Abstract
For å fremme systematisk identifisering av nye gener med viktige funksjonelle roller i kreft i bukspyttkjertelen, har vi utviklet en flertrinns screening strategi for å gi et rasjonelt grunnlag for valg av svært relevant romanen kandidat gener basert på resultatene av funksjonelle høy innholdsanalyser. Arbeidsflyten omfattet tre påfølgende stadier: 1) serie genuttrykk profilering analyser av primære humane bukspyttkjertelen vev, samt en rekke
in vivo
og
in vitro
modeller av kreftrelevante egenskaper for å identifisere gener med iøynefallende uttrykk mønstre; 2) bruk av «reverse transfeksjon rekke «teknologi for storskala parallelized funksjonelle analyser av potensielle kandidat gener i cellebaserte analyser; og 3) valg av enkeltkandidatgener for videre grundig undersøkelse av deres cellulære roller. I alt 14 gener, blant dem åtte fra «druggable» gen-familier, ble klassifisert som høy prioritet kandidater for individuell funksjonell karakterisering. Som et eksempel for å demonstrere gyldigheten av tilnærming, er omfattende funksjonelle data om kandidat genet ADRBK1 /GRK2, som ikke tidligere har vært innblandet i kreft i bukspyttkjertelen, present
Citation. Buchholz M, Honstein T, Kirchhoff S , Kreider R, Schmidt H, Sipos B, et al. (2015) En Multistep Høy innhold Screening tilnærming for å identifisere Novel Funksjonelt Relevante mål gener i kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 10 (4): e0122946. doi: 10,1371 /journal.pone.0122946
Academic Redaktør: Chunhong Yan, Georgia Regents University, USA
mottatt: 23 juli 2014; Godkjent: 30 desember 2014; Publisert: 07.04.2015
Copyright: © 2015 Buchholz et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Datatilgjengelighet: Data har vært avsatt til ArrayExpress database på europeisk senter for Bioinformatikk (EBI). Dataene kan nås på ArrayExpress database (www.ebi.ac.uk/arrayexpress) under følgende deponeringsnummer: Data satt på suit2 metastase modell: E-mtab-3344; Datasett på SPC treatmentof PaTuII celler: E-mtab-3363; Datasett på primære humane bukspyttkjertelen vev: E-mtab-3365; Datasett på Patu-8988s og -t differensiering modell: E-mtab-3366; Datasett på påvirkning av RAS mutanter på TGFB1-indusert fenotype av PANC-1 celler: E-mtab-3364; Datasett på bukspyttkjertelen utvikling: E-mtab-3368; Datasett på Atrå behandling av NB 4 celler: E-mtab-3369; Datasett på apoptoseresistens i CAPAN-1 celler: E-mtab-3370; Datasett på 2D vs 3D kultur. E-mtab-3372
Finansiering: Dette arbeidet ble finansiert delvis av EU FP6 tilskuddet LSHB-CT-2006-018771 (Integrated Project «MolDiag-Paca»), den tyske føderale Kunnskapsdepartementet departementet~~POS=HEADCOMP (BMBF) innenfor rammen av programmet for medisinsk genomforskning (Paca-Net, prosjekt-ID PKB-01GS08 og 01GS08178), den tyske Research Foundation (DFG, gi Bu 1536 /3-1 til MB), og EU FP7 gi no. 602783 (storskala integrerte prosjektet «CAM-pac»). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
INNLEDNING
PDAC er en dødelig sykdom som har en fem-års overlevelse under på 6%, som er den laveste for alle solide svulster [1]. Tidlige symptomer er sjeldne og ukarakteristisk, slik at bare 8% av PDAC tilfeller vil være i en lokal og resectable scenen på diagnosetidspunktet, mens de fleste pasienter vil bli diagnostisert i en avansert, regional (27%) eller fjernt (53 %) trinnet. Siden avansert PDAC er naturlig motstandsdyktig mot de fleste tilgjengelige behandlingsformer, de fleste pasienter dør fire til seks måneder etter diagnose [1].
