Abstract
Bakgrunn
Nyere bevis fra
in vitro Hotell og
in vivo
studier har vist at avvikende reaktivering av Sonic Hedgehog (SHH) signalveien regulerer gener som fremmer celledeling i ulike humane kreftstamceller (cscs). Derfor har de kjemoterapeutiske midler som hemmer aktiveringen av Gli transkripsjonsfaktorer dukket opp som lovende nye terapeutiske legemidler for kreft i bukspyttkjertelen. GDC-0449 (Vismodegib), oralt administrer molekyl som tilhører to-arylpyridine klasse, hemmer SHH signalveien ved å blokkere aktiviteter glattet. Målene med denne studien var å undersøke de molekylære mekanismer som GDC-0449 regulerer menneskelige bukspyttkjertelen CSC egenskaper
in vitro
.
Metodikk /hovedfunnene
GDC-0499 hemmet celleviabilitet og indusert apoptose i tre bukspyttkjertelkreft cellelinjer og bukspyttkjertelen cscs. Dette hemmer også undertrykt celle levedyktighet, Gli-DNA-binding og transkripsjons aktiviteter, og induserte apoptose gjennom caspase-3-aktivering og PARP spalting i bukspyttkjertelen cscs. GDC-0449-indusert apoptose i cscs viste økt Fas uttrykk og redusert uttrykk for PDGFRα. Videre BCL-2 ble nedregulert mens TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5 uttrykk ble økt etter behandling av cscs med GDC-0449. Undertrykkelse av både Gli1 pluss Gli2 av shRNA lignet endringene i celle levedyktighet, spheroid formasjon, apoptose og genekspresjon observert i GDC-0449-behandlede bukspyttkjertelen cscs. Dermed aktiverte Gli gener undertrykke DRS og Fas uttrykk, opp-regulerer uttrykk av Bcl-2 og PDGFRα og lette celleoverlevelse.
Konklusjon /Betydning
Disse dataene tyder på at GDC-0499 kan brukes for behandling av bukspyttkjertelkreft ved å målrette bukspyttkjertelen cscs
Citation. Singh BN, Fu J, Srivastava RK, Shankar S (2011) Hedgehog Signa Antagonist GDC-0449 (Vismodegib) Hemmer bukspyttkjertel~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP Stem Cell Kjennetegn : molekylære mekanismer. PLoS ONE 6 (11): e27306. doi: 10,1371 /journal.pone.0027306
Redaktør: Arun Rishi, Wayne State University, USA
mottatt: 02.09.2011; Godkjent: 13 oktober 2011; Publisert: 08.11.2011
Copyright: © 2011 Singh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (PC) er en svært dødelig malignitet. karakterisert ved slutten av diagnose og behandling motstand. PC er den fjerde største årsaken til kreft i USA med en 5-års overlevelse mindre enn 5%. Kirurgisk reseksjon er den eneste potensielt kurative behandlingen for PC; imidlertid, på grunn av mangel på tidlige symptomer, det store flertallet av pasienter med metastatisk sykdom er tilstede, slik at deres malignitet ubrukelig [1], [2]. Den nåværende standard-of-care terapi, gemcitabin, forlenger pasientens overlevelse etter bare et par uker [3]. Identifisering av nye molekylære mål for PC for å overvinne den dystre prognosen er derfor nødvendig. Tilbakevendende genetiske endringer i definerte gener i forbindelse med forstyrrelser av utviklingscellesignalveier har blitt assosiert med PC utvikling og progresjon. Nyere bevis fra
in vitro Hotell og
in vivo
studier tyder på at Sonic Hedgehog (SHH) signalveien [4] er abnormt reaktivert og anerkjent som en av meglere i de fleste PC-er; derfor har SHH blokade potensial til å forebygge sykdomsutvikling og metastatisk spredning [5].
