Abstract
Adenoviral genterapi og oncolysis ville kritisk nytte av målrettet celle oppføring av genmodifiserte kapsider. Dette krever både ablasjon av innfødte adenovirus tropisme og identifisering av ligander som forblir funksjonelle i virus sammenheng. Her etablerer vi celletype-spesifikk inngang av HAdV-5-baserte vektorer ved genetisk ligand innføring i et kimært fiber med aksel og knott domener av den korte HAdV-41 fiber (Ad5T /41sSK). Dette fiber formatet ble rapportert å ablate transduksjon
in vitro Hotell og biodistribusjon til leveren
in vivo
. Vi viser at den YSA peptid, binding til det pan-kreftmarkør EphA2, kan settes inn i tre stillinger av det kimære fiber, noe som resulterer i sterk transduksjon av EphA2-positiv, men ikke EphA2-negative celler av humane melanom biopsier og av tumorxenografter etter intratumoral injeksjon. Transduksjon ble blokkert av løselig YSA peptid og restaurert for EphA2-negative celler etter rekombinant EphA2 uttrykk. Den YSA peptid kan også settes inn i tre posisjoner av en bil binding-ablasjon HAdV-fem fiber muliggjør spesifikk transduksjon; imidlertid Ad5T /41sSK formatet var overlegen
in vivo
. I konklusjonen, etablerer vi et adenovirus hovedkapsidproteinet tilrettelegge funksjonell innsetting av målretting peptider og en roman adenovirus med svulst markør EphA2 som reseptoren med høyt potensial for kreft genterapi og viral oncolysis
Citation. Behr M, Kaufmann JK, Ketzer P, Engelhardt S, Mück-Häusl M, Okun PM, et al. (2014) adenovirus Bruke Cancer Marker EphA2 som en reseptor in vitro og in vivo ved Genetisk Ligand Innsetting i ulike kapsid Stillas. PLoS ONE 9 (4): e95723. doi: 10,1371 /journal.pone.0095723
Redaktør: Ilya Ulasov, Swedish Medical Center, USA
mottatt: 03.12.2013; Godkjent: 30 mars 2014; Publisert: 23 april 2014
Copyright: © 2014 Behr et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Helmholtz-universitetet Young Investigator Gruppe tilskuddet VH NG 212 og Deutsche Krebshilfe (tysk Cancer Aid) gir 10-7946. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
rekombinant adenovirus (ADS) er i preklinisk og klinisk utvikling som onkolytiske agenter og vektorer for vaksinering og genterapi [1], [2] .uch Ad-baserte legemidler kan betydelig nytte eller til og stole på en celletype-spesifikk virkningsmekanismen for å begrense bivirkningene, og samtidig beholde terapeutisk potens. Celletype-spesifisitet av Ad-baserte vektorer og oncolytics har blitt godt etablert på post-entry level av transkripsjonen målretting og mikroRNA regulering [3], [4] .I kontrast, målretting av Ad celleinnskrift, som bedre ville unngå bivirkninger og virus beslaglegging, er fortsatt en utfordring. Genetiske strategier for Ad oppføring rettet mot lette enkel produksjon klinisk Karakter (ingen kjemiske endringer eller separate adaptere er nødvendig) og sørge for at avkom onkolytiske Annonser produsert i pasientenes svulster beholde de forbedrede egenskaper. Imidlertid er strategier for genetisk oppføring målretting av annonser hemmet av den stive Ad capsidstruktur, manglende evne til antistoffmolekyler, som foretrukne rettet mot deler, til å kaste ordentlig etter fusjon til cytosolically uttrykt Ad kapsidproteiner, og det komplekse samspillet av vertsfaktorer moduler annonse celle inngang hos pasienter (se nedenfor)
Basis målretting av annonser krever to trinn:. ablasjon av naturlig tropisme for friske celler og re-målretting av en reseptor spesifikt uttrykt på målceller ved innsetning av et tilsvarende ligand inn i det Ad kapsid. Cell oppføring av innfødte annonser er initiert av bindingen av kapsid protein fiber til vedlegget reseptoren, som er Coxsackie-Ad reseptor (CAR) for den mest brukte serotype HAdV-5 [5] .Virus intern deretter utløst ved binding av Penton base for å mobilinte [6] .For terapeutiske anvendelser av annonser ikke ment å målrette levervev, er leveren de målretting av sentral betydning for å unngå toksiske bivirkninger. Men ablating CAR binding av mutere fiber ikke redusere leveroverføring etter systemisk virus injeksjon [7] .Additional sletting av inte binding av mutere den Penton basen resulterte i redusert lever transduksjon i noen, men ikke alle studier [7] .Moreover, Penton basis mutasjoner kan virke mot sin hensikt i sammenheng med Ad målretting, som virus oppføring og post-oppføring trinn av re-målrettet virus kan bli svekket [8] .Liver transduksjon av HAdV-5, uavhengig av deres interaksjon med CAR og inte, ble tilskrevet til blod koagulasjonsfaktorer bundet til hekson og fiber [9] – [11] .Som reseptoren formidler transduksjon av hepatocytter ved HAdV-5
in vivo
fortsatt blir diskutert [12], [13]
.