Pasienter med metastatisk sykdom får systemisk palliativ kjemoterapi, med gemcitabin som standard vare [2]. Mange intetsigende forsøk har blitt gjennomført for å bedre utfallet hos pasienter med metastatisk sykdom ved hjelp av kombinasjoner med gemcitabin-ryggrad. Bare nylig, nye kombinasjon kjemoterapiregimer, slik som FOLFIRNOX [3] oppnådd en betydelig overlevelsesfordel, men på bekostning av betydelig forbedret toksisitet. Flere forsøk med nye målrettet terapi ikke klarte å demonstrere overlegenhet i forhold til gemcitabin alene [4], med tyrosin kinase inhibitor erlotinib å være den eneste målsøkt agens for å vise en mindre, men signifikant overlevelse med 14 dager [5]. Nye metoder for å forbedre levering av legemidler, slik som albuminbundet paclitaxel [6], har blitt utviklet og viser lovende resultater i første forsøk, men vil ave å være begrunnet. Det er derfor et kontinuerlig og stort behov for å identifisere nye konsepter og mål som kan gi nye veier for å kjempe denne sykdommen.
Som for mange andre sykdommer, storskala genom, transcriptomic og, i noe mindre grad, proteomikk analyser har vært medvirkende i å etablere omfattende kataloger av molekyler som er endret i sin struktur og /eller overflod i pankreastumorer (f.eks [7-21]. Langt mindre utviklet er begreper og metoder for å avhøre genet funksjoner i stor skala for å differensiere «driver» forandringer, som direkte bidrar til ondartet transformasjon og tumorprogresjon, fra «passasjer» forandringer, som har minimal eller ingen effekt på tumorbiologi. som en konsekvens av dette, eksempler på vellykket translasjon av kunnskap som genereres fra «omics» tilnærminger til roman kliniske konsepter og programmer er få og knappe.
Vi beskriver her en flertrinns strategi for å omgå dette problemet ved å gi et rasjonelt grunnlag for valg av svært relevante nye kandidatgener basert på resultatene av funksjonelle høyt innhold analyser . For dette formål, arbeidsflyten av studien omfattet tre forskjellige stadier: 1) serie genuttrykk profilering analyser av primære humane bukspyttkjertelen vev, samt en rekke
in vivo Hotell og
in vitro
modeller av bukspyttkjertelen utvikling, celledifferensiering, invasjon, metastasering, apoptose motstand etc. ved hjelp av tilpassede matriser av fokuserte cDNA samlinger for å identifisere gener med iøynefallende uttrykk mønstre; 2) bruk av «reverse transfeksjon rekke» -teknologi [22,23] for storskala parallelized funksjonelle analyser av kandidatgener valgt fra trinn 1 i cellebaserte analyser utført i objektglass rekke format; og 3) utvalg av individuelle kandidat gener som viser relevante funksjonelle effekter i parallelized analyser for videre grundig undersøkelse av deres cellulære roller. Som et eksempel for å demonstrere gyldigheten av denne tilnærmingen, omfattende data om tidligere ukjente funksjonene til en kandidat gen valgt gjennom denne prosessen (ADRBK1 /GRK2) i kreft i bukspyttkjertelen celler er presentert.
Hele arbeidsflyten av flertrinns genet utvalg /karakterisering prosessen er skjematisk skissert i figur 1.
Materiale og metode
cDNA rekke produksjon og hybridisering
produksjon av cDNA arrays, utvinning og radioaktiv merking av total RNA, samt hybridisering og kvantifisering av hybridiseringssignaler ble utført som tidligere beskrevet [24,25]. I korte trekk, cDNA ble PCR forsterket og kledd i to eksemplarer på nylonmembraner ved hjelp av robot-enheter.
Total RNA revers transkribert og radiactively merket med 33P-dATP bruker StripEZ-RT Kit (Ambion) og hybridisert over natten til nylon membran arrayene i ULTRArray hybridiseringsbuffer (Ambion) ved 50 ° C. Radioaktive signaler ble oppdaget ved hjelp av en STORM fosfor bildesystem (Amersham Biosciences, Feiburg, Tyskland) og kvantifisert med ArrayVision programvare (InterFocus, Haverhill, Great Britain). Signalintensiteter ble normalisert til den midlere signalintensiteten av alle funksjoner på en individuell rekke
gener ble definert som uttrykt forskjellig mellom to sett av prøver hvis:. (1) den midlere normaliserte uttrykk verdi overskrides 0,5 i minst ett av de to prøvesettene, (2) at forskjellen mellom de gjennomsnittlige normaliserte uttrykk verdier var minst dobbelt mellom prøvesettene og (3) en tosidig t-test ga en p-verdi på mindre enn 0,05.