SHH signale er initiert av bindingen av korttidsvirkende polypeptidligand nemlig Shh (Sonic Hedgehog, indisk Hedgehog eller Desert Hedgehog) for å dets reseptor lappet som derved reduserer de inhiberende virkninger av Lappet på glattes [6]. Glattes blir så lokalisert i den primære cilium av cellen, en organelle spiller en kritisk rolle i signalisering SHH [7]. Det aktiverer glattet en intracellulær kaskade som resulterer i aktivering og kjernefysisk translokasjon av Gli familie transkripsjonsfaktor Gli2 [8]. Gli2 translocates inn i kjernen og induserer transkripsjon av shh målgener, for eksempel Gli1, en pålitelig markør for signalisering SHH [8], [9]. Gli2 er en kritisk komponent i SHH signalisering og dens inaktivering fører til en hemming av SHH signalering. Disse Gli transkripsjonsfaktorer aktiverer gener i cellekjernen som fremmer cellulær proliferasjon, cellulær overlevelse, stemness, og celle skjebne bestemmelse i en rekke organer [5], [10]. SHH veien er en morfogen nødvendig for riktig mønster formasjon under embryogenese; imidlertid, deregulering av denne veien er ansvarlig for flere humane cancere [8], [10], [11]. Nyere bevis tyder på at SHH signalveien på nivå med Gli genene har en viktig rolle i normale bukspyttkjertelen utvikling og det er bevis på at dysregulerte SHH signale spiller noen rolle i bukspyttkjertelkreft [12]. Videre viser flere rapporter at menneskelige bukspyttkjertel kreft enn ekspress Gli gener [13], [14].
transkripsjonsfaktorene for Gli familien har to funksjoner som aktivator og repressor som er definert bare delvis, og kan svare på kombinatorisk og samarbeid Gli aktivitet. Gli familie spiller viktige roller i mekling og tolkning av Shh signaler [15]. SHH-drevne kreftformer oppstå fra en rekke forskjellige mutasjoner som påvirker forskjellige komponenter, inklusive nøkkel transkripsjonen effektor Gli proteiner, fører til en rekke humane maligniteter, inkludert medulloblastom, rhabdomyosarkom, melanom, basalcellekarsinom, og bryst, lunge, lever, mage, prostata og pankreas-kreft [16], [17], [18], [19], [20]. Konstitutivt, er SHH-Gli signale aktiv i basalcellekreft, Medulloblastomas og kreft i spiserøret på grunn av mutasjon i Lappet eller glattes [21], [22]. Melanomer og karsinomer i prostata har videre vist en SHH-Gli signale aksen [23]. I gastrointestinale cancere, oppstår SHH aliserte aktivering transcriptional opp regulering av SHH liganden [24]. Det har nylig blitt foreslått at SHH signale utvikler seg i løpet av colon carcinogenesis [25], [26] og i metastatisk sykdom [27], mens i normalt tarmvev, SHH signalering er involvert i differensiering [28]. Nylig har gener er profilert som er regulert på nedstrømssiden av Gli1 og Gli2 som er involvert i cellevekst og cellesyklus [29], [30], og celleoverlevelse (PDGFRα og Bcl-2) [22]. Gli2 kommer også til uttrykk i mange basalcellekreft [31], noe som tyder på at disse genene kan også være involvert i utviklingen av PC-en, noe som kan være i samsvar med sin delvis handling som formidler av Shh signaler [32]. Men rollene til Gli gener (Gli1 og Gli2) i Hysj-drevet cellulære overlevelse og celledød svar forbli dårlig definert, og spesielt er ukjent deres rolle i cellulær proliferasjon og overlevelse av bukspyttkjertelen cscs og nedstrøms målgener involvert i fastsettelsen av celle skjebne.
Mye oppmerksomhet er nylig blitt fokusert på rollen av kreft stamceller (cscs) /kreft initiere celler (CIC) i initiering og progresjon av faste ondartede sykdommer. Cscs kan være ansvarlig for svulst utbruddet, selvfornyelse /vedlikehold, mutasjon akkumulering, og metastase på grunn av deres evne til å uttrykke anti-apoptotiske og resistente proteiner, og dermed opprettholde tumorvekst [33], [34]. Den SHH signalveien er en viktig regulator av celle fysiologiske prosesser som omfatter proliferasjon, differensiering og apoptose [35]. Nyere studier indikerer at SHH signalanlegget spiller en nøkkelrolle også i CSC biologi inkludert i reguleringen av cscs selvfornyelse, differensiering; og tumorigent potensiale, noe som tyder på SHH signalering kan være et lovende terapeutisk mål i PC [14]. Aktivering SHH signale kan oppheve motstand cscs til kjemoterapi og kan føre til utvikling av nye terapeutiske tilnærminger for behandling av PCer.
