Abstract
Naturlige produkter representerer en rik reservoar av potensiell liten kjemisk molekyler som utviser anti-proliferative og chemopreventive egenskaper. Her viser vi at behandling av pankreatisk duktus adenokarsinom (PDAC) celler (Panc-1, MiaPaCa-2) med den isokinolin alkaloid berberin (0,3-6 pM) hemmet DNA-syntese og proliferasjon av disse cellene, og forsinke progresjonen av deres cellesyklus i G1. Berberine behandling også redusert (med 70%) vekst av MiaPaCa-2 cellevekst når implantert i flankene av nu /nu mus. Mekanistiske undersøkelser viste at berberin redusert mitokondriemembranpotensialet og intracellulære ATP-nivåer og indusert potent AMPK-aktivering, slik som vist ved fosforylering av AMPK α subenhet ved Thr-172 og acetyl-CoA-karboksylase (ACC) ved Ser
79. Videre berberine doseavhengig hemmet mTORC1 (fosforylering av S6K på Thr
389 og S6 på Ser
240/244) og ERK-aktivering i PDAC celler stimulert av insulin og neurotensin eller kvegfosterserum. Knockdown av α
1 og α
2 katalytisk subenhet ekspresjon av AMPK reverseres den hemmende effekt produsert ved behandling med lave konsentrasjoner av berberin på mTORC1, ERK og DNA-syntese i PDAC celler. Men ved høyere konsentrasjoner, berberine hemmet mitogen signalisering (mTORC1 og ERK) og DNA-syntese gjennom en AMPK-uavhengig mekanisme. Lignende resultater ble oppnådd med metformin anvendt i doser som induseres enten moderat eller markerte reduksjoner i intracellulære ATP-nivåer, som var praktisk talt identisk med reduksjon i ATP-nivåer som oppnås som respons på berberin. Vi foreslår at berberine og metformin hemme mitogen signalisering i PDAC cellene gjennom doseavhengig AMPK-avhengige og uavhengige trasé
Citation. Ming M, Sinnett-Smith J, Wang J, Soares HP, Young SH, Eibl G , et al. (2014) doseavhengig AMPK-avhengige og uavhengige mekanismer Berberine og Metformin Hemming av mTORC1, ERK, DNA syntese og spredning i kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 9 (12): e114573. doi: 10,1371 /journal.pone.0114573
Redaktør: Richard Pearson, Peter MacCallum Cancer Centre, Australia
mottatt: 1 juli 2014; Godkjent: 11 november 2014; Publisert: 10.12.2014
Copyright: © 2014 Ming et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health Grants P01 CA163200, P30 DK4130, R01 DK100405, Department of Veterans Affair Grant 1I01BX001473 og midler fra utrustet Ronald S. Hirsch Chair av kreft i bukspyttkjertelen Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er en ødeleggende sykdom, med samlet 5-års overlevelse på bare 6% [1]. Forekomsten av denne sykdommen i USA er anslått å øke til mer enn 44.000 nye tilfeller i 2014 og er nå den fjerde største årsaken til kreft dødelighet hos både menn og kvinner [2]. Totalt dødsfall på grunn av PDAC er anslått å øke dramatisk til å bli den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall før 2030 [1] Som de nåværende behandlinger tilbyr svært begrensede overlevelses fordeler, nye strategier for å behandle og forebygge denne aggressive sykdommen er raskt behov [3 ].