Vår tilnærming for oppføring målretting av HAdV-5-avledet virus er å erstatte fiber aksel og knott domener med tilsvarende domener av HAdV-41 kort fiber (Ad5T /41sSK) og å sette peptid ligander i denne kimære kapsid. HAdV-41 binder CAR via en andre lang fiber, mens ingen celle-bindende aktivitet er blitt tilskrevet den korte fiber. Tilsvarende sterkt redusert transduksjon
in vitro Hotell og lever transduksjon
in vivo
har blitt demonstrert av flere grupper for HAdV-5-baserte vektorer som inneholder korte fibre av HAdV-41 eller på nært beslektet HAdV -40 [14] – [19] .Vi har tidligere vist at smittsomhet av annonser med kimære Ad5T /41sSK fiber (så kalt F5 /41s) kan gjenopprettes ved genetisk peptidligand innsetting ved hjelp av integrin bindingen RGD4C-peptid som en modell peptid [14] .I faktum, identifiserte vi flere funksjonelle innstikk, og dermed etablere det kimære Ad5T /41sSK fiber som en fleksibel fiber stillas for liganden innsetting: HI og EG løkker på siden av knotten og for IJ løkke på toppen , noe som resulterer i overlegen transduksjon effektivitet sammenlignet med C-terminal fusjoner. Men som integriner er allestedsnærværende uttrykt, den RGD4C peptidet var ikke egnet for å demonstrere potensialet for Ad5T /41sSK format for celletype-spesifikk celleinntrengning og transduksjon. Derfor er målet med denne studien var å etablere celleinnskrift målretting av Ad5T /41sSK strategi ved hjelp av en celle-selektiv peptid ligand og å sammenligne denne strategien med en HAdV-fem fiberbasert målretting tilnærming.
YSA peptid, et 12-mer identifisert av fagfremvisning, binder seg selektivt til reseptor-tyrosinkinase EphA2, men ikke til relaterte kinaser [20] .Vi fokusert vår forskning på dette peptid ligand fordi i motsetning til flere andre testede peptider det tilbakeholdte celle- bindingsaktivitet i sammenheng med Ad fiber. Viktigere er EphA2 får stadig større oppmerksomhet som mål for cancerterapi fordi det er (i) oppregulert på de fleste faste tumorer og på tumor endotel, (ii) bedre tilgjengelige til tumorer som ofte mangler celle-assosierte ligander, (iii) er funksjonelt forbundet med tumor progresjon, og (iv) ble nylig rapportert å være en kreftstamcelle markør [21], [22] .Several EphA2 målrettede terapeutiske metoder har vist proof of concept in pre-kliniske studier, inkludert kinase hemmere, antistoffer, immuntoksiner, utviklet T-celler, løselige reseptorer, og vaksiner [22] – [24].
Her har vi undersøkt Ad oppføring målretting
in vitro Hotell og
in vivo
av genetisk sette inn EphA2 bindende YSA peptid i ulike reseptor-blind Ad fiber stillaser. Nærmere bestemt, vi utforsket nettsteder for funksjonell YSA peptid innsetting i knotten domener av den korte HAdV-41 fiber og av HAdV-fem fiber. I tillegg til virusproduksjon ved kombinerte fiber transfeksjon /virus superinfeksjon som vi har gjort før [14], vi undersøkt direkte konstruksjon av fiber gener i virusgenomer, noe som er fordelaktig eller nødvendig for å lette virus produksjon og for viral oncolysis hhv . Selektivitet og effektivitet av Ad celleinntrengning mediert av YSA peptidet ble undersøkt i cellekultur, humane metastaser biopsier, og dyre xenograft-modeller som sammenligner tre fiber formater: (i) det kimære Ad5T /41sSK fiber, (ii) en lang shafted kimære fiber inneholder HAdV-fem fiber hale og aksel domener og korte HAdV-41 fiber knott, og (iii) en lang-shafted men CAR-bindende ablated HAdV-fem fiber.