For å identifisere nedstrøms målene for Gli gener som regulerer cellulær proliferasjon og overlevelse i bukspyttkjertelkreft stamceller (cscs), benyttet vi en inhibitor av SHH signalering, GDC-0449 (glattet inhibitor), som har blitt identifisert i et cellebasert lite molekyl skjerm for inhibitorer av Gli familie-mediert transkripsjon [36]. GDC-0449 fungerer som en potent hemmer av glattet og viser en høy grad av selektivitet for SHH-Gli signale [36]. I menneskelige bukspyttkjertelen cscs, vi viste hemming av SHH signalveien ved å målrette Gli transkripsjonsfaktorer. GDC-0449 indusert betydelig celledød i tre bukspyttkjertelkreft cellelinjer (ASPC-1, Panc-1 og MIA Paca-2) og bukspyttkjertelen cscs. I ytterligere detaljerte analyser av bukspyttkjertelen cscs, redusert GDC-0449 Shh signalkomponenter (Gli1, Gli2, Lappet-en, Lappet-2, SHH og glattes) uttrykk, Gli-DNA-binding og Gli-luciferaserapportørplasmid aktiviteter. I tillegg knockdown av både Gli1 og Gli2 uttrykk ved hjelp shRNA dratt motstand mot GDC-0499-indusert cytotoksisitet. Videre redusert GDC-0449 uttrykk for PDGFRα samtidig med forhøyede nivåer av Fas, økt uttrykk av TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R2 /DR5, redusert BCL-2 uttrykk, og indusert caspase-3-aktivitet og PARP cleavage. GDC-0449-induserte endringer i genuttrykk og apoptose ble blokkert av Gli1 pluss Gli2 shRNA, og dermed peker en rolle Gli for cellulær proliferasjon og overlevelse i menneskelige bukspyttkjertelen cscs. Disse data tyder på at GDC-0449 undertrykker bukspyttkjertelen cscs spredning og overlevelse ved å hemme SHH signalveien på nivå med Gli gener.
Resultater
SHH veien signaliserer komponenter er uttrykt i humane bukspyttkjertelen kreft cellelinjer og bukspyttkjertelen cscs
Vi først målt uttrykket av ulike komponenter i SHH sti i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen ASPC-en, PANC-en, og MIA-Paca-2 cellelinjer og bukspyttkjertel cscs ved RT-PCR (fig. 1). Dataene viser at komponentene i SHH signalveien, inkludert liganden (Shh), den signalmolekyler (Patched-en lappet-2 og glattes) og effektorer (Gli1, og Gli2) er uttrykt i humane bukspyttkjertel cancer cellelinjer og bukspyttkjertel cscs. Disse data tyder på at SHH veien er intakt i bukspyttkjertelcancercellelinjer og cscs, og støtter konseptet at bindingen av Shh liganden til at det oppdaterte reseptoren reduserer dets hemmende effekter på glattet, slik at signaloverføring som vil resultere i aktivering og nukleær translokasjon av Gli familie transkripsjonsfaktorer [13], [37].
kreft i bukspyttkjertelen celler (ASPC-en, PANC-en og MIA Paca-2) og bukspyttkjertel cscs ble dyrket i 48 timer. Total RNA ble isolert og uttrykk for Shh, Lappet-en, Lappet-2, glattet, Gli-en og Gli-2 ble målt ved QRT-PCR. HK-GAPD ble anvendt som endogene normaliseringskontroll. Alle analyser ble utført i tre eksemplarer, og ble beregnet på basis av ΔΔ
C
t-metoden. N-gangers forandring i mRNA ekspresjon ble bestemt i henhold til metoden til 2
-ΔΔCT med GAPDH anvendt som endogene kontroll.
GDC-0449 reduserer cellenes levedyktighet og induserer apoptose i humane pankreas kreft cellelinjer og bukspyttkjertelen cscs
Tidligere kliniske studier har antydet at GDC-0449 er et lite molekyl hemmer av glattet. Vi først søkte å undersøke effekten av GDC-0499 på celle levedyktighet og apoptose i panelet av tre menneskelige bukspyttkjertelen kreft cellelinjer og bukspyttkjertelen cscs. Inhibering av celle overlevelse og induksjon av apoptose ble observert innen 24 timer etter kontakt med dette stoffet (data ikke vist), men ble lagt merke til ved maksimalt 72 h (fig. 2 og 3). I alle cellelinjene, er GDC-0449 apoptose en doseavhengig måte når opp til 65%. Til sammenligning, GDC-0449 var mindre effektiv i å indusere apoptose i cscs (fig. 3). For ytterligere mekanistiske studier har vi brukt bukspyttkjertelen cscs.