G-protein-koblede reseptorer (GPCR) og deres beslektede agonister er i økende grad brukt som autokrine /parakrine vekstfaktorer for flere faste tumorer, deriblant småcellet lungekreft, tykktarm, prostata, bryst og bukspyttkjertel [4] – [8]. Vi viste at bukspyttkjertelcancercellelinjer uttrykker flere GPCR [9] og et utvalg av GPCR-agonister, inkludert neurotensin, angiotensin II og bradykinin, stimulerte DNA-syntese i bukspyttkjertelcancercellelinjer, inkludert PANC-1 og MiaPaca-2 [9] – [ ,,,0],12]. Videre, en bredspektret GPCR antagonist [13], [14], hemmet veksten av kreft i bukspyttkjertelen celler enten
in vitro
eller xenopodet inn nu /nu mus [15]. Andre studier vist økt uttrykk for GPCR i kreft i bukspyttkjertelen vev [16] – [19]. Deretter identifiserte vi positive crosstalk mellom insulin /IGFI reseptorer og GPCR signalanlegg i bukspyttkjertelen kreftceller, som fører til mTORC1 alarm og ERK-aktivering, og synergistisk stimulering av DNA-syntese og celledeling [20] – [22]. Disse funnene anta en større betydning i lys av det store antall epidemiologiske studier knytter langvarige type-2 diabetes mellitus (diabetes mellitus type 2), fedme og metabolsk syndrom, karakterisert ved perifer insulinresistens og kompenserende overproduksjon av insulin, med økt risiko for å utvikle kreft i bukspyttkjertelen [23] – [32]
biguanide metformin (1,1-dimethylbiguanide hydroklorid) avledet fra galegine, en phytochemical fra
Galega officinalis, etter er den mest forskrevne legemiddelet for behandling av. diabetes mellitus type 2,
verdensomspennende product: [33], [34]. Systemisk, metformin senker blodsukkeret gjennom redusert hepatisk glukoneogenese, øker glukoseopptak i skjelettmuskulatur og fettvev [34], [35] og reduserer sirkulerende nivåer av insulin og IGF-1 [36], [37]. På cellenivå, metformin indirekte stimulerer AMP-aktivert protein kinase (AMPK) aktivering [38] via hemming av mitokondrienes funksjon, men andre mekanismer av metformin handling er også foreslått ved høye doser [39]. Store nedstrøms mål for AMPK inkluderer TSC2 og Raptor [40] – [43]. Den AMPK-mediert fosforylering av disse målene hemmer mTOR kompleks 1 (mTORC1) i en rekke celletyper, inkludert PDAC celler [44], [45] og forstyrrer positiv krysstale mellom insulin /IGFI reseptorer og GPCR signalsystemer [21], [46]. Interessant, en rekke observasjonsstudier tyder på at metformin reduserer forekomsten og forbedret prognose av en rekke kreftformer hos pasienter med diabetes mellitus type 2 [47], [48], selv om dette denne konklusjonen er under gransking [49]. I innstillingen fra PDAC, diabetespasienter som hadde fått metformin ser ut til å ha lavere justert forekomst og bedre overlevelse sammenlignet med dem som ikke hadde tatt metformin eller brukt andre antidiabetiske midler [47], [50] – [52]. Vi antok at strukturelt relatert naturlige eller syntetiske forbindelser som forstyrrer mitokondrie-mediert ATP syntese og målet mTORC1 og ERK veier, kan gi nye anti-PDAC midler.
Naturlige produkter representerer en rik reservoar av potensielle små kjemiske molekyler utstilling ulike farmakologiske egenskaper. Den isokinolin alkaloid berberin [53] – [55], et plantekjemikalie ekstraheres fra en rekke medisinske planter, herunder planter av
Berberis
art induserer multiple biologiske virkninger, inklusive anti-fedme, anti-diabetisk, anti- kreft og kalori-restriksjons effekter [55] – [62]. Den cellulære mekanismen (e) som er involvert, men forblir ufullstendig forstått. Berberin har blitt rapportert å hemme mitokondriefunksjon og indusere AMPK-aktivering [63], men andre mekanismer er blitt foreslått handling av dette alkaloid når de tilsettes ved høye konsentrasjoner [64], [65]. Til tross for sine potensielle kliniske implikasjoner, er det ingen forståelse for den nøyaktige mekanismen (e) der berberine hemmer spredning av kreftceller, og det er ikke kjent om denne agenten har noen direkte effekt på signalering og spredning av PDAC celler husing
KRAS
mutasjoner, karakteristisk for . 90% av duktale pankreas karsinom
i denne studien, viser vi at kines hemmer DNA-syntese, cellecyklusprogresjonen og spredning i PANC-en og MiaPaca-2 kreft i bukspyttkjertelen celler . Videre hemmer berberine administrasjon veksten av PDAC tumorxenotransplantater
in vivo
så effektivt som metformin. I mekanistiske studier, viser vi at berberine, som metformin reduserer mitokondriemembranen potensial og ATP nivåer og samtidig induserer AMPK aktivering. Basert på resultater ved hjelp av siRNA-mediert knockdown av AMPK, foreslår vi at den hemmende effekten av berberine og metformin formidles gjennom AMPK-avhengige og AMPK uavhengig trasé avhengig av dose av hver agent. Denne konklusjonen gir en plausibel forklaring på tilsynelatende motstridende rapporter om rollen AMPK i virkningsmekanismen til berberine og metformin i andre modellsystemer.
