Abstract
Acetylsalisylsyre (aspirin) er svært effektiv for behandling av tykktarmskreftpasienter postdiagnosis; imidlertid virkningsmekanismer av aspirin i tykktarmskreft ikke godt definert. Aspirin og hovedmetabolitten natriumsalicylat indusert apoptose og redusert tykktarmskreftcellevekst og natriumsaltet av aspirin også hemmet tumorvekst i en atymiske nakne mus xenograft modell. Colon kreft celle vekst hemming ble ledsaget av nedregulering av SP1, SP3 og SP4 proteiner og redusert uttrykk for Sp-regulerte genprodukter inkludert BCL-2, survivin, VEGF, VEGFR1, cyclin D1, c-MET og p65 (NFkB). Videre viste vi også av RNA interferens som p-catenin, et viktig mål av aspirin i noen studier, er en Sp-regulert gen. Aspirin indusert atom caspase-avhengig spalting av SP1, SP3 og SP4 proteiner og dette svaret var knyttet til lagring av sinkioner siden tillegg av sinksulfat blokkert aspirin-mediert apoptose og undertrykkelse av Sp proteiner. Resultatene viser en viktig underliggende mekanisme for virkningen av aspirin som et anticancermiddel, og basert på den raske metabolisme av aspirin for å salicylat hos mennesker og de høye salicylat /aspirin-forhold i serum, er det sannsynlig at den anticancer aktivitet av aspirin er også skyldes til salicylate metabolitten
Citation. Pathi S, Jutooru jeg, Chadalapaka G, Nair V, Lee SO, Safe S (2012) Aspirin Hemmer Colon Cancer Cell og tumorvekst og nedregulerer spesifisitet Protein (Sp) transkripsjonsfaktorer . PLoS ONE 7 (10): e48208. doi: 10,1371 /journal.pone.0048208
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 09.08.2012; Godkjent: 24 september 2012; Publisert: 26 oktober 2012
Copyright: © 2012 Pathi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health (R01 CA136571) og Texas AgriLife Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Acetylsalicylsyre, eller aspirin er et ikke-steroid anti-inflammatorisk medikament (NSAID) er mye brukt for behandling av smerte, feber og andre inflammatoriske tilstander [1] og rollen til aspirin og andre NSAID i kreft har blitt omfattende undersøkt [2], [3]. Aspirin bruk er forbundet med redusert risiko for kolorektal, bryst, øsofageal, lunge, mage og eggstokk-kreft, og aspirin er både en Kjemopreventivt og kjemoterapeutisk middel for brystkreft og tykktarmskreft [4] – [8]. En fersk rapport om chemopreventive effekten av aspirin viste at forekomsten av tykktarmskreft i Skottland ble betydelig redusert i den generelle befolkningen på det laveste daglige dose aspirin (75 mg), og redusert forekomst ble observert selv etter bare fem år av aspirin bruk [7]. I en annen studie på kjemoterapeutiske effekten av aspirin i tykktarm kreftpasienter, en hasardratio på 0,53 (for dødelighet) ble observert hos pasienter som ikke brukte narkotika før diagnose og denne verdien redusert til 0,39 for en undergruppe av pasienter overekspresjon cyclooxygenase- 2 (COX-2) [5]
Flere studier på tykktarmskreftceller og kolon tumormodeller har bekreftet at aspirin hemmer vekst og induserer apoptose i disse systemene.; imidlertid gir de spesielle virkninger av aspirin er noe variable i disse rapportene. For eksempel, nedregulerer aspirin bcl-2-ekspresjon [9], hemmer vaskulær endotelial vekstfaktor, oppviser anti-angiogen aktivitet [10], [11], og inhiberer WNT /β-catenin veien [12]. Dunlop og medarbeidere har også vist at aspirin-indusert nedregulering av IκBα i tykktarmskreftceller resulterer i forbedret kjerne akkumulering av NFkB-komplekset (p65 /p50), og dette har vært knyttet til en pro-apoptotisk reaksjonsvei i tykktarmskreftceller [13] – [15]