Resultater
spesifikk transduksjon av EphA2-positive celler ved Annonser med YSA peptid satt inn kimære fiber inneholder knotten av HAdV-41 kort fiber
Vi undersøkte oppføring målretting av annonser ved genetisk innsetting av en målretting peptid inn kimære fibre med HAdV -41 knott som en de-målrettet stillaset. For å oppnå dette, innføres vi den 12-mer EphA2 bindende peptid YSA [20] flankert av korte forbindelsesledd inn i HI, IJ eller EG løkker av denne knott domene. For å utforske relevansen av skaftet lengde på YSA-mediert Ad transduksjon, kombinert vi disse YSA holdig knotter med kort HAdV-41 fiber aksel (Ad5T /41sSK virus, Fig. 1A) eller lang HAdV-fem fiber aksel (Ad5TS /41sK virus, fig. 1B). I et tredje sett av fibre, innlemmet vi en lang HAdV-5 fiber aksel med en mutert heparin-sulfat proteoglykaner (HSPG) -binding motiv (Ad5TS * /41sK virus, Fig. 1C). Denne mutasjonen ble rapportert å gi forbedret de målretting [17], [25], [26] .Etter plasmid transfeksjon, alle konstruksjonene ble uttrykt og besatt trimeriseringskapasitet, men trimerisering var klart mindre effektiv på lang shafted konstruksjoner, særlig de inneholdende peptidet i HI sløyfe (fig. 2A). Ved hjelp av en kombinert transfeksjon /super protokollen (se Materialer og metoder), var vi i stand til å produsere høy titer pseudotyped LacZ reporter Ad vektorer med alle fiber formater. Innlemmelse av fiber molekyler i viruspartikler var effektiv på kort shafted fiber og, til tross for redusert trimeriseringskapasitet, for de lange shafted IJ-Ysa fibre (Fig. 2B). Lange-shafted EG-YSA og HI-fibere YSA viste redusert eller manglet fiber inkorporering i viruspartikler, respektivt.
(A) Short-shafted chimeriske fibere med HAdV-5 hale smeltet til akselen og knott av den HAdV-41 kort fiber. (B, C) med lange shafted chimeriske fibre inneholdende HAdV-5 hale og villtype (B) eller mutant (C) skaft fusjonert til HAdV-41 kortfiber knott. (D) CAR binding-ablated HAdV-5 fibre. Ysa peptid innstikk indikeres med sløyfer. Innsetting av linkersekvensen i forskjellige posisjoner av HAdV-5 fiber knott IJ sløyfe medført tap av trimeriseringskapasitet (data ikke vist), og virus ble ikke produsert for denne innføringsstedet.