Materialer og metoder
Kjemikalier og reagenser
Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) ble oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Neurotensin, insulin, berberin og metformin ble oppnådd fra Sigma Chemical (St. Louis, MO). Alle antistoffer ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Pepperrot-peroksidase-konjugert anti-kanin-IgG og anti-mus IgG var fra GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ). Alle andre reagenser var av høyeste kvalitet tilgjengelig.
Cells og kultur betingelser
Den menneskelige bukspyttkjertelkreft cellelinjer Panc-1 og MiaPaCa-2 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Disse cellelinjer ble valgt fordi de havn mutasjoner som er typisk for human pankreatisk kreft [66], blant annet aktiverende mutasjoner i KRAS, TP53 (som koder for p53-protein) og CDKN2A (også kjent som p16 eller p16INK4a). Det er faktisk en utmerket korrelasjon mellom punktmutasjon frekvenser i PDAC cellelinjer og primære tumorer [67]. Celler ble dyrket i DMEM supplert med 2 mM glutamin, 1 mM Na-pyruvat, 100 enheter /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 10% CO2 . I forsøkene ble glukosekonsentrasjonen i DMEM justert til 5 mM, et fysiologisk nivå i humant serum.
[
3H] -tymidin inkorporering i DNA
PANC-1 og MiaPaCa -2-celler (1 x 10
5) ble sådd og dyrket i 3,5 cm vevskulturplater i 5 dager i DMEM supplert med 10% FBS. Cellene ble vasket to ganger og inkubert i 24 timer med DMEM inneholdende 5 mM glukose og 1% FBS. For å starte forsøket ble friskt medium inneholdende den angitte konsentrasjon av agonist og /eller inhibitor tilsettes etter vasking to ganger med DMEM (4 kulturer som benyttes for hver betingelse), og deretter ble cellene inkubert i 17 timer og så puls-merket i 6 timer med [
3H] -tymidin (0,25 uCi /ml). Cellene ble fiksert med 5% trikloreddiksyre og vaskes to ganger med etanol. Syre-uløselige bassengene ble oppløst i 0,1 N NaOH med 1% SDS, og radioaktiviteten inkorporert ble tellet i en væske-scintillasjonsteller.
Mitokondriell membranpotensialet
celle-gjennomtrengelige JC-1 fargestoff ( Invitrogen), som utviser potensielle avhengig akkumulering i mitokondriene, ble brukt som en indikator på mitokondriemembranpotensialet. Etter behandling uten eller med berberin eller metformin, ble JC-1 tilsatt til kulturer av PANC-1 eller MIA PACA-2-celler ved 1 ug /ml i 30 minutter. Deretter ble mediet byttet ut med Hanks saltløsning inneholdende 5 mM glukose og cellene ble umiddelbart avbildes med rhodamin og fluorescein-optikk. Bilder ble lagret fra flere synsfelt. Histogrammet analyse trekk ved Photoshop (Adobe) ble anvendt for å måle den gjennomsnittlige røde og vanlig grønn fluorescens intensitet fra ca. 50 celler i et synsfelt. Minst 5 uavhengige felter ble målt i hver tilstand. Resultatene er uttrykt som et gjennomsnitt forhold av rød /grønn fluorescerende intensitet i et enkelt synsfelt (gjennomsnitt ± SEM). Forholdet mellom rød /grønn fluorescens intensitet viser mitokondriemembranen potensial med en redusert ratio indikerer et tap av potensiale.