Raw data av alle eksperimenter kan nås på https://www.staff.uni-marburg.de/~buchhol3/RevTrans/
følgende genuttrykk profilering eksperimenter av vev og
in vivo /in vitro
modeller for serie karakterisering av kandidatgener ble gjennomført.
Primære menneskelig vev
totalt 16 kliniske prøver fra duktalt adenokarsinom, 6 prøver fra kronisk pankreatitt, og 4 prøver fra morfologisk normale reseksjonskanten fra kronisk pankreatitt resectates ble analysert. Prøvene ble levert av operasjonsavdelingen ved Universitetet i Ulm (Tyskland) samt patologi avdeling ved Universitetet i Kiel (Tyskland). Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter før du bruker vevsprøver. Studien ble godkjent av de lokale etikkomiteer ved universitetene i Ulm og Kiel (Ethikkommission der Universität Ulm, Ethikkommission der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel)
Pancreas Development
Total RNA.. fra normale voksne mennesker bukspyttkjertel og foster menneskelige bukspyttkjertelen ble kjøpt fra Clontech. Hver samleprøve ble uavhengig merket og hybridisert 3 ganger.
ATRA behandling av NB4-leukemiceller.
for akutt leukemi-avledet cellelinje, NB4 [26], ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO2 i et RPMI-medium supplert med 2 mM L-glutamin og 10% dekomplementert føtalt kalveserum. Celler ble dyrket i 48 timer med eller uten 1 mM All-trans retinsyre (ATRA; Sigma-Aldrich). Duplikater av 3 uavhengige eksperimenter ble analysert.
SPC behandling av Patu II celler.
Sphingosylphosphorylcholine (SPC) er et bioaktivt lipid med flere biologiske roller, inkludert regulering av differensiering i embryonale celler og kreftceller. PATU II pankreatisk kreft celler ble opprettholdt i DMEM (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% (v /v) serum føtalt bovint (PAA, Pasching, Østerrike) i en fuktet atmosfære og 5% CO2, 95% luft ved 37 ° C. Celler ble inkubert med 15 pM SPC i serumfritt medium fpr 2 timer eller ubehandlet. Duplikater av 3 uavhengige eksperimenter ble analysert.
2D vs 3D-cellekulturer.
bukspyttkjertelkreft cellelinje A818-1 ble dyrket enten i 2D monolag eller i 3-dimensjonale «hule kuler» som beskrevet [27]. Total RNA ble ekstrahert fra 3 uavhengige eksperimenter og analysert i duplikat.
Patu-8988s og-t differensiering modell.
Patu-8988s og Patu-8988t er to cellelinjer som ble avledet fra samme levermetastaser fra en human primær pankreatisk adenokarsinom, men varierer i deres differensiering status og metastatisk kapasitet [28]. Den dårlig differensiert cellelinje Patu-8988t ble transfektert med en E-cadherin uttrykk konstruere eller vektor kontroll, henholdsvis, og individuelle kloner analysert ved uttrykk profilering. I tillegg ble 3 uavhengige preparater av villtype Patu-8988s celler analysert.
suit2 metastase modell.
S2-007 og S2-028 er cellelinjer som stammer fra samme primær bukspyttkjertelen adenokarsinom , men displying sterke forskjeller i deres invasive og metastatiske potensial både in vitro og in vivo [29]. Tre uavhengige preparater av hver av de høyt metastatisk S2-007 og den lave metastatisk S2-028 cellelinje dyrkes i cellekultur 2D (DMEM (Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% (v /v) føtalt bovint serum (PAA , Pasching, Østerrike) i en fuktet atmosfære og 5% CO2, 95% luft ved 37 ° C), ble analysert ved ekspresjonsanalyse.
Apoptose-resistens i CAPAN-1-celler.
Pankreas kreftceller er i seg selv svært motstandsdyktig mot spontan eller kjemoterapi-indusert apoptose. Den menneskelige bukspyttkjertelen tumor cellelinje CAPAN-en (pRB + /p16-) ble stabilt transfektert med p16 uttrykk konstruerer eller kontroll plasmider som beskrevet [30] til funksjonelt inaktivere pRB. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og analysert i duplikat.
Influence of RAS mutanter på TGFB1-indusert fenotype av PANC-1 celler.
