Abstract
Overuttrykte TOP2A er forbundet med risiko for systemisk progresjon hos pasienter med prostatakreft, og høyere nivåer av TOP2A ble funnet i hormonresistent tilfeller. Til belysning av mekanismen som høye nivåer av TOP2A bidra til tumorprogresjon genererte vi TOP2A overekspresjon prostatakreftcellelinjer. Vi viser at TOP2A fremmer tumor aggressivitet ved å indusere kromosomale rearrangements av gener som bidrar til en mer invasiv fenotype. Anti-androgen behandling alene var ineffektiv i å drepe TOP2A overekspresjon celler på grunn av aktivering av en androgen reseptor-nettverk. TOP2A forgifter drepte tumorceller mer effektivt tidlig i utviklingen kurs, mens på senere stadier de ga større fordel når det kombineres med anti-androgen behandling. Mekanistisk, finner vi at TOP2A forbedrer androgen signalering ved å tilrettelegge transkripsjon av androgen responsive gener, og dermed fremme tumorcellevekst. Disse studiene viste en sammenheng mellom TOP2A og androgen reseptor signalveien som bidrar til prostata kreft progresjon og overfører følsomhet for behandlinger
Citation. Schaefer-Klein JL, Murphy SJ, Johnson SH, Vasmatzis G, Kovtun IV (2015 ) Topoisomerase 2 Alpha Samarbeider med androgen Receptor å bidra til prostatakreft Progresjon. PLoS ONE 10 (11): e0142327. doi: 10,1371 /journal.pone.0142327
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, ITALIA
mottatt: 10 juni 2015; Godkjent: 19 oktober 2015; Publisert: 11.11.2015
Copyright: © 2015 Schaefer-Klein et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Waterman biomarkører stipend og Center of Individualisert medisin ved Mayo Clinic. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
DNA topoisomerase to alfa (TOP2A) er en viktig kjernefysisk enzym som er nødvendig for oppløsning av topologisk stress forbundet med DNA replikasjon. TOP2A introduserer forbigående dobbelttrådbrudd (DSB) på DNA i en ATP-avhengig måte å tillate endringer i DNA topologi og eliminere over svingete [1,2]. TOP2A funksjon er avgjørende i mange biologiske prosesser, som replikering, transkripsjon, DNA-reparasjon og kromosomstruktur vedlikehold. Det uttrykkes ved høye nivåer i delende celler som dens nivå er kjent for å bli regulert gjennom cellesyklus, og det er ofte brukt som en proliferativ markør [3,4]. Unormalt av TOP2A protein er knyttet til kromosom ustabilitet [5]. TOP2A antas å spille en viktig rolle i decatenation sjekkpunkt under mitose, en mekanisme ansvarlig for korrekt kromosomsegregering [6-8]. Høyt nivå av TOP2A som en indikator på mer aggressiv atferd og avansert stadium ble rapportert for flere kreftformer [9,10]. Målretting TOP2A og påfølgende celle proliferasjon, har vært anvendt som en terapeutisk tilnærming til rutinemessig behandling av visse ondartede sykdommer [11]. Legemidler som tilhører klassen av TOP2A gifter utgjør det meste av godkjent for klinisk bruk agenter. Etoposid og doxorubicin mål både Top2 enzym isoformer, A og B, ved å forstyrre deres DNA spaltning /ligeringssyklus, indusere DNA DSB og trigger celledød [12,13]. En annen klasse av top2 rettet mot forbindelser, top2 katalytiske hemmere, må ikke brekning dannelsen av protein-koblede DNA DSB men fungere som ikke-konkurrerende hemmere av TOP2 ATPase aktivitet [12]. Effekten av TOP2A giftstoff antas å avhenge av nivået av TOP2A protein [5] og dets enzymatiske aktivitet [14]
. En rekke studier har vist at forhøyede nivåer av TOP2A konto for høyere sensitivitet av cellene til TOP2A gifter etoposid og doxorubicin [15,16]. Aktiviteten av enzymet TOP2A reguleres av post-translasjonelle modifikasjoner [14-22]. Fosforylering av TOP2A ved aminosyrerester i det katalytiske domenet påvirker dets enzymatiske aktivitet [17, 21]; og mutasjoner i noen av disse områdene ble rapportert å stå for motstand av kreftceller til TOP2A gift [14]. Selv om nivået av TOP2A protein og dets aktivitet er betraktet som viktige bidragsytere til følsomheten av tumorceller til TOP2A gifter, har TOP2A også vært vist å assosiere med resistens mot kjemoterapi, både
in vitro
og
in vivo
, gjennom mekanismer for endring av intracellulær distribusjon og apoptose hemming [23,24]. Høye nivåer av protein DLX4 ble vist å stimulere reparasjon av DNA DSB indusert av doksorubicin gjengi stoffet ineffektive [25].