ATP Bestemmelse
Panc-1 og MiaPaCa-2 celler (5 × 10
4) ble sådd og dyrket i 24 brønners kulturplater i 5 dager i DMEM og 10% FBS. Cellene ble deretter inkubert i 24 timer med DMEM inneholdende 5 mM glukose og 1% FBS. Cellene ble vasket to ganger med DMEM inneholdende 5 mM glukose og inkubert i serumfritt medium i 17 timer i fravær eller nærvær av berberin eller metformin. ATP-nivåer ble bestemt ved hjelp av ildflue luciferase /D-luciferin ATP besluttsomhet Kit i henhold til produsentens protokoll (Life Technologies Grand Island, New York).
knockdown av AMPK nivåene via siRNA transfeksjon
Silencer Velg sirnas ble kjøpt fra Life Technologies (Grand Island, NY) og utformet for å målrette enten menneskelig AMPK
α1 eller menneskelig AMPK
α2. -Celler ble transfektert ved å bruke den omvendte transfeksjon metode. Enten Silencer Velg ikke-måls negativ kontroll eller en blanding av 10 nM AMPK
α1 og 10 nM AMPK
α2 siRNA (AMPKα1, α2 siRNA) ble blandet med Lipofectamine RNAi MAX (Life Technologies Grand Island, NY) i henhold til produsentens protokoll og innført i 24-brønners plater. PANC-1-celler ble deretter sådd ut på toppen av siRNA /Lipofectamine RNAiMAX kompleks med en tetthet på 10
5 celler /well.in DMEM inneholdende 5 mM glukose og 10% FBS. Tre dager etter transfeksjon ble cellene inkubert i 24 timer med DMEM inneholdende 5 mM glukose og 1% FBS. Cellene ble vasket to ganger med DMEM inneholdende 5 mM glukose og inkubert i serumfritt medium i 17 timer i fravær eller nærvær av berberin eller metformin og deretter behandlet som beskrevet i det tilsvarende tall sagn.
Strømningscytometrisk /cellesyklusanalyse
andelen av celler i G
0 /G
1, S, G
2, og M-fasene av cellesyklusen ble bestemt ved strømningscytometrisk analyse. PANC-1-celler (2 x 10
4 celler) ble sådd ut i DMEM inneholdende 2,5% FBS. Etter 24 timer ble kulturene behandlet uten eller med berberin i medium inneholdende 2,5% FBS i 3 dager. Cellene ble så høstet ved trypsinering, sentrifugert ved 1000
g
i 5 minutter og resuspendert i en sluttkonsentrasjon på 10
6 celler /ml i hypotonisk propidiumjodid (PI) oppløsning inneholdende 0,1% natrium-citrat, 0,3 % Trixon-X-100, 0,01% PI og 0,002% ribonuklease A. Cellene ble inkubert i 4 ° C i 30 minutter og analysert på en FACScan (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ved anvendelse av programvaren Cellquest. Ett hundre tusen celler ble samlet for hver prøve. Eksitasjon skjedde ved 488 nm og data ble samlet inn ved hjelp FL2kanalen og analysert ved hjelp av FCS ExpressV3.
Western Blot analyse
løpende kulturer av PANC-en eller Mia Paca-2 celler dyrket på 3,5 cm rettene ble vasket og deretter inkubert i 24 timer med DMEM inneholdende 5 mM glukose og 1% FBS. Cellene ble deretter vasket to ganger med DMEM inneholdende 5 mM glukose og inkubert i serumfritt medium i fravær eller nærvær av berberin, metformin eller A-769 662, som beskrevet i de individuelle eksperimentene. Kulturene ble deretter direkte lysert i 2 x SDS-PAGE-prøvebuffer [200 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2 mM EDTA, 0,1 M Na
3VO
4, 6% SDS, 10% glycerol, og 4% 2-mercaptoethanol], etterfulgt av SDS-PAGE på 10% geler og overføring til Immobilon-P membraner (Millipore, Bille, MA). Western blot ble så utført på membraner inkubert over natten med de angitte antistoffer i fosfat-bufret saltvann (PBS) inneholdende 0,1% Tween-20. De immunreaktive bånd ble påvist med ECL (forbedret chemiluminescence) reagenser (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ). Antistoffene som brukes oppdaget fosforylert tilstand av S6K på Thr
389, S6 hos Ser
240/244 og ERK1 /2 på Thr
202 og Tyr
204, AMPKα på Thr
172, ACC på Ser
79 og Raptor på Ser
792. I tillegg ble det totale nivå av disse proteinene også evaluert. Rutinemessig ble membranene som brukes med fosfo-spesifikke antistoffer strippet og re-blottet med antistoffer som gjenkjenner det totale nivå av det tilsvarende protein. Av og til, stripping og re-blotting av samme membranen var ikke tilfredsstillende for å oppnå både lasting og uttrykk kontroller. I disse tilfellene er det benyttet en separat blot for å vurdere total protein ekspresjon og immunoblottet den opprinnelige membran for andre proteiner (f.eks aktin, S6K, S6, ERK), som vandrer i en annen posisjon i den opprinnelige gel for å verifisere lik belastning.