Vi har tidligere beskrevet uttrykk profilering av påvirkning av RAS mutanter på den TGFB1-induserte fenotypen til bukspyttkjertelkreft cellelinje PANC-1 [24]. I korte trekk, PANC-1 celler stabilt transfektert med en dominant negativ HRAS (S17N) mutant, en konstitutivt aktiv KRAS2 (G12V) mutant, eller uekte transfektert med en EGFP uttrykk konstruere ble behandlet med TGFB1 eller venstre ubehandlet, henholdsvis. Tre uavhengige eksperimenter som hver ble analysert i duplikat.
Cellelinjer for parallelized og individuelle funksjonelle analyser
Panc-1 [31] og HEK-293 [32]-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, USA). S2-007 og S2-028 var fra T. Iwamura [33] (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japan). IMIM-PC1 celler ble vennlig levert av F.X. Ekte [34] (CNIO, Madrid, Spania).
Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% FBS og 0,05 mg /ml Gentamicin ved 37 ° C og 5% (v /v ) CO2.
Omvendt transfeksjonsteknologier arrays
Full lengde åpne leserammer (ORF) av alle kandidat og kontrollgener ble kjøpt som cDNA kloner fra Åpne Biosystems (Lafayette, CO, USA), PCR amplifisert ved bruk av spesifikke primere og klonet inn i pENTR vektoren (Invitrogen /Life Technologies, Darmstadt, Tyskland). ORF ble deretter transportert inn i pdECFP og pdEYFP ekspresjonsvektorer [35] med Gateway kloning system (Invitrogen /Life Technologies, Darmstadt, Tyskland). Hver ORF ble derfor tilgjengelig som en N-terminal fusjonskonstruksjon med cyan fluorescerende protein (CFP), så vel som en C-terminal fusjon med konstruere gul fluorescerende protein (YFP).
For produksjon av «omvendt transfeksjonsteknikker mikromatriser « , uttrykk konstruerer ble oppdaget på glassplater i henhold til en protokoll modifisert fra [22]. 4 ug av hvert plasmid-DNA ble blandet med 11 ul PBS, og 2 ul Lipofektamin 2000 (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) i en 96-brønners cellekulturplate. Etter 20 min inkubasjon ved romtemperatur ble 15 ul gelatin (0,1% i PBS) tilsatt hver brønn. Transfeksjon blandinger ble kledd på Superfrost Plus glass (Menzel GmbH, Braunschweig, Tyskland) ved hjelp av en Tecan Miniprep 75 automatisert prøve prosessor (Tecan, Männedorf, Sveits), genererer spot størrelser med diameter 0,5-1,5 mm. Objektglassene ble tørket og lagret opp til 3 uker i en tørr atmosfære ved 4 ° C. For generering av levende celle mikromatriser, ble lysbilder plassert i quadriPERM plater (Sarstedt, Nümbrecht, Tyskland), sådd med 4,5 x 10
5 HEK-293, 4 x 10
5 Panc-en, eller S2-007: 5 x 10
4 S2-007 i DMEM /10% FCS og inkubert i 48 timer ved 37 ° C.
Immunocytochemistry
Levende celle mikromatriser ble løst for 15-30 min på romtemperatur med 4% paraformaldehyd i PBS-løsning og motfarget og monteres ved hjelp av DAPI-inneholdende monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, USA). Uttrykk av fusjonskonstruksjonene og subcellulære lokalisering av genprodukter ble dokumentert ved hjelp av en Zeiss Axiovert 200 fluorescens mikroskop (Carl Zeiss GmbH, Göttingen, Tyskland). Der det er aktuelt, optiske deler av fluorescerende prøver ble produsert ved 630x forstørrelse ved bruk av Zeiss ApoTome teknologi (https://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/apotome-2-for-biology.html).