Motstand mot TOP2A gift, observert i klinisk ildfaste svulster [26], og utvikling av sekundære kreftformer, slik som myelogen leukemi, som et resultat av
de novo
rearrangementer [12,27], er de største begrensningene til et anti-TOP2A terapi. Videre undersøkelser for å forstå faktorer og mekanismene bak tumor respons på TOP2A hemmer narkotika er nødvendig.
TOP2A ofte overuttrykt i aggressiv prostatakreft (PCA). Tidligere studier har vist en positiv sammenheng mellom uttrykk nivå TOP2A og Gleason score (GS) [28,29]. De karsinomer med det høyeste uttrykk for TOP2A ble dårlig differensiert [28]. Forhøyede nivåer av TOP2A ble også funnet i hormonresistent PCa av GS 8-10 [29]. Vår gruppe har funnet at overekspresjon av TOP2A var signifikant assosiert med økt risiko for systemisk progresjon i PCA pasienter [30]. Den TOP2A proteinnivå var den sterkeste prediktor for utfallet i sammenheng med
ERG
uttrykk [31].
TMPRSS2-ERG
fusjon, den vanligste omorganisering observert ved PCA rammer opp til 60% av tilfellene [32,33]. Mekanismen underliggende generasjon av
ERG
fusjon har blitt undersøkt [34,35]. Haffner et al. har vist at androgen reseptor (AR) og TOP2B er co-rekruttert til regulatoriske elementer av androgen responsive gener ved transkripsjon og trigger dannelsen av DNA DSB. Disse pausene er antatt å være svært recombinogenic og når reparert resultat i produksjon av
de novo
fusjonsgener, for eksempel
TMPRSS2-ERG product: [35]. Tilsvarende er TOP2B rekruttert til andre steroidreseptorer: østrogenreseptoren målgener ved østrogen signale [36,37]. Selv om TOP2A og B proteiner har lignende cellulære funksjoner i løse DNA overwinding ved å innføre DSB sin, ingen studie rapporterte et samarbeid mellom TOP2A med transkripsjon maskiner på en måte analogt til TOP2B. Til tross for en rapportert korrelasjon mellom høye nivåer av TOP2A og dårlig resultat i kreft, den nøyaktige mekanisme som ligger til grunn mer aggressiv fenotype forbundet med TOP2A er ikke kjent. Top2 gift, som mitoxantrone og doxorubicin, er tidvis foreskrevet for å behandle kastrering-resistente metastatisk PCa ble vist seg å gi bare palliative fordeler [38]. På den annen side, standard adjuvant androgen deprivasjon terapi syntes å være effektiv bare i gruppen av pasienter med tumorer som uttrykte høy TOP2A og er positive for
ERG
fusion [30,31]. Det er fortsatt uklart om disse pasientene kan ha nytte av behandling med TOP2A hemmere i en adjuvant. I denne studien har vi utviklet en celle modell for å undersøke rollen TOP2A i tumorprogresjon og vurdere sitt bidrag til celle følsomhet for hormonelle og kjemoterapi. Vi viser at TOP2A driver PCa mot en mer invasiv fenotype ved å indusere DNA rearrangements. Vi har også bevis for mekanismen for tidsrelatert følsomhet av prostata tumorceller til TOP2A giftstoff. Vi viser at mer avanserte prostata tumorceller, motstandsdyktig mot androgen ablasjon, kan mer effektivt elimineres ved en kombinasjonsbehandling med anti-androgen og doxorubicin. TOP2A forstyrrer anti-androgen terapi øker følsomheten til AR signalering ved å tilrettelegge sin transkripsjonen aktivitet på androgen responsive elementer.