Cell Proliferation
kulturer av PANC-en og MiaPaCa-2 celler, 3-5 dager etter passering, ble vasket og suspendert i DMEM inneholdende 5 mM glukose. Cellene ble deretter dekomponeres ved to passeringer gjennom en 19-gauge nål inn i en i det vesentlige enkeltcellesuspensjon som bedømt ved mikroskopi. Celleantall ble bestemt ved bruk av en Coulter Counter, og 2 x 10
4 celler ble sådd i 35 mm vevskulturplater i DMEM inneholdende 5 mM glukose og 10% FBS. Etter 24 timers inkubasjon ble mediet fjernet og kulturene ble skiftet til DMEM inneholdende 5 mM glukose uten eller med 3% FBS. Kulturene ble deretter inkubert i en fuktig atmosfære som inneholdt 10% CO
2 ved 37 ° C i 4 dager, og det totale celletall ble bestemt fra et minimum på fire retter per tilstand ved hjelp av en Coulter-teller etter at celleklumper ble inndelt etter passerer cellesuspensjonen ti ganger gjennom en 19- og deretter en 21-gauge nål.
Mus xenografter
Tidlig-passasjen MiaPaCa-2-celler ble høstet, og 2 × 10
6 celler ble implantert i de riktige flankene av mannlige
nu /nu
mus. Den mannlige
nu /nu
mus ble opprettholdt i spesifikk patogen fritt anlegg ved University of California i Los Angeles (UCLA). The UCLA Kanslerens Forsøksdyrutvalget godkjent alle dyreforsøk. Dyrene ble randomisert til kontroll- og behandlede grupper (10 mus per gruppe), og fikk stanset øremerker å tillate identifikasjon. Behandlingen ble startet når tumorene nådde en midlere diameter på 2 mm, og den første behandlingsdagen i begge tilfeller ble betegnet som dag 0. For injeksjon i dyr, metformin (250 mg /kg), berberin (5 mg /kg) eller bærer (kontroll) ble gitt intraperitonealt en gang daglig intraperitoneal (50 ul /mus). Tumor volum (
V
) ble målt ved ekstern caliper hver 4. dag, og det ble beregnet som
V
= 0,52 (lengde × bredde
2). Ved slutten av forsøket ble tumorene dissekert veid og målt. Volumet av de skåret svulster ble beregnet som
V
= 0,52 (lengde × bredde × dybde).
Statistisk analyse
Verdier er gjennomsnitt ± SE. Forskjeller mellom gruppene ble analysert med uparede Student
t
-test.
Resultater
Berberine hemmer DNA-syntese, cellecyklusprogresjonen og celleproliferasjon i PDAC celler
i utgangspunktet bestemmes vi effekten av isokinolin alkaloid berberin på DNA-syntese i PANC-1 og MiaPaCa-2-celler, som er blitt anvendt i stor utstrekning som modeller av PDAC celler. Kulturer av disse celler dyrket i medium inneholdende 10% føtalt bovint serum ble vasket og overført til serumfritt medium i 24 timer. Deretter ble cellene skiftet til medium inneholdende en fysiologisk konsentrasjon av glukose (5 mM), økende doser av berberin og en kombinasjon av insulin (10 ng /ml) og den GPCR agonist neurotensin (5 nM) for å fremkalle potent mitogen krysstalesignalerings [ ,,,0],20], [21], [46]. Behandling med berberin hemmet stimulering av DNA-syntese i en doseavhengig måte i begge PANC-1 og MiaPaCa-2-celler. Ved en konsentrasjon av 3 uM, berberin hemmet DNA-syntese med 82% i MiaPaCa-2-celler og med 76% i PANC-1-celler. Inkorporering av [
3H] -tymidin ble blokkert med 97% i MiaPaCa-2-celler og med 94% i PANC-1 celler som respons på 6 pM berberin (fig. 1 A).