Celler ble behandlet med GDC-0449 (0, 1, 5 og 10 mm) for 48 og 72 timer. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble cellenes levedyktighet målt ved XTT i (A) ASPC-1, (B) MIA PACA-2, (C) PANC-1, og (D) pankreatiske cscs. Data representerer middelverdi ± SD. @ Eller # signifikant forskjellig fra respektive kontroll (P 0,05)
Cellene ble behandlet med GDC-0449 (0, 1, 5 og 10 mm) for 48 og 72 timer.. Ved slutten av inkubasjonsperioden ble cellene høstet og apoptose ble målt. Data representerer middelverdi ± SD. @ Eller # signifikant forskjellig fra respektive kontroll (P 0,05).
GDC-0449 regulerer nedstrøms mål for SHH vei, hemmer Gli-DNA interaksjon, Gli transkripsjonen aktivitet og minsker Gli atomtrans i bukspyttkjertelen cscs
Vi neste undersøkt effekten av GDC-0449 på uttrykk for Fas, DR4 /TRAIL-R1, DR5 /TRAIL-R2, PARP, BCL-2, caspase-3, og PDGFRα av western blot analyse (fig. 4). GDC-0449 indusert uttrykk for Fas, DR4, og DR5 og hemmet uttrykket av Bcl-2 og PDGFRα i bukspyttkjertelen cscs. I tillegg GDC-0449 indusert spalting av caspase-3 og PARP i bukspyttkjertelen cscs, korrelerer med graden av celleoverlevelse og apoptose.
bukspyttkjertelen cscs ble behandlet med GDC-0449 (0, 1, 5 og 10 uM) i 48 timer. Ekspresjon av Fas, DR4 /TRAIL-R1, DR5 /TRAIL-R2, PARP-spaltning, Bcl-2, og Caspase-3 ved Western blot-analyse. β-Actin ble brukt som en lasting kontroll.
neste søkt å undersøke effekten av GDC-0449 på SHH sti ved å måle uttrykket av Shh reseptorer (Lappet-en, Lappet-2 og glattes ) og effektorer (Gli1 og Gli2) ved QRT-PCR (fig. 5A). GDC-0449 hemmet uttrykk for glattes, Lappet-en, og Lappet-2. Tilsvarende GDC-0449 hemmet uttrykk for transkripsjonsfaktoren Gli1 og Gli2. Disse data tyder på at GDC-0449 kan regulere CSC egenskaper ved å hemme ulike komponentene i SHH veien.
. (A), ble bukspyttkjertelen cscs behandlet med GDC-0449 (10 uM) i 36 timer. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble RNA ekstrahert og ekspresjon av Gli1, Gli2 lappet-en lappet-2, glattes og Shh ble målt ved QRT-PCR. Data representerer gjennomsnittet ± SD. @ Signifikant forskjellig fra respektive kontroll (P 0,05). (B), ble bukspyttkjertelen cscs behandlet med og GDC-0449 (0, 1, 5 og 10 mm) i 48 timer. Atom ekstrakter ble utarbeidet og gelshift forsøket ble utført. bare probe, kontroll (uten GDC-0449), og GDC-0449 behandlede prøver (1, 5 og 10 uM), henholdsvis. Dataene er representative for tre eksperimenter. (C), er Gli-avhengig luciferaseaktivitet redusert ved GDC-0499. Bukspyttkjertelen cscs ble transduced med lentiviral konstruere uttrykker Gli avhengig luciferase reporter, og behandlet med GDC-0449 (0, 5 og 10 mm) i 48 timer. Lysater ble fremstilt, og luciferaseaktivitet ble målt. Normalisert luciferaseaktiviteten er presentert som gjennomsnitt ± SD. @ # Eller signifikant forskjellig fra respektive kontroll (P 0,05). (D), hemmer GDC-0449 uttrykk for Gli1 og Gli2 i menneskelige bukspyttkjertelen cscs. Cellene ble sådd ut på fibronektin-belagte dekkglass og behandlet med GDC-0449 (10 mm) i 48 timer. Deretter ble cellene fiksert med 4% para-formaldehyd, blokkert i 10% normalt geiteserum og farget med Gli1 og Gli2 primære antistoffer (1:100) i 16 timer ved 4 ° C og vasket med PBS. Etterpå ble cellene inkubert med fluorescens-merket sekundært antistoff (1:200) sammen med DAPI (1 mg /ml) i 1 time ved romtemperatur, og cellene ble montert og visualisert under et fluorescerende mikroskop. For bedre visualitet, ble fargen DAPI endret fra blått til rødt.