Resultater
Generering av prostatakreftcellelinjer overekspresjon TOP2A
Vi antok at høye nivåer av TOP2A, ut over de som normalt er til stede i sykkel celler, forårsaker vedvarende generering av DNA DSB som senere fører til genomiske rearrangementer i forbindelse med dannelsen av en mer aggressiv fenotype (fig S1A). For å undersøke bidraget fra TOP2A til prostata kreftutvikling og utforske fordelene ved terapeutisk målretting av dette proteinet for PCA pasienter vi satt ut for å utvikle PCA cellelinjer stabilt overekspresjon TOP2A. Selv TOP2A er høyt uttrykt i kreftceller
in vivo
, forsøk på å ectopically uttrykke dette proteinet
in vitro
har vært mislykket på grunn av samtidig induksjon av apoptose [39].
In vivo
under kreft progresjon, celler har utviklet mekanismer for å omgå programmert celledød forbundet med høy grad av TOP2A. For eksempel, CKS2 protein, forhøyet i PCA i dyremodeller og PCA cellelinjer, ble vist seg å beskytte cellene mot apoptose [40]. Derfor, for å overvinne apoptose indusert av høye nivåer av TOP2A, vi først genererte PCa LnCap stabile kloner som overuttrykker CKS2 (S1B figur), og kloner med redusert nivå av caspase-3 (S1C figur), en viktig effektor caspase i apoptotisk reaksjonsvei [41] . Uttrykk for caspase-3 ble meldt tapt eller reduseres ved PCA [42]. De katalytisk inaktive former av caspase-3, når transfektert inn i cellene, ble spesielt vist å hemme celledøden forårsaket av DNA-skade reaksjon [43]. Forsøk på å omgå TOP2A-indusert apoptose ved overekspresjon CKS2 ikke klarte å redde noen TOP2A overekspresjon cellelinjer. Tre kloner med redusert nivå av caspase-3, ble utvalgt ved integrering av TOP2A cDNA og anvendt i påfølgende eksperimenter. T14 klone viste det høyeste nivået av TOP2A protein og ble brukt som TOP2A høy uttrykker, mens T25 og T33 hadde en endogen nivå TOP2A og ble brukt som negative kontroller (S1D figur).
Høyere TOP2A øke invasivitet av tumorceller
for å rekapitulere endringene som skjer
in vivo
på PCa progresjon, vi kontinuerlig kultur kloner å undersøke hvordan nivået av TOP2A påvirket cellulære funksjoner. Kloner ble høstet ved forskjellige passasjer og analysert. Som uttrykk for TOP2A er kjent for å korrelere med spredning [4] vi først undersøkt spredning priser. Ingen signifikant forskjell i spredning prisene ble funnet mellom TOP2A høyere expresser klone (T14) og nedre expresser kloner (T33 og T25) (fig 1A). Spredning prisene ikke endres vesentlig med økende passering av enten klone tyder på at forhøyede nivåer av TOP2A ikke påvirker tumorvekst
per se
i kultur. Høyere nivåer av TOP2A gjorde imidlertid påvirke bevegelighet og invasivitet av LNCaP kloner. Foreldre LNCaP celler, TOP2A høye og lave expressers av tidlige og sene passasjer ble sammenlignet i Boyden kammer analyser. Både tidlig (p23) og sen (P46) passasjer av TOP2A overekspresjon T14 klone viste større bevegelse gjennom membranen enn sine matchede kontroll kloner eller foreldre LNCaP celler (fig 1b). Tilsvarende celler med høy grad av TOP2A vist mer invasive egenskaper enn deres motparter med endogent nivå av proteinet. Morfologien til cellene migrerte gjennom den belagte membran forskjellig mellom T14 og T33 kloner. De TOP2A overekspresjon T14 celler ble sprer seg med uregelmessige piggete former og lengre prosesser som ligner mesenchymale fenotype, mens T33 celler dukket flatere og rundere, med korte prosesser (fig 1c).