A ble Mia PACA-2 eller PANC-1-celler inkubert uten (
åpne søyler
) eller med 5 nM neurotensin og 10 ng /ml insulin (
stengt stolpene
) i nærvær av økende konsentrasjon av berberin i 17 timer ved 37 ° C før tilsetning av [
3H] -tymidin i 6 timer. Radioaktiviteten inkorporert i syre-uløselige bassenger ble målt i en scintillasjonsteller, som beskrevet i «Materialer og metoder. Verdiene som vises er gjennomsnittet ± SEM oppnådd i 3 uavhengige eksperimenter; B, PANC-1-cellene ble behandlet uten (kontroll) eller med berberin 1.5 uM eller 3 uM i medium inneholdende 2,5% FBS i 3 dager (angitt med forts., FBS, FBS 1,5 Ber og FBS 3 Ber). Cellesyklus ble analysert ved PI-farging og flowcytometri. Lignende resultater ble erholdt i 3 uavhengige eksperimenter. C, enkeltcellesuspensjon av Mia PACA-2 eller PANC-1-celler ble sådd ut på vevskulturskåler med en tetthet på 2 x 10
4 celler pr tallerken. Etter 24 timers inkubasjon ble mediet fjernet, og kulturene flyttet til et medium uten eller med 3% FBS i fravær (åpne søyler) eller nærvær (lukkede søyler) av 3 uM berberin. Kulturene ble inkubert i 4 dager, som beskrevet i «Materialer og metoder». Celletall ble bestemt fra 4 til 6 replikere plater per tilstand ved hjelp av en Coulter Counter. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM av 3 biologiske replikater.
Analysene av [
3H] -tymidin inkorporering ble supplert med flowcytometrisk analyse for å fastslå hvor stor andel av PDAC celler i de ulike fasene av cellesyklusen. Som vist på fig. 1B, eksponering av PANC-1 celler til berberin (1,5-3 pM) induserte en markert økning i den andel av celler i G
1 (fra 61 ± 0,2% i celler med FBS til 79 ± 2% i celler med FBS og berberin) og en tilsvarende reduksjon i andelen av celler som var i S og G
2 /M-fasen av cellesyklus (fra 36 ± 0,1% til 19 ± 0,7%). Disse resultatene tyder på at kines forsinker progresjon av PDAC cellesyklus på G
1.
Vi neste undersøkt effekten av berberine på spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler. Enkeltcellesuspensjoner av enten PANC-1 eller MiaPaCa-2-celler ble sådd ut og inkubert i medium supplert med eller uten 3% FBS i fravær eller nærvær av 3 uM berberin. Behandling med berberin markert hemmet proliferasjon i begge PDAC-celler (fig. 1C) uten å påvirke cellelevedyktighet ved de doser som ble testet (resultatene ikke vist). Tatt sammen resultatene i fig. 1 viser at kines hemmer DNA-syntese, cellecyklusprogresjonen og spredning i kreft i bukspyttkjertelen celler.
Berberine og metformin hemme veksten av en PDAC xenograft i nakne mus
Gitt våre resultater viser hemmende effekter av berberine på PDAC celleproliferasjon
in vitro
, vi deretter bestemt om denne forbindelsen hemmer kreft i bukspyttkjertelen vekst
in vivo
hjelp MiaPaca-2 tumorxenotransplantater i nakne mus. De xenotransplantater ble utledet ved implantering av 2 × 10
6 celler i de riktige flankene av mannlige
nu /nu
mus. Dyrene ble randomisert til kontroll og berberine behandlede grupper (10 mus per gruppe). Berberin ble gitt intraperitonealt en gang daglig i 5 mg /kg i løpet av forsøket. Som vist på fig. 2, administrering av berberin reduserte veksten av MiaPaca-2 celler xenopodet i nakne mus med 70%. De tumorvolumer på slutten av forsøket (dag 29) var 781 mm
3 i kontrollgruppen og 240 mm
3 i berberin behandlede gruppen (p 0,001). Dosen av berberin brukes (5 mg /kg) er 12 ganger lavere enn den LD
50, basert på foreløpige range-responsstudier og tidligere arbeid publisert av andre, [53], [68], [69]. Berberine ble godt tolerert, og ikke påvirke vekten av musene under behandlingen (fig. 2, B). Den hemmende effekten av berberin var sammenlignbar med den som induseres av metformin gitt ved 250 mg /kg (Fig. 2), en dose som induserer maksimal hemmende virkning på tumorvekst PDAC [70]. Faktisk kurvene tilsvarer veksten av MiaPaca-2-transplantater i mus behandlet med berberin eller metformin var praktisk talt superimposable løpet av de første 24 dager (fig. 2, a). På dag 29, metformin var litt mer effektive enn berberine som vurderes av tumorvolumet (p 0,05), men effekten nådde ikke statistisk signifikans (p 0,07) da scoret av tumorvekt (figur 2, B.). Disse resultatene indikerer at berberin hemmer veksten av humane kreft i bukspyttkjertelen celler xenopodet inn i nakne mus med effekt sammenlignbar med den som oppnås med en maksimal dose metformin.