Etyl-2 -. [(2,3-bis (nitrooxy) propyl) disulfanyl] benzoat (GT-094) er et syntetisk nitro-non-steroid antiinflammatorisk medikament (NSAID-NO) og som aspirin, GT-094 hemmer også tykktarmskreftceller og tumorvekst [16], [17]. Mekanistiske studier indikerer at anticancer aktivitet av GT-094 skyldes delvis til ROS-avhengig nedregulering av spesifisitet protein (Sp) transkripsjon faktorer SP1, SP3, SP4 og Sp-regulerte gener som inkluderer BCL-2, survivin, hepatocytter vekst faktor reseptor (c-MET), VEGF og dens reseptor VEGFR1 [17]. Andre medikamenter, inkludert NSAIDs som tolfenamsyre og COX-2-hemmere også hemme kreftcellevekst og nedregulere Sp transkripsjonsfaktorer [18] – [26], og i denne studien, har vi undersøkt effekten av acetylsalisylsyre på Sp proteiner og andre SP- regulerte gener inkludert β-catenin. Våre resultater viser at aspirin og salicylat downregulate SP1, SP3, Sp4 og flere Sp-regulerte genprodukter i tykktarm kreft celler og identifiserer en viktig vei for anticancer aktivitet av aspirin som er forenlig med RNA interferens (RNAi) studier der knockdown SP1 SP3 og Sp4 i kreftceller hemmer også vekst og induserer apoptose [24] – [26]. Knockdown av Sp proteiner også vist at β-catenin er en Sp-regulert gen i tykktarmskreftceller. Resultatene av denne undersøkelse, kombinert med tidligere rapporter om mekanismene for aspirin-mediert inhibering av tykktarmskreftcellevekst, vil også lette utvikling av terapier med aspirin og NSAID analoger i kombinasjon med andre midler anvendt for å behandle kreft i tykktarmen. De rapporterte høy serum salicylate /aspirin intervallene som observeres i humane studier med aspirin [27] antyder at salicylat kan være en viktig bidragsyter til den anticancer aktivitet av aspirin i kolon kreftpasienter.
eksperimentelle prosedyrer
cellelinjer, reagenser og antistoffer
RKO, SW480, HT-29 og HCT-116 humane colon carcinoma cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). RKO og SW480-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte /Hams F-12 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) med fenolrødt supplert med 0,22% natriumbikarbonat, 5% føtalt bovint serum, og 10 ml /l 100X antibiotisk /antimykotisk oppløsning (Sigma). HT-29 og HCT-116-celler ble opprettholdt i McCoys 5A medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) med fenolrødt supplert med 0,22% natriumbikarbonat, 10% føtalt bovint serum, og 10 ml /l 100X anti-biotiske anti-mykotisk-oppløsning (Sigma). Cellene ble dyrket i 150 cm
2 kulturplater i en luft /CO
2 (95:5) atmosfære ved 37 ° C og passert omtrent hver 3-5 dager. Alle antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California), unntatt spaltes poly (ADP) ribose polymerase (PARP) og c-Met (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), SP1, Survivin og VEGF-R2 (Millipore, Temecula, CA), VEGFR1 og p65 (Abcam Inc. Cambridge, MA), og p-aktin antistoffer (Sigma-Aldrich). β-catenin ble kjøpt fra Epitomics, Inc., Burlingame, CA. Den NSAID acetylsalisylsyre og natriumsalicylat ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich. N, N, N «, N»-tetrakis (2-pyridyl metyl) etylendiamin (TPEN), glutation (98%) (GSH), og laktacystin ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Dithiothretol (DTT) (98%) ble oppnådd fra Boehringer Mannheim Corp., (Indianapolis, IN). Kaspaseinhibitorer 2, 8 og 9 og pancaspase inhibitor (Z-VAD-FMK) ble anskaffet fra Calbiochem (San Diego, CA). Leptomycin B var hemmer av kjernefysisk eksport kjøpt fra Enzo Life Sciences International, Inc. (Plymouth Meeting, PA). Lipofectamine og Lipofectamine 2000 ble kjøpt fra Invitrogen. Luciferase reagens var fra Promega (Madison, WI). p-galaktosidase-reagens ble oppnådd fra Tropix (Bedford, MA). NFkB promoter konstruksjon ble kjøpt fra Stratagene (Cedar Creek, TX). VEGF og Survivin promoter konstruksjoner ble gitt av legene. Gerhard Siemeister og Gunter Finkenzeller (Institute of Molecular Medicine, Tumor Biology Center, Freiburg, Tyskland) og Dr. M. Zhou (Emory University, Atlanta, Georgia), henholdsvis. SP1 og sp3 promoter konstruksjoner ble vennlig levert av legene. Carlos Cuidad og Veronique Noe (University of Barcelona, Barcelona, Spania).