(A) immunoblot av ukokte cellelysater etter transient transfeksjon av fiber uttrykk plasmider inn 293T celler. (B) Immunoblot av rensede viruspartikler pseudotyped LacZ rapportørvirus generert av transfeksjon /super protokollen. (C) Transduksjon av EphA2-positive og EphA2-negative celler med pseudotyped LacZ reporter virus. SK-MEL-28-celler ble transdusert inn quadruplicates, ble alle andre cellelinjer transdusert i triplikater. Kolonner og feilstolper viser middelverdier og standardavvik til β-Gal-aktivitet, respektivt. RLU, relative luminescens enheter; * P 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001 versus 5T41sSK i de respektive cellelinje
Deretter analyserte vi EphA2 uttrykk i et panel av kreft i bukspyttkjertelen celler, melanomceller , endotelceller, og en levercellelinje. Vi oppdaget sterk EphA2 uttrykk for kreft i bukspyttkjertelen celler, endotelceller, og for fire av seks melanom cellekulturer (fig. S1). EphA2 ble ikke påvist for de to melanoma cellelinjer SK-MEL-28 og Mel624 og levercellelinje HepG2. Transduksjon eksperimenter med EphA2-positive cellelinjer Panc-1, MIA PACA-2, CAPAN-en (kreft i bukspyttkjertelen) og C8161 (melanom) ga resultater som var lik for de respektive cellelinjer: Alle tre virus pseudotyped med kort shafted YSA fibrene viste transduksjon, som var vesentlig sterkere enn for kontrollvirus uten YSA peptid (figur 2C,. 10-fold til 35-ganger økning i β-Gal-aktivitet). For virus med umodifisert HAdV-fem aksel, innsetting av YSA inn i HI, IJ og EG sløyfer viste svak, sterk og mellom transduksjon effektivitet, henholdsvis. Den lenge shafted IJ-YSA viruset var enda bedre enn de korte shafted virus (p 0,05 for alle cellelinjer.). For alle virus med det muterte lange akselen, observerte vi ineffektiv transduksjon (vist i PANC-1 og C8161-celler). I EphA2-negative SK-MEL-28-celler, den EG-YSA virus og spesielt den IJ-YSA virus med umodifisert lang aksel viste transduksjon signifikant høyere enn kontrollvirus. Vi konkluderer med at korte shafted Ad5T /41sSK virus med YSA peptid satt inn i EG, HI eller IJ sløyfe selektivt transduce EphA2-positive tumorceller, mens de lange shafted Ad5TS /41sK-IJ-YSA virus viste enda sterkere, men mindre selektiv transduksjon .
Deretter undersøkte vi hvordan transduksjon effektiviteten av pseudotyped Ysa virus sammen med virus som inneholder den etablerte, intebindende RGD peptid i svulsten og endotelceller. De fleste tidligere studier på genetisk peptid ligand innsetting brukt RGD-holdige peptider og demonstrerte forbedret, men ikke målrettet celle oppføring [27] – [29] .Indeed, HAdV-5 virus med RGD peptid i HI sløyfe blir undersøkt i kliniske studier, på grunn av deres forbedrede celleinntrengning effektivitet [30] .vi funnet at i sammenheng med den Ad5T /41sSK kimære fiber YSA peptid-mediert transduksjon av EphA2-positive celler var tilsvarende eller sågar bedre enn transduksjon formidlet ved RGD4C peptidet satt inn i HI løkke (fig. 3A og B), den mest effektive innføringsstedet for dette peptid [14] .I EphA2-negative SK-MEL-28-celler, bare den RGD-virus førte til transduksjon vesentlig høyere enn kontrollen viruset uten peptid. Endelig kan vi vise at transduksjon av EphA2-positive celler ved Ad5T /41sSK-HI-YSA og Ad5T /41sSK-IJ-YSA men ikke Ad5T /41sSK-HI-RGD effektivt blokkert av løselig YSA peptid, mens en kontroll peptid med randomisert rekkefølge blokkere ikke transduksjon (fig. 3B). Samlet viser disse resultatene potent YSA-mediert transduksjon spesifikt av EphA2-positive celler ved Ads med YSA peptid satt inn i kimære Ad5T /41sSK fiber.