Antibody inkubasjon og påvisning ble utført i henhold til produsentens instruksjoner for de enkelte antistoffer, henholdsvis. De følgende antistoffer ble anvendt:
anti-Ki67: 1: 400, polyklonalt kanin, ab833, Abcam, Cambridge, UK
anti-Cyclin B1: 1: 100, monoklonalt mus, katt. # 4135, Cell Signaling Technology, Danvers, USA
anti-ACTIVE-Casapse-3: 1: 150, polyklonale kanin, katt. # G7481, Promega, Madison, USA
anti-vimentin: 1: 200, monoklonalt mus, ab28028, Abcam, Cambridge, UK
anti-E-cadherin: 1: 100, monoklonalt muse , katt. # 610181, BD Biosciences, Sparks, USA
anti-kanin IgG (Cy3) 1: 500, polyklonale geit, ab6939, Abcam, Cambridge, UK
anti-mus IgG (Cy3) 1 : 500, polyklonale geit, ab97035, Abcam, Cambridge, UK
mRNA isolert og protein utvinning
RNA isolering ble utført ved hjelp av peqGOLD Total RNA Kit (peqlab Bioteknologi GmbH, Erlangen, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Konsentrasjoner ble kvantifisert med Nanodrop ND-1000 (peqlab Bioteknologi GmbH) etterfulgt av syntese av første-cDNA fra en mikrogram total RNA bruker Omniscript Kit og protokoll (Qiagen, Hilden, Tyskland).
For total protein ekstraktene ble cellene sentrifugert i kulturmedium (13 000 rpm, RT, 5 min). Pelletene ble resuspendert i PBS, supplert med proteinase inhibitor (G-Biosciences, Maryland Heights, USA) og ultralydbehandlet med en Labsonic U (B.Braun, Melsungen, Tyskland). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med Bradford protein assay og målt med Multiskan FC fotometer (Thermo Scientific, Langenselbold, Tyskland).
QRT-PCR og immunoblotting
Første tråd cDNA ble forsterket i 7500 Fast real-Time PCR System (Applied Biosystems, Warrington, USA) ved hjelp av Power SYBR Grønn Master Mix (Applied Biosystems) og spesifikke primerpar utformet med PrimerExpress program (Applied Biosystems, for sekvenser se supplerende materiale).
for Western blot, ble 10 ng av det totale proteinekstrakter lastet og separert ved 10 eller 15% SDS-PAGE. Separerte proteiner ble overført på en nitrocellulosemembran (Whatman GmbH, Dassel, Tyskland) og blokkert i 4-6 timer ved 4 ° C i 1xTBS, 0,1% Tween 20 og 5% melkepulver. Primære antistoffer ble fortynnet 1: 1 000 i blokkeringsbuffer og inkubert over natten ved 4 ° C. TBS-T (0.1%) ble anvendt som vaskebuffer. HRP-konjugert geite-anti-kanin-sekundært antistoff ble fortynnet til 1:10 000 og inkubert i 1-2 timer ved 4 ° C i blokkeringsbuffer. Proteiner ble påvist ved hjelp av ECL immunoblot kit (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Tyskland).
Anleggs og analyse av microarray
For bygging av microarray (TMA), 1 mm ( tumor) og 1,5 mm (normalt vev) store vev biopsier ble hentet fra parafin giver blokker og overført til pre-stansede hull på mottakerparafinblokker med en vev microarrayer (Beecher Instruments, Inc., Sun Prairie, USA) utstyrt med en TMA booster (Alphelys, Plaisir, Frankrike). Grid oppsett for tumor og normal bukspyttkjertelen vev TMA ble utformet med TMA Designer to programvare (Alphelys). Mottaker blokkene ble forseglet i 10 minutter ved 56 ° C og 30 minutter ved 4 ° C. Denne prosedyren ble gjentatt to ganger. De TMA blokker ble skåret i 3,5 mikrometer seksjoner og plassert på Superfrost Plus lysbilder for immunhistokjemisk farging. Bruken av menneskelig vev for forskningsformål ble godkjent av lokale etikkutvalg ved Universitetssykehuset, Tübingen (470 /201BO1), og Klinikk for kirurgi, Universitetet i Heidelberg, Tyskland (301/2001).
Immunhistokjemisk farging var utføres med en mus monoklonalt anti-ADRBK1 antistoff (Thermo Fischer, # MA5-15840, 1: 1000 fortynning) på Ventana BenchMark XT system (Ventana Medical Systems, Tucson, USA) inkludert deparaffinization av formalinfiksert parafin vevssnitt og varmeinduserte antigen-henting.