Siden Gli medierer effekten av Hysj, vi neste undersøkte Gli-DNA interaksjon med elektromobilitet shift analyse (EMSA) i menneskelig bukspyttkjertelen cscs. Behandling av cscs med GDC-0449 resulterte i redusert Gli-DNA-bindende aktivitet på en doseavhengig måte (fig. 5B).
neste undersøkt effekten av GDC-0449 på Gli transkripsjonen aktivitet (Fig. 5C ). Eksponering av cscs med GDC-0449 i 36 timer resulterte i inhibering av Gli-avhengig luciferase reporter-aktivitet på en doseavhengig måte. GDC-0449 hemmet uttrykk for Lappet-en og Lappet-2 fordi de er nedstrøms mål for Gli. Vi neste ansatt immunfluorescens teknikk for å undersøke effekten av GDC-0449 om kjernefysisk uttrykk for Gli (Fig. 5D). Bukspyttkjertelen cscs ble behandlet med GDC-0449, og den kjernefysiske uttrykk for Gli1 og Gli2 ble observert. GDC-0449 hemmet atom uttrykk for Gli1 og Gli2. Samlet er disse data tyder på at GDC-0449 kan hemme Gli DNA-bindende og transkripsjonen aktivitet.
Menneskelige bukspyttkjertelen cscs krever aktiv Gli funksjon for vedvarende uttrykket av gener som er involvert i celleoverlevelse og spredning
I for å undersøke effekten av Gli1 og Gli2 på celleproliferasjon, apoptose og nedstrøms mål, hemmet vi uttrykk for Gli1 og Gli2 transkripsjonsfaktorer ved shRNA. Som vist på fig. 6A, lentiviral mediert uttrykk for Gli1 og Gli2 shRNA hemmet uttrykk for Gli1 og Gli2 proteiner i bukspyttkjertelen cscs. Hvis GDC-0449 hemmer celle levedyktighet og induserer apoptose ved å hemme Gli transkripsjonsfaktorer, bør hemming av Gli1 og Gli2 blokkere anti-proliferative og pro-apoptotiske virkninger av GDC-0449. For å bekrefte Gli-avhengige anti-proliferativ og pro-apoptotiske effekter GDC-0449, brukte vi bukspyttkjertelen cscs uttrykker Gli1 + Gli2 shRNA (Fig. 6B). GDC-0449 hemmet celle levedyktighet og indusert apoptose i cscs /egge celler. Hemming av Gli1 og Gli2 alene med shRNA var ikke i stand til å fullstendig hemme effekten av GDC-0449 på CSCs levedyktighet (data ikke vist). Til sammenligning inhibering av Gli1 pluss Gli2 sammen med shRNA trykkes virkningene av GDC-0449 på cellelevedyktigheten og apoptose i cscs. Disse dataene tyder på at både Gli1 og Gli2 gener er nødvendig for anti-proliferative og pro-apoptotiske virkninger av GDC-0449.
(A), Knockout av Gli1 shRNA og Gli2 shRNA i menneskelige bukspyttkjertelen cscs. Bukspyttkjertelen cscs ble transduced med lentiviral partikler som uttrykker Egge, Gli1 shRNA, Gli2 shRNA eller Gli1 pluss Gli2 shRNA (KO). (B), ble bukspyttkjertelen cscs behandlet med GDC-0449 (0, 1, 5 og 10 mm) i 72 timer, og celle levedyktighet og apoptose ble målt i kryptert og Gli1 pluss Gli2 shRNA cscs. Data representerer middelverdi ± SA, n = 4. @ # eller signifikant forskjellig fra respektive kontroll (P 0,05). (C), eggerøre og Gli1 pluss Gli2 shRNA pankreas cscs ble behandlet med GDC-0449 (0 og 10 mm) i 48 timer, og lysatene ble hentet for å bestemme uttrykket av DR4, DR5, PDGFRα, Fas og BCL-2 ved Western blot-analyse. p-aktin ble benyttet som kontroll lasting. (D), Hemming av primære og sekundære kuler med GDC-0449. Bukspyttkjertelen cscs (eggerøre, og Gli1 + Gli2 shRNA) ble sådd i suspensjon og behandlet med GDC-0449 (10 mm) i 7 dager. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble kulene oppsamlet, og dissosiert med Accutase (Innovative Cell Technologies, Inc.). For sekundær kuler ble cellene reseeded og behandlet med GDC-0449 (10 mm) for ytterligere 7 dager. Cellelevedyktigheten ble målt ved trypan blå analyse. Data representerer middelverdi ± SD. @ Eller # signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P . 0,05
Vi neste undersøkte effekten av å hemme Gli uttrykk på nedstrøms målet om SHH veien ved Western blot analyse (figur 6C.). GDC-0449 (10 mm) indusert uttrykk for Fas, DR4 og DR5, kløyvde PARP, og hemmet uttrykket av Bcl-2 og PDGFRα i CSC /egge celler. Det er interessant å merke seg at uttrykket av PDGFRα ble redusert etter GDC-0449 behandling med samtidig økning i Fas. Til sammenligning GDC-0449 hadde ingen signifikant effekt på uttrykket av disse nedstrøms mål for SHH signalveien i cscs /Gli1 + Gli2 shRNA celler.