xenotransplantater av MiaPaca-2 ble samlet ved implantering av 2 x 10
6 celler i de riktige flankene av mannlige
nu /nu
mus. Når tumorene nådde en midlere diameter på 2 mm ble dyrene randomisert til kontroll og behandlede grupper (10 mus per gruppe). Berberin ble gitt intraperitonealt en gang daglig i 5 mg /kg i løpet av forsøket. For sammenligning ble metformin gitt intraperitonealt til en annen gruppe av mus ved 250 mg /kg. 1
st behandlingsdagen ble betegnet som dag 0. Kontrolldyr mottok et ekvivalent volum av saltløsning. A, Tumorvolumene ble målt etter 4 dager som beskrevet i «Materialer og metoder». Ved slutten av forsøket (dag 29 ble tumorene fjernet, veiet og målt og tumorvolumet beregnet som
V
= 0,52 (lengde x bredde x dybde). Resultatene er vist i panel B (gjennomsnitt ± . SEM) Behandling av mus med berberin betydelig redusert volum og vekten av tumorene sammenlignet med tumorene fra kontrollgruppen (p. 0,001), som indikert En lignende hemning av tumorvekst ble oppnådd ved administrering av metformin (p .. 0,001) kurvene tilsvarende vekst av MiaPaca-2 transplantater i mus behandlet med berberin eller metformin ble superimposable løpet av de første 24 dager på dag 29, metformin var litt mer effektiv enn berberin som bedømt ved tumorvolum (p 0,05) men forskjellen av effektene mellom disse stoffene ikke nådde statistisk signifikans (p 0,07). da scoret av tumorvekt (fig. 2, B) ved konsentrasjoner brukes, berberine og metformin ble godt tolerert uten åpenbar toksisitet basert på kropps vektendring.
berberine induserer mitokondrie membran depolarisering, reduserer nivåene av ATP og stimulerer AMPK i kreft i bukspyttkjertelen celler
Etter å ha fastslått at berberine hemmer PDAC celleproliferasjon
in vitro
og
in vivo
, vi neste utforsket mekanismene som er involvert. I andre celletyper, blir berberin antatt å hemme kompleks I i det mitokondrielle respiratoriske kjeden [71], [72], noe som resulterer i redusert ATP syntese og samtidig økning i cellulær AMP og ADP som er potente allosteriske aktivatorer av AMPK [73] – [ ,,,0],75]. Fordi det ikke er kjent om berberine har noen effekt på mitokondrienes funksjon i kreft i bukspyttkjertelen celler, vi først undersøkt om dette phytochemical forstyrrer mitokondrienes membranpotensiale i disse cellene. Kulturer av MiaPaCa-2 og PANC-1-celler ble inkubert i fravær eller nærvær av 3 uM berberin eller 1 mM metformin, inkludert for sammenligning. Deretter mitokondriemembranen potensial, en nøkkelkomponent kjøring ATP syntese, ble vurdert ved hjelp av mitokondrie-spesifikke fluorescerende probe JC-1 [76]. Som vist på fig. 3 A, berberine forårsaket et betydelig fall i mitokondriemembranen potensial i MiaPaCa-2 og PANC-1 celler. Effekten var sammenlignbar med den som induseres av metformin (fig. 3 A). Disse resultatene indikerer at berberine, som metformin, mål mitokondrienes funksjon i PDAC celler. Følgelig utsettes for økende konsentrasjoner av berberin eller metformin produserte en markert nedgang doseavhengig i de intracellulære ATP-nivåer i både PANC-1 og MiaPaCa- 2-celler (Fig. 3 B).