Analyse av fargeintensitet ble utført av en patologer med kompetanse i pankreastumorer (BS) i blindt om kreft parametere. Andelen av de positive celler som viser en betydelig flekker i tumor områder ble anslått i prosent og delt inn score (1-10% -weak, 11-50% -Moderat, 50% -kraftig
Transfeksjon. av siRNAs
for RNAi-mediert stanse av ADRBK1 uttrykk, pre-designet Silencer sirnas (Applied Biosystems /Ambion, Austin, TX, USA) ble transfektert i en konsentrasjon på 40 nmol bruker siLentFect Lipid Reagens (Bio- Rad, München, Tyskland). Accell ikke-måls siRNA # 1 (Thermo Fisher Scientific, Dharmacon Produkter, Lafayette, LA, USA) ble ansatt som ikke-tie kontroll.
spredning og levedyktighet analyser
for BrdU innlemmelse analyser ved hjelp av Cell Proliferation ELISA Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), 5 000 til 7 500 celler ble reseeded 24 timer etter transfeksjon inn en ViewPlate-96 Svart cellekultur plate (Perkin Elmer, Waltham, MA , USA). etter dyrkning over natten ble cellene inkubert 4-6 timer med BrdU inneholdende medium. etter fiksering i 1 time, ble cellene farget i 1,5 timer med peroksydase-konjugert anti-BrdU-antistoff, kjemiluminescens-substrat ble tilsatt og den utsendte lys kvantifisert med en Centro LB 960 luminometer (Berthold Technologies GmbH, Stuttgart, Tyskland).
For MTT-analyser, 20 000 til 25 000 celler ble reseeded 24 timer etter transfeksjon i 24-brønners cellekulturplater. Etter ytterligere dyrking i 24 timer eller 48 timer ble supernatanten erstattet med MTT-holdige medium (tiazolyl blå, Carl Roth GmbH) og platene ble inkubert i 2 timer ved 37 ° C. Mediet ble erstattet med oppløsning-løsning (10% Triton-100, 0,1 M saltsyre i 2-propanol). Ekstinksjon ble målt ved 570 nm med en Multiskan FC fotometeret (Thermo Scientific, Schwerte, Tyskland).
Strømningscytometri
trypsinert celler ble sentrifugert ved 1200 rpm i 3 min. Etter vasking med PBS, ble pelletene grundig resuspendert i 50-100 pl PBS, og cellesuspensjonen overført dråpevis til is-kald etanol (70%) under kontinuerlig risting. Etter sentrifugering ved 1 000 g i 5 minutter, supernatanten ble forsiktig fjernet, pelleten ble vasket med 500 ul iskald PBS og resuspendert i 500 ul av propidium-jodid blanding (1 mg /ml propidium-jodid (Sigma Aldrich) + 500 ug /ml DNAse-fri RNase (Roche Diagnostics) i PBS). Prøvene ble inkubert i 30-45 min ved RT i mørket og deretter målt med flowcytometer LSR II (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland). For dataanalyse, ble programvaren ModFit LT (Verity Software House, Topsham, USA) brukes.
RESULTATER
Serie karakterisering av PDAC kandidat gener ved uttrykket profilering hjelp cDNA array-hybridiseringer, dataanalyse og valg av kandidat gener
Som et første skritt i en systematisk identifisering av nye funksjonelt relevante kandidat gener i kreft i bukspyttkjertelen, produserte vi tilpassede cDNA arrays med kreft i bukspyttkjertelen spesifikke cDNA klone samlinger (n = 468 fra [7] og [36]) som ble ytterligere forsterket med store samlinger av cDNA kloner (n = 1492) fra potensielt relevante genfamiliene som kinaser, fosfataser, serumresponsgener etc. (se datasett i tilleggsinformasjon for detaljer om tabell komposisjoner ). Disse matriser ble deretter anvendt for genekspresjon analyser av primære humane pankreatiske vev, samt en rekke
in vivo
og
in vitro
modeller for bukspyttkjertel utvikling, celledifferensiering, invasjon, metastaser, apoptose motstand etc. (merk at siden cDNA klone samlinger for generering av arrays ble stadig utvidet i løpet av disse studiene, ikke alle cDNA ble hybridisert med alle eksperimentelle modeller). For å bli valgt for ytterligere funksjonell karakterisering, kandidatgener måtte bli betydelig deregulert i kreft i bukspyttkjertelen (overexpressed eller nedregulert i grunnskolen kreft i bukspyttkjertelen vev sammenlignet med kronisk pankreatitt og normal bukspyttkjertel prøver), samt vise betydelig regulering i minst én av de funksjonelle modellsystemer (se Material Metoder seksjon for detaljer om hybridisering signal kvantifisering og definisjon av differensial uttrykk).