A) spredning av kloner stabilt overekspresjon TOP2A (T14) og matchede kontrollceller med endogen nivå TOP2A (T25 og T33). Spredning ble bestemt 96 timer etter celle plating. B) motilitet av TOP2A kloner av forskjellig passasje og foreldre LNCaP celler retningslinjer i Boyden kammeret analysen. C) Bilder av celler med invasiv fenotype etter 72 timer med spredning. P betegner passasje nummer, OD, blir au måles optisk tetthet i vilkårlige enheter. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, basert på 3 uavhengige eksperimenter. * P 0,00001, og ** p 0,0001, n = 3.
Følsomhet av celler som overuttrykker TOP2A til behandlinger endringer ved langvarig spredning
Høy klasse prostatakreft
in vivo
er kjent for å utvikle resistens mot androgen deprivasjon terapi med tid [44]. Ingen målrettet behandling finnes for disse pasientene. Vi har derfor undersøkt hvordan følsomheten generert TOP2A overekspresjon kloner til anti-androgener, TOP2A gift og kombinasjon av to medikamenter endret seg med tiden. På tidlige passasjer høye TOP2A-ekspressor T14 celler var mye mer følsomme for doxorubicin enn sine motstykke T25 celler (figur 2A). Forskjellen forsvant ved høyere passasjene når cellene ble dyrket i kultur, med T14 cellene blir mer bestandig overfor anti-TOP2A behandling (figur 2B). Lignende tendens ble observert for behandlinger med anti-androgen Casodex (Fig 2A og 2B, nedre paneler). Det var en konsekvent betydelig forskjell i følsomheten for Casodex mellom T14 og T25 kloner av tidlige passasjer. Selv om små (ca. 10-15%) ved de utvalgte doser, ble denne forskjell ikke observert ved de høyere passasjer, tilsvarende mønster av følsomhet er vist for doksorubicin (figur 2B, øverste panel). Forskjellene i respons ikke var relatert til endringer i nivået for TOP2A protein som disse celler etter forplantning i kultur beholdt høyere nivåer av TOP2A (figur 2C). Således viser disse data at celler fra tidlige passasjer overekspresjon TOP2A er mer følsomme for behandling, både anti-TOP2A medikamenter og anti-androgener. En fersk studie har identifisert at DLX4, ofte overuttrykt i bryst og eggstokk-kreft, stimulerer reparasjon av DNA DSB indusert av TOP2A gift, og dermed redusere celle følsomhet for behandling [25]. Vi har derfor, sammenlignet med nivået av DLX4 i normale prostata epitel-celler og tumorceller fra kreft i forskjellige GS (S2 Fig). Microarray uttrykk analyse [30] viste at det er ingen induksjon av DLX4 i PCA dermed indikerer at DLX4 ikke vil være en medvirkende faktor til motstand mot TOP2A giftstoff ved PCA.
A) Survival of TOP2A kloner av tidlig passasje i respons på behandling med doksorubicin (øverst panel) og Casodex (nederst panel). B) Survival of TOP2A kloner av sen passasje i respons på behandling med doksorubicin (øverst panel) og Casodex (nederst panel). C) Western blot viser nivåer av TOP2A i genererte stabile kloner av tidlige og sene passasjer. Påvisning av kjernefysisk protein TBP ble brukt til å bekrefte lik belastning. D) Kvantifisering av TOP2A uttrykk basert på Western blot i C. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, basert på 3 uavhengige eksperimenter. P-verdier er som angitt, N.S. er ikke signifikant.