Vi undersøkte neste effekten av GDC-0449 på primær- og sekundær spheroid dannelse (fig. 6D). GDC-0449 hemmet dannelsen av primære og sekundære kuler i CSC /egge celler. Til sammenligning transduksjon av Gli1 pluss Gli2 shRNA i cscs undertrykte de hemmende effekter av GDC-0449 på grunnskole og videregående spheroid formasjon. Disse data tyder på at GDC-0449 kan hemme pancreatic CSC egenskaper.
Diskusjoner
Vår undersøkelse viser for første gang, regulerer at glattet avhengig terapeutisk middel GDC-0449 cellular overlevelse i menneskelig bukspyttkjertelen cscs. Spesielt GDC-0449 hemmet celle levedyktighet og indusert apoptose i tre bukspyttkjertelkreft cellelinjer og bukspyttkjertelen cscs. I bukspyttkjertelen cscs, GDC-0449 også undertrykt cellen levedyktighet, Gli-DNA-binding og Gli-transkripsjons aktiviteter, indusert apoptose gjennom caspase-3-aktivering og PARP cleavage. Analyse av de molekylære mekanismer for GDC-0449-indusert celledød i cscs viste økt ekspresjon Fas og redusert ekspresjon av PDGFRα, som også regulerer Fas. Videre BCL-2 ble nedregulert mens DR4 og DR5 uttrykk ble økt etter behandling av GDC-0449. Undertrykkelse av både Gli1 pluss Gli2 av shRNA lignet endringene i celle levedyktighet, spheroid formasjon, apoptose og død relaterte genekspresjon observert i GDC-0449-behandlede bukspyttkjertelen cscs. Dermed aktiverte Gli gener undertrykke DRs og Fas uttrykk mens opp regulerende BCL-2 og PDGFRα uttrykk for å hemme Fas. Våre resultater markere den kritiske rollen SHH signalering i menneskelige bukspyttkjertelen cscs og muligheten for målretting Gli1 og Gli2 aktivator funksjoner med GDC-0449 i bukspyttkjertelen kreft stamceller.
SHH signalanlegg hendelser har vært innblandet i tumor celleproliferasjon og overlevelse samt er den molekylære kjennetegn på ulike humane tumor enheter som inkluderer esophageal plateepitelkarsinom, basalcellekreft [38], undergrupper av medulloblastoma [39], prostata kreft [40], tykktarmskreft [41], hjernesvulster [42 ], rabdomyosakrom [43], og brystkreft [44]. Flere linjer av bevis støtter ideen om at SHH signalering er en forutsetning for den økte levedyktigheten til bukspyttkjertelen cscs, slik at blokkering aktiv SHH signale med terapeutiske inhibitor molekyler som GANT-61 (målretting effektorer Gli1 og Gli2) og cyclopamine (målretting SHH reseptor glattet) induserte celledød [45]. Vi har vist at menneskebukspyttkjertelkreft cellelinjer og cscs konsekvent uttrykke ulike komponentene i SHH banen, herunder effektorer (Gli1 og Gli2) og reseptorer (Lappet-en, Lappet-2, og glattes), og viktigst liganden: SHH, noe som tyder , er SHH pathway en av «kjernen» signalveien eller en autokrin måte SHH signalisering i disse cellene. Aktivering av SHH signalkaskade konsekvent induserer Gli familie transkripsjonsfaktorer (Gli1 og Gli2), derav både Gli gener mRNA [46], uttrykt i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer og cscs, sier potensiell involvering av SHH signalisering i menneskelige bukspyttkjertelen kreftutvikling.