Denne rå liste over potensielle kandidat gener ble manuelt kuratert å utelukke gener som tidligere hadde blitt intensivt studert i bukspyttkjertelkreft, så vel som inkluderer alle uttrykt sekvens koder (samle såkalte) fra bukspyttkjertelkreft-spesifikk cDNA samling som viste homologi med utilstrekkelig annoterte humane gener. Ved hjelp av disse kriteriene, ble totalt 50 gener som er valgt for parallelized funksjonell karakteristikk (se nedenfor). Denne listen ble utvidet med 17 kandidatgener som hadde vist Panin-spesifikke uttrykk mønstre i våre tidligere analyser av microdissected prøver av normale kanaler samt forstadier til kreft og kreft lesjoner fra menneske pankreata [11]. Til slutt ble det et utvalg av 14 kjente gener med ulike cellulære funksjoner lagt til som positive kontroller for de funksjonelle analyser. Den fullstendige listen over utvalgte kandidat og kontrollgener er gitt i S1 Table (tilleggsinformasjon).
Parallelized cellebaserte analyser
For å raskt screene for funksjonelle effekter av alle 67 kandidat gener i parallelle, ekspresjonskonstruksjoner av kandidatgener, så vel som 14 kontrollgener med kjente funksjoner ble klonet i form av N-terminale fusjoner med cyan fluorescerende protein (CFP), så vel som C-terminale fusjoner med gul fluorescerende protein (YFP). Den plasmid DNA, kompleks med transfeksjon reagenser, var kledd på standard mikrosglass og kledde med suspensjoner av kreft i bukspyttkjertelen celler (Panc-1, S2-007) eller ikke-transformerte kontrollceller (HEK-293). Under en fluorescens mikroskop, ble flekker av transfekterte celler lett identifiseres på grunn av de spesifikke fluorescerende signaler om CFP eller YFP fusjonsproteiner, som også tillatt direkte sammenligning med nabo ikke-transfekterte celler.
De omvendte transfeksjonsteknologier arrays var da utnyttes for parallelized funksjonsanalyser for å identifisere nye kandidatgener med potensielt viktige funksjoner i kreft i bukspyttkjertelen celler. I en første runde av evalueringen, subcellulære lokalisering av genproduktene (så vel som den generelle morfologi sammenlignet med ikke-transfekterte celler), både i nærvær og fravær av serum, ble registrert og sammenlignet mellom kreft og kontrollcellene (se fig 2 etter eksempler på ulike lokaliseringer). I etterfølgende analyser, ble rekker av fikserte celler inkubert med antistoffer mot veldefinerte markører for apoptose (spaltet caspase-3), proliferasjon (Ki-67, syklin B) og epitelial-mesenchymale transdifferensiering (EMT; mesenchymale markør vimentin, epitelial markør E -cadherin). Eksempler på farge resultatene vises i figur 3. Frekvens og intensitet av farging ble registrert, visuelt scoret og sammenlignet mellom transfekterte og ikke-transfekterte celler. Regelmessige forskjeller mellom transfekterte og ikke-transfekterte celler ble gradert som «++» (sterke effekter), «+» (moderat men reproduserbare effekter) og «(+)» (svake og /eller variable effekter). Tabell 1 lister opp alle genene for hvilke minst en score på «++» eller minst tre score til «+» ble registrert i uavhengige gjentatte forsøk og som ble således definert som egnet for individuelle inngående analyser. De utvalgte kandidatene består 3 kinaser (ADRBK1, FASTK, PRKCZ), 3 fosfataser (PPM1G, PPP2R1A, PPP2R4), 2 transkripsjonsfaktorer (FRA-2, GTF2F2), 2 aktin-samspill proteiner (CFL1, RRAS), en trans protein ( TM4SF1), en histon methyl transferase (SUV39H1), en G-protein-koblet reseptor (EBI2) og en interferone-induserbar protein med ukjent cellular funksjon (IFI27). Ingen av dem hadde vært assosiert med kreft i bukspyttkjertelen på den tiden de ble inkludert i revers transfeksjonsandeler arrays.