Vi neste testet om celledreping ville være mer effektiv hvis en kombinasjon av disse to stoffene ble brukt. I det første settet, behandling med konstant dose av doxorubicin og økende konsentrasjoner av Casodex viste ingen fordel i å drepe celler med høy grad av TOP2A sammenlignet med endogene kontroll (figur 3A og 3B, topplater). Faktisk tidlig passasje T14 klone viste mer motstand mot dette regimentet i forhold til T25 (figur 3A, topp panel). I motsetning til behandling med konstant dose av 50 pM av Casodex, bruk av som alene resulterte i 90% celleoverlevelse (fig 2), viste mer effektiv avliving av sen passasje celler som overuttrykker TOP2A forhold til tidlig passasje og lav uttrykker kontroll T33 klone ( fig 3B, nedre panel). Til sammen antyder disse resultatene at kombinasjonsbehandling målretting AR og TOP2A i TOP2A sterkt uttrykkende celler kan være fordelaktig for avanserte tumorer
A) Overlevelse av TOP2A kloner av tidlig passasje i respons til kombinasjonsbehandling.: Topp pult konstant dose av doksorubicin og økende konsentrasjoner av Casodex; bunn dose panel-konstanten for Casodex og økende konsentrasjoner av doksorubicin. B) Survival of TOP2A kloner av sent passasje i respons til kombinasjonsbehandling, medisiner og konsentrasjoner er som i en. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD, basert på 3 uavhengige eksperimenter. P-verdier er som angitt, N.S. er ikke signifikant.
For å få innsikt i mulig samspill mellom TOP2A handlinger og androgen signalnettverk Deretter undersøkte nivåer av AR i kloner overekspresjon TOP2A til de i kloner med endogen nivå TOP2A. Celler ble dyrket i medium med ikke-strippet serum som inneholder grunnleggende nivå av androgener uten ytterligere tilskudd. De totale AR protein nivåer ble sammenlignet mellom T14 og T25 kloner av tidlige og sene passasjer (fig 4a). T14 celler av begge passasjene viste signifikant høyere nivåer av AR enn de samsvarende kontroll T25 celler (forhøyede 3 og 8 henholdsvis fold) tyder på en involvering av TOP2A i induksjon av AR uttrykk ved transkripsjon nivå. Nivåene av TOP2A protein forble høyere i T14 celler ved hver passering tatt i forsøket (figur 2C, S3C og S3E fig). For å sikre at TOP2A protein var funksjonelle ble analysen ved bruk av TOP2A spesifikk DNA-templat utført. Enzymatisk aktivitet målt i proteinekstrakt oppnådd fra T14 cellene var høyere enn den til T25 celler (S3) Fig. Når justert til mengden av totalt protein, det var seks ganger større (fig S3b), i samsvar med høyere nivåer av TOP2A i T14 T25 i forhold til cellene. Total enzymatisk aktivitet forble forhøyet i overensstemmelse med høyere nivåer av TOP2A protein, i senere avsnitt av T14-celler (Fig S3D), som bekrefter at TOP2A forble funksjonelle, og det var ingen mutasjoner i aktivt sete innført ved forplantning av denne klonen.
Western blot viser totale nivået av AR i TOP2A kloner av ulike passasjer (som angitt), topp panel. Kvantifisering av AR uttrykk normalisert til beta aktin nivå, bunnpanelet. B) Western blot viser induksjon av AR nivå (øverst) ved behandling av TOP2A clones.with 5 nM av R1881. Tilsvarende kvantifisering av TOP2A nivåer normalisert til TBP lasting kontroll vises (nederst); nt er ubehandlet, t behandles; celle passasjer er som angitt. C) Skjematisk viser promoter område for
KLK3 plakater (PSA) genet brukes i CHIP analysen. DtFw og DtRv skildre posisjoner forover og bakover primere for henholdsvis distal promoter regionen; PxFw og PxRv-stillinger for forover og bakover primere av proksimale arrangøren. D) CHIP analyse av TOP2A kloner stimulert med 5 nM av R1881 i 3 timer. Anriking av AR og TOP2A på fjerne og nære promoter regioner av KLK3 genet (øvre og midtre paneler) og deres fravær på kodende regionen av GAPDH-genet (nedre panel) er vist. M er DNA-størrelsesmarkør, HG-er humant genomisk DNA anvendt som en positiv kontroll for PCR-amplifisering, EL1 og EL2 er påfølgende eluering fraksjoner (buffere er beskrevet i Methods).