celleproliferasjon analyser
RKO, SW480, HT-29 og HCT-116 tykktarmskreft cellelinjer ble belagt (3 × 10
4 per brønn) under anvendelse av DMEM: Hams F-12 medium inneholdende 2,5% trekull strippet føtalt bovint serum (FBS) i 12-brønners plater og til venstre for å feste i 24 timer. Cellene ble deretter behandlet med enten bærer eller de indikerte konsentrasjoner av aspirin og natriumsalicylat. Etter 24, 48 og 72 timers behandling, ble cellene tellet ved anvendelse av en Coulter-partikkelteller Z1. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer og resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE for hver bestemmelse.
Annexin V farging
apoptose, nekrotiske og sunn celle deteksjon kit ble kjøpt fra Biotium, Inc (Hayward , CA). RKO, SW480, HT-29 og HCT-116 tykktarmskreftceller (7,5 × 10
4) ble sådd i Lab-Tek to kamret dekkglass og lov til å feste natten. Etter behandling med acetylsalisylsyre (10 mM) i 24 timer ble cellene vasket med kald fosfatbufret saltløsning (PBS) to ganger og inkubert med FITC Annexin V, etidium homodimer III og Hoechst 33342 i Annexin V bindingsbuffer i 20 minutter i henhold til produsentens instruksjonene i protokollen. Cellene ble deretter vasket to ganger med Annexin V bindingsbuffer og oppdaget for flouroscence med digital fluorescerende mikroskop.
siRNA forstyrrelser analyser
sirnas for SP1, SP3, SP4 og Lamin ble kjøpt fra Sigma- Aldrich. SiRNA komplekser brukt i denne studien er angitt som følger:
Lamin: SASI_Hs02_00367643
SP1: SASI_Hs02_00363664
sp3 5′-GCG GCA GGU GGA GCC UUC ACU TT
Sp4 5′-GCA GUG ACA CAU UAG UGA GCT T
RKO og SW480 tykktarmskreft cellelinjer ble sådd (6 × 10
4 per ml) i 6-brønners plater i DMEM: Hams F-12-medium supplert med 2,5% trekull-strippet FBS uten antibiotika og til venstre for å feste for en f. Knockdown av SP1, SP3, Sp4 individuelt eller en kombinasjon av alle 3 proteiner utføres med egnede siRNA sammen med iLamin som kontroll ble utført ved hjelp LipofectAMINE 2000 transfeksjon reagens i henhold til produsentens anvisninger.
Transfeksjon og luciferase assay
RKO og SW480 kolon kreftceller (1 x 10
5 per brønn) ble sådd ut i 12-brønners plater i DMEM /Hams F-12 medium supplert med 2,5% trekull-strippet FBS. Etter 24 timer, forskjellige mengder av DNA [dvs. 0,4 ug PGL3-Luc, 0,04 ug β-galaktosidase, og 0,4 ug pNFκB-Luc (4) -Luc] ble transfektert ved bruk av LipofectAMINE 2000 reagens i henhold til produsentens protokoll. Etter 5 timer fra transfeksjon, ble transfeksjon blandingen erstattet med fullstendig medium inneholdende enten bærer (DMSO) eller den angitte forbindelsen i DMSO.
For RNA-interferens studier, RKO og SW480 kolon kreft celler ble kotransfektert med siRNA for SP1, SP3, SP4 eller Lamin sammen med ulike mengder av DNA for PGL3-Luc eller 0,4 mikrogram pNFκB-Luc. Etter 22 timer ble cellene deretter lysert med 100 ul av 1X reporter lyseringsbuffer, og celle-ekstrakter (30 ml) ble anvendt for luciferase og β-galaktosidase analyser. En Lumicount luminometer ble brukt til å kvantifisere luciferase og β-galaktosidase aktiviteter, og luciferase aktiviteter ble normalisert til p-galaktosidase aktivitet.