(A) Transduksjon av EphA2-positive og EphA2-negative celler etter pseudotyped Ad vektorer som inneholder kort shafted kimære fibre med genetisk innsetting av YSA peptid i forhold til matching vektorer med genetisk innsetting av RGD4C peptid. Celler ble omformet i quadruplicates. (B) Transduksjon av EphA2-positive PANC-1 celler etter konkurranse med løselig YSA peptid eller med kontroll peptid av randomisert rekkefølge. Celler ble transduced med pseudotyped annonser i tre paralleller. Kolonner og feilstolper viser middelverdier og standardavvik til β-Gal-aktivitet, respektivt. RLU, relative luminescens enheter; *
/# p 0,05, **
/## p 0,01 *** p. 0,001 versus 5T /41sSK (*) eller 5T /41sSK-HI-RGD (
#)
spesifikk transduksjon av EphA2-positive celler ved Annonser med YSA peptid satt inn i CAR binding-ablated HAdV-fem fiber
for spesifikke applikasjoner, for eksempel de som krever tumor-spesifikke genoverføring, men ikke lever de-targeting (se omtale), Annonser med en HAdV-5-basert fiber kan være tilstrekkelig eller fordelaktig sammenlignet med mer omfattende modifiserte kimære fiber inneholder virus. Av denne grunn, og å sammenligne vår kimære fiber format med de innfødte en undersøkte vi som innstikkmulig genetisk inkorporering av YSA peptid inn i bilen binding-ablated HAdV-fem fiber knott KO1 (S408E og P409A mutasjoner, Ref [31], fig. 1D). Vi fant at YSA peptidet kan settes inn i CD, EF og HI løkker av fiberholdetrimeriseringskapasitet (noe mindre effektiv for CD-loop) og inkorporering evne inn i viruspartikler som genereres av transfeksjon /super protokollen (fig. 4A og B). Vi har også undersøkt den IJ sløyfen som en mulig posisjon for peptid-ligand innsetting med tanke på gunstig plassering på toppen av knotten domene. Imidlertid observerte vi tap av fiber trimerisering etter å ha satt inn en linker i stillinger G560 /H561 eller I564 /N565 (ikke vist). Pseudotyped Annonser med YSA peptid satt inn i EG, HI eller CD løkken på KO1 knott mediert effektiv transduksjon av EphA2-positive celler, som var åtte ganger til 230 ganger bedre enn kontrollgruppen viruset Ad5KO1 uten peptid innsetting (fig. 4C ). Den Ad5KO-HI-YSA virus var mer effektive enn de Ad5KO-EG-Ysa og Ad5KO-CD-Ysa virus i alle cellelinjene som ble testet, samt overlegen Ad5T /41sSK-EG-YSA. Videre Ad5KO-HI-YSA virus viste tilsvarende eller overlegen transduksjon effektivitet sammenlignet med den Ad5WT virus, inneholdende vill-type HAdV-5 fiber. I EphA2-negative celler, ingen av virus med YSA peptid som føres inn i KO1 fiber øker transduksjon effektivitet sammenlignet med foreldrevirus (fig. 4C), som viser en mangel på off-target transduksjon. I konklusjonen, transduksjon effektiviteten av annonser med YSA peptid innsetting i HAdV-fem fiber avhenger av innstikkstedet med HI innsetting viser best transduksjon effektivitet og spesifisitet.
(A) Immun av ukokte cellelysater etter transient transfeksjon av fiber uttrykk plasmider inn 293T celler. (B) Immun av rensede viruspartikler pseudotyped LacZ reporter virus. (C) Transduksjon av EphA2-positive og EphA2-negative celler med pseudotyped LacZ reporter virus. Celler ble transdusert inn quadruplicates, søyler og feilstolper viser middelverdier og standardavvik til β-Gal-aktivitet, respektivt. RLU, relative luminescens enheter; *
/# p 0,05, **
/## p 0,01, ***
/### p 0,001 versus 5T /41sSK (*) eller 5KO1 (
#) .
EphA2-mediert transduksjon av svulsten og endotelceller av genomisk fiber endret annonsene