TOP2A modulerer AR signale
Høyere nivåer av AR ble observert i TOP2A overekspresjon celler (figur 4A). For å belyse den mekanismen som TOP2A kan bidra til regulering av transkripsjon, behandlet vi cellene med syntetisk androgen R1881 og sammenlignet atomnivå AR. AR translocates til kjernen ved ligandbinding til å regulere transkripsjon av responsive gener [45]. Vi har observert signifikant høyere nivå av kjerne AR som reaksjon på androgen stimulering i TOP2A overekspresjon T14 celler av tidlig (s.24) passasje i forhold til T25 celler (figur 4B). Nivået av atom AR i disse cellene økte 5 ganger etter behandlingen. Late passasje (s.55) celler som overuttrykker TOP2A viste en svakt forhøyet nivå av AR, ikke så dramatisk som sine forløpere ved passering 24. Aktivert AR gjenkjenner og binder seg til palindromisk androgen respons element (ER) sekvenser ved det nære gener for å indusere deres transkripsjon [45,46]. Våre data antyder at TOP2A virker med AR for å aktivere transkripsjon av responsive gener. Å formelt teste dette vi utført kromatin immunpresipitering ved hjelp av en region som tilsvarer den proksimale og distale er i formidler av prostataspesifikt antigen (PSA) (KLK3 genet, fig 4C), en godt karakterisert transcriptional målet for AR [46]. Antistoffer, til TOP2A og AR, var i stand til å fange opp DNA-fragmenter som inneholder ER på KLK3 arrangøren etter behandling med R1881 (fig 4D). Det var ingen forskjell i binding av TOP2A eller AR Ares mellom T14 og T25 kloner. Bindingen var spesifikk da ingen rekruttering av enten TOP2A eller AR til ubeslektet sekvens ble observert (kodende region av GAPDH-genet ble anvendt som en kontroll. Dette resultatet indikerer at i likhet med dens homolog TOP2B er TOP2A rekruttert til steroid regulatoriske elementer for å stimulere transkripsjon og antyder synergis handlinger med androgen signalisering i prostata kreftceller.
TOP2A fremmer produksjon av DNA rearrangements i PCA celler
Store kromosom rearrangements blir ofte observert ved PCA [47,48] og antas å spille en rolle i startfasen og progresjon. Vi viser her at på en måte som ligner på TOP2B er TOP2A rekruttert til Ares å stimulere transkripsjon. Enten gjentakelse av denne prosessen resulterer i progressiv akkumulering av DNA rearrangements ble ikke undersøkt. for å teste dette, kompis par stoppunkt sekvensering ble utført [49,50] på ulike passasjer av høye og lave uttrykke TOP2A kloner. Foreldre LNCaP celler havn en rekke genomisk endringer som inkluderer trans, og kopiantall endringer (S4A Fig). Cellene er valgt etter integrasjon av vektorer som bærer siRNA til caspase-3 og cDNA for TOP2A viste signifikant høyere antall av kromosomale endringer (S4B Fig). Dette er ikke overraskende siden de manipulasjoner sannsynlig førte til valg av celler med redusert evne til å gjennomgå apoptose. T25-kloner som uttrykker endogent nivå av TOP2A viste ingen forandring i antall genomiske rearrangementer med proliferasjon (figurene 5A og 6A). Det totale antall endringer i T25 celler av forskjellige passasjer var den samme som i forløperceller som bærer redusert nivå av caspase-3 (figur 6A). I motsetning til dette, T14 celler som overuttrykker TOP2A viste progressiv akkumulering av rearrangementer med økende passasje (figurene 5B og 6B). Den TOP2A genet selv ble også berørt i T14 sent passasje (tabell 1). Men den avbrudd av en allel ikke resultere i signifikant reduksjon av ekspresjon av proteinet, noe som tyder på at eksogen integrert kopi av genet ble først og fremst å drive ekspresjon.