Western blot
RKO, SW480, HT-29 og HCT- 116 tykktarmskreftceller ble utsådd i DMEM: Hams F-12 medium inneholdende 2,5% trekull-strippet FBS og etter 24 timer ble cellene behandlet med enten bærer (DMSO) eller de angitte forbindelser. Celler ble samlet opp ved hjelp av høy-saltbuffer (50 mM HEPES, 0,5 mol /l NaCl, 1,5 mM MgCl
2, 1 mM EGTA, 10% glyserol, og 1% Triton-X-100) og 10 ml /l Protease inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich). Etter sentrifugering av lysatet ved 15 000
g
i 15 minutter ved 4 ° C, supernatanten ble utvunnet, og protein ble kvantifisert ved hjelp av Bradford-proteinanalyse. Protein lysatene (15-60 ug) ble inkubert i 5-10 minutter ved 100 ° C sammen med 5X ladningsbuffer og deretter separert ved elektroforese på 7,5 til 12% natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-geler ved 120 V i 3 til 4 timer. Proteiner ble overført til polyvinylidendifluorid-membraner med våt elektroblotting i en buffer inneholdende 25 mM Tris, 192 mM glycin og 20% metanol i 1,5 timer ved 180 mA. Membranene ble blokkert i 45 minutter med 5% TBST-Blotto (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0, 0,05% Triton X-100, og 5% fettfri tørrmelk) og inkubert i frisk 5% TBST-Blotto med 1:500 primært antistoff over natten med forsiktig risting ved 4 ° C. Etter vasking to ganger med TBST i 10 min, ble membranen inkubert med sekundært antistoff (1:5000) i 5% TBST-Blotto i 3-4 timer ved forsiktig risting. Membranen ble vasket to ganger med TBST i 10 minutter, inkubert med 2 ml av kjemiluminescens substrat (Millipore, Temecula, CA) i 1 minutt, og eksponert for Kodak bilde stasjon 4000 mm Pro (Carestream Health, Rochester, NY).
xenograft studier i atymiske mus
Kvinnelige atymiske nakne mus ble kjøpt fra Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). Musene ble plassert og holdt under spesifikke patogen frie forhold i anlegg som er godkjent av American Association for Akkreditering av Laboratory Animal Care og i samsvar med gjeldende regelverk og standarder for United States Department of Agriculture, United States Department of Health and Human Services. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Texas A M-universitetet i Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) (AUP # 2012-131). Alle operasjoner ble utført under natrium pentobarbital anestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse. For å produsere tumorer, ble RKO cellene høstet fra subsammenflytende kulturer ved en kort eksponering til 0,25% trypsin og 0,02% etylendiamintetraeddiksyre. Trypsinering ble stanset med medium inneholdende 10% føtalt bovint serum, og cellene ble vasket en gang i serumfritt medium og resuspendert i serumfritt medium. Bare suspensjoner som består av enkle celler med 90% levedyktighet ble anvendt for injeksjonene. En xenograft ble etablert ved subkutan injeksjon av cellene (3 x 10
6) inn i flankene til individuelle mus. Tumorene fikk vokse i 6 d inntil de var følbar. Mus ble deretter randomisert i to grupper på seks mus pr gruppe og dosert ved oral føring i maisolje 200 mg /kg /dag (nøytralisert med en ekvimolar konsentrasjon av NaOH) av aspirin på hver dag etter 14 d. Musene ble veiet, og tumorstørrelse ble målt hver andre dag av målepunkter for å muliggjøre beregning av tumorvolumer: V = LW
2/2, hvor L og W ble lengde og bredde, henholdsvis. Etter 14 d ble dyrene avlivet; endelige kropp og tumorvekter ble bestemt og plottet. Ved slutten av forsøket ble det gjennomført store innvendige organer og svulster samlet og analysert for Sp protein ekspresjon og induksjon av apoptose ved hjelp av Western blot og TUNEL-farging respektivt.