vises er CFP (A) eller YFP (B-C) fusjonskonstruksjonene. Etter transfeksjon og fiksering av celler på omvendt transfeksjon mikromatriser, ble dekk påføres med DAPI holdig monteringsmedium. For CFP fusjonsproteiner, er DAPI signaler vist i brun (falske farger) for å gi passende kontrast (A). Vist er eksempler på rent cytoplasma (A), uniform atom cytoplasma (B) og rent kjernelokaliserings (C) samt lokalisering til endosomet-lignende strukturer (D). Originale forstørrelser er angitt i bildene
A:. Caspase-tre flekker (Cy-3, rød), HEK-293 celler transfektert med H1F0-YFP (grønn); B: Ki-67 farging (Cy-3, rød), HEK-293 transfektert med NKX2-5-YFP (grønn); C: cyclin B farging (Cy-3, rød), PANC-en transfektert med PRKCZ-YFP (grønn); D: vimentin farging (Cy-3, rød), PANC-en transfektert med FASTK-YFP (grønn); E: E-cadherin farging (Cy-3, rød), PANC-en transfektert med PPP2R1A-YFP (grønn). Originale forstørrelser er angitt i bildene.
Funksjonell validering /grundig individuell karakteristikk av kandidat genet ADRBK1
Som en proof-of-concept å bekrefte gyldigheten av funksjonelle data innhentet via parallelized cellebaserte analyser, viser vi exemplarily detaljert
in vitro
funksjonelle karakterisering data av ett gen, ADRBK1, som var det første genet (i alfabetisk rekkefølge) på listen over prioriterte kandidater (tabell 1). Detaljert
in vivo Hotell og
in vitro
karakterisering av andre kandidatgener opp til generering av genetiske konstruerte musemodeller er enten i pressen eller i forberedelse og vil bli rapportert andre steder.
subcellulære lokalisering av ADRBK1 /CRK2 protein.
ADRBK1 (Adrenerge, Beta, Receptor kinase 1), også kjent som GRK2 (G-proteinkoblet reseptor kinase 2) ble opprinnelig inkludert i cDNA arrays som medlem av kinase-genet familien, som representerer ideelle druggable målgener. Det ble funnet å være overuttrykt i PDAC under serie uttrykk profilering eksperimenter. I den omvendte transfeksjon array-eksperimenter, var ADRBK1 /CRK2 vist markerte forskjeller i subcellulære lokalisering avhengig av tilstedeværelse eller fravær av serum (cytoplasmisk lokalisasjon i nærvær, kjernefysiske og cytoplasmisk lokalisering i fravær av serum). Tradisjonelt ( «forward») transfeksjon av ADRBK1 fusjonskonstruksjonene i Panc1 celler bekreftet denne observasjonen, viser de forventede fluorescerende signaler i kjernen utelukkende i serum fratatt celler 24 timer etter transfeksjon (figur 4A og 4B). Interessant, etter lengre inkubasjonstider, var det en sterk tendens for at signalet skal forskyves mot kjernen uavhengig av tilstedeværelse eller fravær av serum (figur 4C og 4D), muligens indikerer en rolle av ADRBK1 i cellenes reaksjon til nedbryting av næringsstoffer og /eller vekstfaktorer.
ADRBK1-YFP fusjonskonstruksjonene (grønne signaler) ble transfektert inn i dyrkede Panc-1 celler dyrket i fravær (A, C) eller nærvær (B, D) på 10% serum . Etter 24 eller 48 timer av inkubasjon ble cellene fiksert og motfarget med DAPI (blå signaler). Etter 24 timer, ADRBK1-YFP signaler påvisbare i begge, cytoplasma og kjerner, av celler dyrket uten serum (A), mens kjerner av celler dyrket med serum var blottet for YFP fluorescens (B). I motsetning til dette, etter 48 timer med inkubering, celler dyrket under disse tilstandene viste fremtredende farging av kjerner (C, D). https://www.staff.uni-marburg.de/~buchhol3/RevTrans/:
doi:10.1371/journal.pone.0122946.s001
(XLS)
S2 Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Kreft statistikk. CA Cancer J Clin. Cancer Res. Am J Pathol. Cancer Res. Cancer Res. JAMA. Cancer Res. Cancer Res. J Natl Cancer Inst. Int J Cancer. Cancer Res. Cancer Res. Cancer Res.