Aberrant aktivering av SHH signale er innblandet i mange humane kreftformer. For å identifisere nye terapeutiske mål, har hemming av SHH signale vært forsøkt i flere kreft hos mennesker [11], [41], [45]. Nylig har Gli og SMO antagonister blitt brukt til å oppheve SHH signalisering i kreft hos mennesker (40). Naturlig og syntetisk glattes antagonister som cyclopamine [24] og IPI-926 [11], henholdsvis har hemmet spredning, overlevelse og har anti-tumor funksjoner, som resulterer i opphevelse av SHH signalering. Men i løpet av kliniske studier ulike nivåer av motstand har blitt observert. Farmakologiske stoffer inkludert cyclopamine (11), GDC-0499 og GANT-61 [41] har hemmet overlevelse og antitumor funksjoner i prekliniske modeller for kreft hos mennesker. Gli gener er potensielle medlemmer av SHH sti, som fungerer som nedstrøms formidlere av SHH signalering, og de har regulerende effekt på cellesyklus og apoptose. Derfor ligger en potensiell druggable mål i Gli familie transkripsjonsfaktorer, som er de siste mediatorer av transkripsjonsregulering i SHH signalveien. I denne studien, eksponering for GDC-0449 induserer betydelig cytotoksisitet og apoptose i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler og cscs.
GDC-0449 behandling effektivt redusert Gli-DNA-binding og Gli-transkripsjonen aktivitet i humane bukspyttkjertelen cscs. Disse resultatene antyder at GDC-0449 kan indusere posttranskripsjonelt endringer av Gli genet, som kan peke mot en økning i fosforylering som enten hindre DNA-binding eller destabilisere Gli-DNA kompleks. Post-translasjonelle modifikasjoner av Gli-genet er en viktig mekanisme som regulerer evnen til forskjellige transkripsjonsfaktorer for å inhibere forskjellige gensettene, er involvert i reguleringen av celledød hemming [41], i overensstemmelse med tidligere observasjoner i kreft i bukspyttkjertelen celler konstruert for å uttrykke Gli1 [13 ]. Av spesiell interesse, glattet avhengig GDC-0449 behandling av bukspyttkjertel cscs markant hemmet uttrykk for Shh reseptorer (Lappet-en, Lappet-2 og glattes) og effektorer (Gli1 og Gli2), og dermed viser potensialet for terapeutisk anvendelse for behandling av kreft i bukspyttkjertelen . Det ble tidligere rapportert at GDC-0449 ble identifisert som hemmer av Gli1 transkripsjonen aktivitet, og også opphevet Gli2-mediert transkripsjon [36]. Senere har vi observert at reduksjonen i Gli2 uttrykk forut at av Gli1 i bukspyttkjertelen cscs. Videre har studier på mus viste at Gli2 er primære mediatorer av SHH signalering og er kjent for å transcriptionally regulere Gli1 uttrykk [25]. Fordi SHH signalveien allerede er aktivert i menneskelige bukspyttkjertelen cscs, ble studier med shRNA knockdown av Gli1 og Gli2 alene og samtidig gjennomført. GDC-0449 betydelig hemmet celle levedyktighet og indusert apoptose i shRNA Gli1 og Gli2 alene (data ikke vist). Interessant nok var betydelig beskyttelse fra GDC-0449-indusert cytotoksisitet og apoptose registrert i shRNA knockdown av både Gli1 og Gli2. Disse data understøtter videre den idé som GDC-0449 kan ha Gli-avhengig og-uavhengig virkningsmekanisme (fig. 7) og videre vise betydningen av funksjonelle gener Gli i å opprettholde cellulær overlevelse i humane pankreatiske cscs.
aktivert Gli1 og Gli2, nedstrøms SHH-Lappet-glattet, regulere målene for SHH signale inkludert BCL-2, PDGFRα, Fas, og DRs. GDC-0449 (targeting glattet) blokkerer indirekte funksjoner av Gli aktivatorer, noe som resulterer i celledød.