A, Kulturer av PANC -1 og MiaPaca-2-celler ble inkubert i fravær eller i nærvær av 3 uM berberin (Berb) eller 1 mM metformin (Met) i 17 timer i DMEM inneholdende 5 mM glukose. Endringen i mitokondriemembranpotensialet ble målt ved bruk av mitokondriemembranpotensialet indikator JC-1. Resultatene er uttrykt som et gjennomsnitt forhold av rød /grønn fluorescerende intensitet i et enkelt synsfelt (gjennomsnitt ± SEM). Minst 5 feltene ble studert i hver tilstand. P-verdier ble bestemt ved hjelp av t-test (Sigmaplot 12.); * P 0,002. B, ble Kulturer av PANC-1 og MiaPaca-2-celler inkubert i fravær eller i nærvær av berberin eller metformin ved de angitte konsentrasjoner i 17 timer i DMEM inneholdende 5 mM glukose og 2,5% FBS. C, Kulturer av PANC-1 (øvre panel) og MiaPaCa-2 (nedre panel) ble inkubert i fravær eller i nærvær av berberin ved de angitte doser i 17 timer. Deretter ble cellene stimulert i 1 time med 5 nM neurotensin og 10 ng /ml insulin og lysert med 2X SDS-PAGE-prøvebuffer. Prøvene ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og immunblotting med antistoffer som gjenkjenner de fosforylerte tilstand av acetyl-CoA-karboksylase (ACC) ved Ser
79. Western blotting for aktin ble benyttet for å bekrefte lik belastning i den samme membranen og en separat gel bekreftet at ekspresjon av total ACC protein ikke ble endret ved noen av behandlingene. D, Kvantifisering ble utført ved hjelp av Multi Gauge V3.0. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SEM; n = 3, fold økning i ACC fosforylering på Ser
79. Inset, fosforylert tilstand av AMPK på Thr
172 på de angitte konsentrasjoner av berberine (mm).
Vi neste fastslått om berberine stimulerer AMPK aktivitet innen intakt MiaPaCa-2 og PANC-1 celler. Lysater av disse cellene ble analysert ved immunoblotting ved anvendelse av antistoffer som gjenkjenner de fosforylerte tilstand av acetyl-CoA-karboksylase (ACC) ved Ser
79, en rest direkte fosforylert av AMPK og brukt som en biomarkør for AMPK aktivitet i intakte celler [75] . Behandling med berberin induserte en markert økning i fosforylering av ACC ved Ser
79 på en doseavhengig måte i begge PANC-1 og MiaPaCa-2-celler (figur 3, C;.. Kvantifisering i figur 3 D). Maksimal effekt ble utløst ved doser 2 mikrometer i begge PDAC celler (figur 3 d.). Videre behandling av MiaPaCa-2 eller PANC-1 celler med berberin induserte en slående økning i fosforylering av AMPK ved Thr
172, resten i kinasedomenet av den katalytiske subenhet (α) av AMPK kritisk for aktivering (Innsett i fig. 3 D). Kollektivt, resultatene viser at kines reduserer mitokondriemembranen potensial og senker intracellulære nivåer av ATP og dermed stimulere AMPK aktivitet i PDAC celler dyrket i medium som inneholder en fysiologisk konsentrasjon av glukose (5 mm).
Berberine hemmer mTORC1 og ERK-aktivering i PDAC celler
aktivering av PI3K /Akt /mTORC1 og MEK /ERK stier spiller en sentral rolle i å stimulere DNA-syntese, cellecyklusprogresjonen og spredning av PDAC celler og er negativt regulert av AMPK [21]. Derfor fant vi ut om berberine hemmer mTORC1 og ERK-aktivering i PDAC celler. Kulturer av MiaPaCa-2-celler ble behandlet med økende doser av berberin og deretter stimulert med en kombinasjon av insulin og neurotensin for å fremkalle positivt krysstale (fig. 4). Som vist på fig.