A) Sen passasje av T25-klon som uttrykker endogent nivå av TOP2A . B) Sen passering av klon T14 overekspresjon TOP2A. Grå prikker (teller) viser hyppigheten av fordeling av lyder i 30kb vinduer og brytningspunkt for alle kromosomene (tallene er angitt). X-aksen strekker seg over lengden av kromosomet, viser Y-aksen antall leser for hvert vindu. Vindu teller vises i henhold til prediksjon av CNV algoritme. Grey poeng er normal, røde punkter tilsvarer slettinger og blå punktene viser gevinster. Lines koble bioinformatically identifisert stoppunkter. Breddene av linjene korrelerer med antall assosiert kompis-pair leser. Fargen av forbindelseslinjene indikerer polariteten til sluttet kromosomet. For intra-kromosom hendelser rød viser frem retning for begge deler, indikerer grønn inversjon for en partner og blått viser inversjon for begge. For inter-kromosomale hendelser, forbinder rød p-sidestykket fra den større kromosomet til Q-side stykke av den mindre kromosomet i retning fremover, kobles grønn q-sidestykket fra den større kromosomet til p-side stykke av mindre kromosom i retning fremover, kobles blå p-sidestykket fra den større kromosomet til p-sidestykke av de mindre kromosomet i motsatt retning og magenta forbinder q-sidestykket fra den større kromosomet til Q-side stykke av mindre kromosom i motsatt retning. Svart indikerer balanserte translokasjoner. Blå pilspisser peker til utvalgte DNA rearrangements som ble anskaffet ved spredning (fraværende i tilsvarende celler fra tidligere passasje.
A) Totalt antall stoppunkter som finnes i T25 celler av ulike passasjer. LNCaP /Casp er et derivat av LNCaP cellelinje som stabilt uttrykker siRNA å slå ned caspase 3. B) DNA-forandringer vunnet ved TOP2A overekspresjon T14 celler ved spredning. Tallene representerer endringer observert i tillegg til de som er til stede i kontroll T25 klone. C) Skjematisk viser foreslått rolle TOP2A i prostata kreft progresjon og motstand mot androgen ablasjon terapi.
Sammen utgjør disse resultatene indikerer at genomisk endringer indusert av høye nivåer av TOP2A fører til kjøp av mer aggressiv fenotype, og kan også bidra til å utvikle resistens mot monoterapi behandlinger.
Diskusjoner
Selv om radikal prostatektomi kurer fleste av GS 7-10 pasienter, vil risikoen for systemisk progresjon og død etter operasjonen fortsatt høyere enn 15%. En undergruppe av disse pasientene utvikler disseminert sykdom [44] og noen, etter innledende forbedring med androgen deprivasjon, fremdrift til kastrering resistent tilstand [51]. Til tross for fremskritt i behandling av pasienter med kastrering resistent sykdom [52, 53], oppnåelse av langsiktige overlevelse er fortsatt et problem. Forståelse av mekanismene bak motstand mot ablasjon er kritisk. En av de foreslåtte mekanismene er utvikling av økt følsomhet for lave nivåer av androgener etter ablasjon grunn AR forsterkning eller heving av dens uttrykk [54,55]. I samsvar med dette, vår studie viste at TOP2A, ofte overuttrykt i PCA tilfeller med høy risiko for progresjon, driver uttrykk for AR. Våre data antyder at androgen ablasjon terapi kan være mindre effektive i nærvær av høye TOP2A protein (figur 6C). Videre behandling eksperimenter støtter forestillingen om at behandling ved hjelp av kombinasjon av anti-androgen og TOP2A giften gir en sterkere fordel. Vi viser også at targeting TOP2A med gift alene er effektiv bare på tidligere stadier, før TOP2A drevet DNA endringer har skjedd (Fig 6C). Etter avtale med disse funnene en fersk studie ved hjelp av en annen modell for PCA har identifisert TOP2A som en gjentakelse-spesifikt tumor antigen [56]. Muse prostatakreft når de utsettes for suboptimal immunterapi utviklet seg til en drastisk annerledes fenotype, som viser høy uttrykk for TOP2A og respons på anti-TOP2A behandling. På dette stadiet av minimal restsykdom, TOP2A-positive celler vises stamcelleliknende fenotype og viste økt invasivitet [56], en egenskap, karakteristisk for TOP2A-overekspresjon celler i vår modell. I en annen studie, ved hjelp av syngene murine modell av spontan PCa metastaser [57] forfattere vist at høye nivåer av TOP2A korrelert med høye nivåer av metyltransferase Ezh2, og målretting av både proteiner i kombinasjon resulterte i effektiv celledød.