For å vurdere antiproliferative effekt av GDC-0449 i mer detalj, vi neste korrelert uttrykk for cellesyklus og apoptose relaterte gener med SHH signalisering i bukspyttkjertelen cscs. I flere stamceller og kreftceller, SHH fungerer som en overlevelsesfaktor [9], [47]. SHH er blitt rapportert å kontrollere spredning av flere celletyper gjennom ulike molekylære mekanismer som økning i PDGFRα og Bcl-2 uttrykk, reduksjon i DRS og Fas uttrykk, og inhibering av PARP-spaltning og kaspase-3 aktivering i tykktarmskreftcellelinjer som overuttrykker Gli gener [41] eller, en overekspresjon av dominant-negative FADD i celler som uttrykker SHH eller et konstitutivt aktiv glattet [41]. I vår studie, GDC-0449 indusert en markert økning i uttrykket av Fas og begge DRs (TRAIL-R1 /DR4 og TRAIL-R1 /DR5), noe som tyder på potensialet involvering av disse DRs i narkotika-indusert apoptose. Nylige rapporter viste fravær av Gli bindingsseter i promoterregionen av DR4 og DR5. Reguleringen av DR uttrykk ved Gli er foreløpig ukjent og kan være via en indirekte mekanisme. Men GDC-0449 indusert oppregulering av både DRs i bukspyttkjertelen cscs, noe som tyder på transkripsjonsregulering av DRs av en foreløpig ukjent mekanisme. Vi har også bestemt bidrag fra apoptotiske celledød baner (mitokondrier-mediert indre og død reseptorsignalisering-mediert ytre), basert på den kjente regulering av PDGFRα oppstrøms for Fas [2], [48], og av Bcl-2, som kan være et direkte mål transkripsjonen av både Gli1 og Gli2, en nøkkel anti-apoptotiske protein i SHH-avhengig celleoverlevelse [49]. Vi har vist at GDC-0449 behandling reduserer pro-overlevelse protein Bcl-2 uttrykk i bukspyttkjertelen cscs. Dermed våre data viser at aktivering av SHH veien kan gener involvert i begge celle ytre og celle indre trasé av apoptose regulere.
Sammen denne studien viser at endogen SHH signale kontrollerer selvfornyelse kapasitet på menneskelig bukspyttkjertelen cscs ved å målrette ned-stream mål for Gli. I konklusjonen, kan GDC-0449 brukes til behandling av humant bukspyttkjertelkreft, fordi det kan målrette kreft i bukspyttkjertelen cscs.
Metoder
Antistoffer og reagenser
Antistoffer mot SHH, glattet, ble Fas, TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5, og β-aktin kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California). Antistoffer mot Gli1, Gli2, Lappet-en, Lappet-2, ble PDGFRα og caspase-3 fås fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Forbedret Chemiluminescence (ECL) Western blot gjenkjenning reagenser var fra Amersham biovitenskap Inc. (Arlington Heights, IL). GDC-0449 (Vismodegib; C19H14Cl2N2O3S) ble kjøpt fra Tocris (Ellisville, MO). Alle andre kjemikalier som ble brukt var av analytisk kvalitet og ble kjøpt fra Fisher Scientific (Suwanee, GA) og Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Cell kultur
Kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer ( ASPC-1, PANC-1 og MIA PACA-2) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotisk-antimykotisk ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2. Menneske bukspyttkjertelen cscs (CD133
+ /CD44
+ /CD24
+ /ESA
+) ble hentet fra Celprogen Inc. (San Pedro, California). De ble isolert fra primære tumorer og er blitt beskrevet tidligere [33]. De cscs ble dyrket i DMEM supplementert med 1% N2 Supplement (Invitrogen), 2% B27 Supplement (Invitrogen), 20 ng /ml human blodplatevekstfaktor (Sigma-Aldrich), 100 ng /ml epidermal vekstfaktor (Invitrogen) og ett % antibiotikum-antimykotisk (Invitrogen) ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2. Bukspyttkjertelen cscs ble rutinemessig sjekket av morfologi og vekstegenskaper
Lentiviral partikkel produksjon og Gli1 shRNA og Gli2 shRNA transduksjon
Gli1 shRNA (5′-GCCTGAATCTGTGTATGAA-3. «; 5’GTTTGAATCTGAATGCTAT-3 «; 5′-AGCTAGAGTCCAGAGGTTC-3′, 5»-CCGGAGTGCAGTCAAGTTG-3 «og 5′- GGCTGGACCAGCTACATCA-3′) og Gli2 shRNA (5»- CCGAGAAGCAAGAAGCCAA-3 «, 5′-CACAGCATGCTCTACTACT-3′, 5»-TCGCTAGTGGCCTACATCA