neste utviklet EphA2 målrettet virus med modifiserte fibre kodet av deres genom snarere enn pseudotyped etter transfeksjon . Genomisk modifiserte virus vil forenkle fremstillingsprosedyrer og legge til rette for storskala produksjon av virus. Dessuten er genomisk fiber innsetting nødvendig i sammenheng med virus oncolysis. Det er imidlertid ikke klart hvordan genomisk fiber erstatning påvirker produksjonen av infeksiøse virus. Faktisk, en tidligere studie rapporterte vekstdefekter og /eller defekte partikler for annonse vektorer med mors fiber genet erstattet av et gen som koder hele kort HAdV-41 fiber med peptid innsett [32] .Using BAC recombineering teknologi, klonet vi seks genomer av første generasjon GFP /Luc reporter virus. I tre genomer den HAdV-5 fiber ble erstattet med en YSA-inneholdende fiber som representerer hver av de fiberformater (Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5TS /41sK-IJ-YSA og Ad5KO1-HI-YSA). De tre andre genomer representert kontroll virus Ad5T /41sSK, Ad5wt, og Ad5KO1. Alle virus kan fremstilles ved høy titer og viste effektiv inkorporering fiber (Fig. 5A). Resultater av transduksjon eksperimenter med disse genmodifiserte virus reproduseres de som oppnås med pseudotyped virus produsert av transfeksjon /super protokollen, som viser at genomisk fiber innsetting var vellykket (Fig 5B-D.): I EphA2-positive kreft i bukspyttkjertelen celler, melanomceller og endotelceller celler, vi igjen observert en dramatisk økning i effektivitet for transduksjon YSA-inneholdende virus sammenlignet med reseptor-blind kontrollvirus (15-fold til 236-fold). Innsetting av YSA peptid inn i KO1 fiber resulterte i den høyeste økningen i transduksjon effektivitet. IJ-YSA fiber kimære virus med lang aksel var igjen noe sterkere enn den tilsvarende virus med en kort skaft. Av notatet, YSA virus resulterte i sterkere transduksjon, selv sammenlignet med virusinneholdende villtype HAdV-5 fiber i EphA2-positive celler. Dette var tilfellet ikke bare for celler svakt transduced med virus som inneholder HAdV-fem fiber, dvs. C8161 celler (36 ganger til 220 ganger), men også i EphA2- og CAR-positive [33], [34] celler MIA PACA-2, PANC-en og HUVEC. I EphA2-negative SK-MEL-28 og HepG2-celler, Ad5T /41sSK-IJ-YSA og Ad5KO1-HI-YSA viste ingen signifikant økning i transduksjon effektivitet sammenlignet med de respektive kontroller uten peptid innsetting, mens Ad5TS /41sK-IJ-YSA igjen viste noe økt transduksjon. Visualisering av GFP uttrykk bekreftet at Annonser med YSA peptid resulterte i transduksjon av betydelig økte prosenter av EphA2-positive celler sammenlignet med kontroll virus uten peptid og også sammenlignet med Ad5wt (fig. S2). I EphA2-negative celler, transduksjon effektivitet som bestemmes av dette GFP-basert lese ut var sterkt redusert for Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5KO1-HI-YSA, Ad5T /41sSK og Ad5KO1 i forhold til Ad5wt, men mindre så for Ad5TS /41sK-IJ-YSA. Disse resultatene bekrefter at Ad5T /41sSK-IJ-Ysa og Ad5KO1-HI-Ysa virus har det beste oppføring målretting kapasitet for EphA2-positive celler. Av notatet, transduksjon av SK-MEL-28-celler ved Ysa virus, men ikke av kontroll virus uten peptid innsetting kan gjenopprettes ved overekspresjon av rekombinant EphA2 (Fig. 6, fig. S3), som viser at EphA2 medierer celle oppføring av YSA peptid som inneholder virus.
(A) Immun av rensede viruspartikler generert av genomisk innsetting av rekombinante fibre. (B-D) Transduksjon av EphA2-positive cancerceller (B), EphA2-negative celler (C) og EphA2-positive endotelceller (D) med genomisk fiber modifisert Luc /GFP reporter virus. C8161-celler ble transdusert i tre paralleller, ble alle andre cellelinjer transdusert i quadruplicates. Kolonner og feilSøylene viser gjennomsnittsverdier og standardavvik av Luc uttrykk, henholdsvis. RLU, relative luminescens enheter; *
/# p 0,05, **
/## p 0,01, ***
/### p 0,001 versus 5T /41sSK (*) eller 5KO1 (
#) .
SK-MEL-28 celler transfektert med EphA2 uttrykk plasmid (pcDNA-EphA2) eller kontroll plasmid (pcDNA) ble omformet med genomisk fiber modifisert Luc /GFP reporter virus. Celler ble omformet i quadruplicates, søyler og feilSøylene viser gjennomsnittsverdier og standardavvik av Luc uttrykk, henholdsvis. RLU, relative luminescens enheter; ** P 0,01, *** p 0,001 for angitte sammenligninger. For påvisning av EphA2 ekspresjon av transfekterte celler se fig. S3.
