn 15% av cellene viste dobbelt fluorescens når farging ble analysert kvantitativt ved dag 0 (B)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0107905.s006 plakater (docx)
Figur S7.
Nuclear samlokalisering av CDX2 og side2, -2b i differensierende Caco-2 celler. Immunofluorescent farging av differensierende Caco-2 celler med DAPI kontra avslører overlapp side2. -2b (Alexa Fluor 488: grønn) og CDX2 (Alexa Fluor 568: rød) uttrykk;