I tillegg nivå og funksjonaliteten til TOP2A, cellulær respons overfor dets inhibitorer ble også rapportert å være avhengig av aktiviteten av andre faktorer. DLX4, en homeobox genet, overexpressed i flere krefttyper [58], ble vist å redusere følsomheten av kreftceller til TOP2A forgifter ved å stimulere reparasjon av DSB ved ikke-homolog ende begynte [25]. Våre data indikerer at dette ikke er tilfelle i PCa, som nivået av DLX4 øker ikke med tumoren karakter, men forblir lik den som er i normale epitelceller (S2 Fig).
Sammen er disse studiene tyder på at det er et tidsvindu i løpet av PCa progresjon hvor anti-TOP2A terapi kan være spesielt effektiv. Enten TOP2A forgifter /hemmere eller immunterapi må være valg av behandling i klinikken gjenstår å fastslå.
Til slutt, vi viser her at TOP2A samarbeider med AR for å indusere transkripsjon av målgener (Fig 6C). Nivået av AR i seg selv er betydelig høyere i TOP2A overekspresjon celler etter stimulering med androgen agonist. I likhet med sin isoform TOP2B, er TOP2A co-rekruttert til ER med AR, og er sannsynlig å aktivere transkripsjon. Tidligere TOP2B ble også vist å indusere DNA DSB på regulatoriske områder av østrogen og AR målgener [35,36]. Selv i vår studie vi ikke ta denne muligheten direkte, vi observere en økning i antall DNA rearrangements i TOP2A overekspresjon celler ved spredning. Enten de er et resultat av feil i reparasjon av DNA DSB som opptrer ved de transkripsjonsregulerende elementer eller en følge av overskudd av TOP2A funksjon i løpet av replikasjonen gjenstår å bli undersøkt videre. Vi identifiserte noen omorganiseres gener som vi anser som «TOP2A avhengige» (tabell 1). Basert på tidligere observasjoner i forbindelse med funksjonen av disse genene, kan endringer i egenskapene til TOP2A overekspresjon celler og deres følsomhet for behandling tilskrives endringer på disse DNA-områder. For eksempel, Emi1 (FBOX5) (tabell 1) påvirkes i T14 celler av den siste passasjen er en kjent regulator mitotisk progresjon [59,60]. Det har vært implisert i å bestemme sensitiviteten til doksorubicin [61]. I den studien uttømming av Emi1 ført til økning i følsomhet, i samsvar med dette, våre data at duplisering observert i T14 celler av senere passasje kan utgjøre en reduksjon av følsomhet overfor doksorubicin (figur 2B). Forstyrrelse av PARD3B-genet, er vist for å styre tett veikryss [62], kan være ansvarlig for økningen i motilitet og invasjon kapasitet av T14-celler. Reduksjon i uttrykk eller tap av Tango, en homolog av Tango6, forstyrret i TOP2A overekspresjon celler, ble også tidligere vist seg å øke migrasjon [63]. Funksjonen til Tango6 har ikke blitt undersøkt ennå, om sin tap kan ha lignende effekt på PCA cellenes egenskaper krever videre undersøkelser. Fremtidige studier er nødvendig for å utdype eksakt funksjonell bidrag av ervervede genomisk endringer.
Materialer og metoder
Cell kultur og behandlinger
Cellekulturer ble opprettholdt følgende ATCC anbefalinger. LnCap (ATCC) og LnCap stabile derivater ble dyrket i RPMI 1640 (Gibco, Life Technologies) kultur supplert med 100 enheter /ml penicillin, 1 mg /ml streptomycin og 10% FBS. For androgen behandling eksperimenter celler ble dyrket i samme medium, men å erstatte 10% FBS med 5% trekull-filtrert FBS (One Shot, Life Technologies) i 48 timer før tilsetting av 5nM R1881 (metribolone, RM10, TSZCHEM), og etter det ble inkubert i ytterligere 48 timer. Cellene ble samlet ved skraping og protein ble isolert (Nuclear Extract kit, Aktiv Motif) for Western blot analyse. Doksorubicin og Casodex ble kjøpt fra Sigma-Aldrich Inc.
Generering av celler som overuttrykker TOP2A
Panel på seks caspase 3 shRNAs klonet inn pGIPZ letiviral vektor ble kjøpt fra Open Biosystems (ID: V2LHS_15044-15049