YSA peptid-mediert adenovirus transduksjon av kreft i bukspyttkjertelen og melanom xenografter
in vivo
Produksjon av høye titer preparater av genomisk kapsidbindende modifiserte virus tillatt oss å utføre dyreforsøk for å utforske YSA peptid-mediert adenovirus transduksjon
in vivo
. For å oppnå dette har vi brukt NOD-SCID-mus med subkutane xenograft tumorer PANC-1 kreft i bukspyttkjertelen celler eller C8161 melanomceller. EphA2 uttrykk
in vivo
ble bekreftet i både tumormodeller (Fig. S4). I et første forsøk, injisert vi dyr som bærer PANC-en eller C8161 svulster intratumorally (i.t.) med Ad5T /41sSK-IJ-YSA eller Ad5T /41sSK (Fig. 7A). I begge tumormodeller vi har observert betydelig sterkere transduksjon med Ad5T /41sSK-IJ-YSA (2,9 ganger for PANC-1 og 5,9 ganger for C8161), viser at YSA-peptid-mediert transduksjon er funksjonell
in vivo
. I et annet eksperiment injiserte vi C8161 svulster i.t. med YSA-inneholder annonser som representerer hver av fiber formater (Ad5T /41sSK-IJ-YSA, Ad5TS /41sK-IJ-YSA og Ad5KO1-HI-YSA) eller med (Fig. 7B) kontroll virus. Økt transduksjon for Ad5T /41sSK-IJ-YSA versus Ad5T /41sSK ble bekreftet. Ad5TS /41sK-IJ-YSA viste noe høyere transduksjon enn Ad5T /41sSK-IJ-YSA. Disse resultatene er i samsvar med de
in vitro
transduksjon resultater. Men i motsetning til
in vitro
data Ad5KO1 viste lignende transduksjon effektivitet enn Ad5wt etter i.t. injeksjon i C8161 xenografter avslørende tap av de målretting. Følgelig er økningen i transduksjon av YSA peptid innsetting var mindre (1,6 ganger), men nådde signifikans. Derfor de- og re-targeting av annonser for spesifikk inngang via EphA2 etter i.t. injeksjon
in vivo
var best gjennomført med Ad5T /41sSK fiber format. Samlet er disse resultatene viser at peptid-mediert oppføring rettet mot bruk av Ad5T /41sSK fiber formatet er funksjonell
in vivo
etter i.t. virus injeksjon.
(A, B) 2 × 10
10 vp av genomisk fiber-modifisert, EphA2 målrettede Luc /GFP reporter og kontroll virus ble injisert intratumorally i NOD-SCID mus som bærer tumorxenotransplantater ( n = 6 til 9 svulster per gruppe). Luciferase reporter-gen-ekspresjon i tumorer ble kvantifisert 3 dager etter virus injeksjon. Kolonner og feilSøylene viser gjennomsnittsverdier og standardavvik, henholdsvis. RLU, relative luminescence enheter. * P 0,05 versus 5T /41sSK,
# p 0,05 og
### p. 0,001 versus 5KO1
YSA peptid-mediert adenovirus transduksjon i biopsier av humane melanommetastaser
Vi neste undersøkt om EphA2 målrettede annonser resultere i økt transduksjon ikke bare i monolagstumorcellekulturer og tumorcelletransplantater, men også i ferskt biopsied svulst materiale fra pasienter. Disse representerer klinisk mer relevante substrater med hensyn til tumorcellefysiologi og tilstedeværelse av tumor mikromiljøet. Biopsi av melanom metastaser ble skåret inn i levende vev skiver umiddelbart etter operasjonen og ble senere omformet med genomisk kapsidbindende modifisert, YSA holdige annonser som representerer hver av fiber formater eller med kontroll virus. EphA2 uttrykk ble påvist i levende vev skiver av alle biopsier hentet fra 5 pasienter. Men uttrykket variert mellom pasientene og var svakere enn for monolagkulturer (Fig. S5a). Dette var ventet som biopsier inneholder en blanding av celler, hvorav bare en brøkdel er tumorceller. Vi har observert sterkest transduksjon effektivitet som bestemt ved GFP uttrykk for virus med YSA peptid og for kontrollvirus med naturlig HAdV-5 fiber, som bekrefter YSA peptid-mediert transduksjon (fig. S5b). Som GFP signaler i 2D-fotografier ikke kvantitativt representerer transduksjon effektivitet, delvis på grunn av den rynkete form av sektorene etter 3 dagers kultur, kvantifisert vi luciferase-ekspresjon av disse skiver (Fig. 8A) og for biopsier fra fire andre pasienter (fig. 8B-E, en biopsi ga bare nok skiver for transduksjon med Ad5T /41sSK-IJ-YSA og Ad5T /41sSK). Merk at luciferase målinger er høy fordi vi spilte høy titer transductions å aktivere overvåking av GFP uttrykk. Vi observerte en markant økt transduksjon for Ad5T /41sSK-IJ-YSA sammenlignet med Ad5T /41sSK i 5 av 5 biopsier (signifikans ble nådd i 3 biopsier med 4.3- til 576-fold forskjeller, ikke i de resterende biopsier grunn av begrenset materiale) . Den sterkeste økningen i transduksjon ble observert for biopsi som viste sterkest EphA2 uttrykk. Ad5TS /41sK-IJ-YSA viste høyere transduksjon enn Ad5T /41sSK i fire av fire biopsier, men var lavere enn for Ad5T /41sSK-IJ-YSA i tre av fire biopsier, som var i motsetning til resultatene i monolagkulturer. Til slutt, transduksjon av melanom levende vev skiver av Ad5KO1-HI-YSA ble sterkt økt sammenlignet med Ad5KO1 i fire av fire biopsier (2,1 ganger til 17,1 ganger, betydelige i 2 biopsier). Disse resultatene bekrefter re-målrettede adenovirus transduksjon mediert av den innsatte YSA peptid for Ad5T /41sSK-IJ-YSA og Ad5KO1-HI-YSA også i klinisk relevant tumorbiopsimateriale.
(A-E) Stue vevssnitt av melanom metastaser fra 5 forskjellige pasienter ble omformet med 10
10 vp /skive genomisk fiber-modifisert, EphA2 målrettede Luc /GFP reporter og kontroll virus. Antallet transduserte skiver per virus var avhengig av størrelsen av biopsi og var n = 4 (A, B), n = 3 (C), n = 2 (D) og n = 5 (E). Luciferase reporter-gen-ekspresjon ble kvantifisert 3 dager post-transduksjon. Kolonnene (A-E) og feilstolper (A, B, C, E) viser middelverdier og standardavvik, respektivt. RLU, relative luminescence enheter. *
/# p 0,05 versus 5T /41sSK (*) eller 5KO1 (
#)
Diskusjoner
I denne studien vi etablere celletype-spesifikke. Ad celle oppføring av funksjonelle peptid ligand innsetting i en de-målrettet kimære fiber stillaset som inneholder kort HAdV-41 fiber aksel og knott (Ad5T /41sSK). Videre beskriver vi Ad vektorer entry-målrettet mot svært relevant pan-kreft overflatemarkør EphA2 av genomisk innsetting av genet som koder for det kimære fiber eller en CAR-bindende ablateres HAdV-5 fiber med YSA peptid-ligand. Transduksjon av EphA2-positive celler
in vitro
ble dramatisk økt med peptid ligand innsetting for begge fiber formater (opptil 236 ganger), understreker styrken av YSA peptid for re-targeting av viral cellebinding og oppføring . Vi har tidligere identifisert EG, HI og IJ looper av Ad5T /41sSK som områder for funksjonell innsetting av RGD4C peptid, som binder seg til allment uttrykt inte [14]. Her fikk vi bekreftet gjennomførbarheten av disse innstikk bruker EphA2-bindende YSA peptid. I motsetning til de RGD peptidet, som viste overlegen aktivitet i HI løkke, observerte vi tilsvarende aktivitet i hver av de tre sløyfer for YSA peptid (fig. 2), som avslører at innstikk påvirke peptid-reseptor interaksjoner forskjellig avhengig av peptid . Med YSA peptidet, kan vi viser for første gang at det kimære Ad5T /41sSK fiber letter celletype-spesifikk Ad transduksjon ved bruk av et panel av EphA2-positive og EphA2-negative celler (fig. 2 og 5). Peptide konkurranse og rekombinante reseptor ekspresjonsstudier klart viser at transduksjon er peptid-spesifikk og formidles ved EphA2 (fig. 3 og 6). Disse resultatene etablere en begrunnelse for fremtidige studier som skal utforske om ytterligere ligand peptider er funksjonell i Ad5T /41sSK fiber stillas, slik at viruset oppføring målgruppe via andre overflatemarkører.
Vi viser at innføringen av de endrede fiber inn virusgenomet, for derved å erstatte den opprinnelige fiber, er mulig (fig. 5) i tillegg til pseudotyping via to-trinns transfeksjon /super protokollen, som også brukes i våre tidligere studie ([14], fig. 2-4). Vi har observert effektiv fiber trimerisering, virusproduksjon og fiber inkorporering inn i viruspartikler for genomisk modifiserte virus med 5T /41sSK fibre (og KO1 fibre, se nedenfor).