Statistisk analyse
Statistisk signifikans av forskjeller ble bestemt ved analyse av varians og student t-test, og nivåene av sannsynlighet ble notert. Alle statistiske tester var tosidig. IC
50 verdiene ble beregnet ved hjelp av ikke-lineær regresjonsanalyse og uttrykt i mikrometer, 95% konfidensintervall.
Resultater
Aspirin hemmer vekst og induserer apoptose i tykktarmskreftceller
i denne studien ble forskjellige konsentrasjoner (2,5-10 mM) av aspirin hemmet vekst av SW480, RKO, HT29 og HCT116-celler i løpet av en periode på 3 dager (fig. 1A og 1B), og IC
50 verdiene for aspirin-indusert veksthemming var i området fra 2,5 til 5 mM i alle 4 cellelinjer. Den høye dose (10 mM) av aspirin ble anvendt for å bestemme proapoptotiske effekten av denne forbindelsen etter behandling i bare 24 timer, og resultatene viser at aspirin øket Annexin V-farging i alle fire koloncancercellelinjer (Fig. 1C). Apoptosiske effekter aspirin (5 og 10 mm) ble videre undersøkt i tykktarm kreft celler ved å bestemme endringer i uttrykk i overlevelsesproteiner BCL-2 og survivin og induksjon av caspase-avhengige PARP cleavage. Aspirin-indusert en treringstrinnet og tidsavhengig nedregulering av Survivin og bcl-2 og indusert av PARP spalting, en markør for apoptose (fig. 1D og 1E).
Inhibering av SW480 og RKO (A) og HT29 og HCT116 (B) celleproliferasjon. Celler ble behandlet med DMSO eller 2,5-10 mM aspirin i 3 dager, og celletall ble bestemt som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. Induksjon av Annexin V-farging (C) og apoptotiske respons i RKO og SW480 (D) og HT29 og HCT116 (E) celler. Annexin V-farging ble bestemt som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. Ekspresjonen av apoptotiske proteiner PARP spaltning ble bestemt ved western blot-analyse av helcellelysater som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. Resultatene i (A) og (B) er midler ± SE for tre replikere bestemmelse for hver behandlingsgruppe, og signifikant (p 0,05) hemming indikeres (*)
Aspirin og salicylate nedregulerer SP1. , SP3, SP4 og Sp-regulerte gener
Tidligere studier av RNA interferens (RNAi) viser at både survivin og bCL-2 er regulert av SP1, sp3 og Sp4 i kreftceller [17], [22], [24] – [26]. Derfor RKO, SW480, HT29 og HCT116-celler behandlet med 5 og 10 mM aspirin i 24 eller 48 timer og western blot analyse viste at det var en treringstrinnet og tidsavhengig reduksjon i Sp1, SP3 og SP4 proteiner i alt fire celle linjer (fig. 2A og 2B). Videre behandling av RKO, SW480, HT-29 og HCT116 tykktarm kreft celler med 5 eller 10 mM aspirin for 24 eller 48 timer også redusert uttrykk av flere genprodukter regulert av SP1, sp3 og Sp4 [24] – [29] og disse omfatte VEGF, VEGFR1, cyklin D1 og c-MET-proteiner (fig. 2C og 2D), og virkningene av aspirin på deres ekspresjon ble både treringstrinnet og tidsavhengig.
nedregulering av Sp proteiner i RKO og SW480 (A) og HT29 og HCT116 (B) og Sp-regulerte genprodukter i RKO og SW480 (C) og HT29 og HCT116 (D) celler. Celler ble behandlet med 5 eller 10 mM aspirin i 24 eller 48 timer, og hele cellelysater ble analysert ved hjelp av western blot-analyse som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. Resultatene er typisk av duplikate eksperimenter. (E) Aspirin avtar reportergen aktivitet. Cellene ble transfektert med pSp1For4, pSp3For5, pVEGF og pSurvivin og behandlet med DMSO eller aspirin (5 eller 10 mm). Luciferase-aktiviteten ble bestemt som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE (3 gjentak) og signifikant (p 0,05). Hemming indikeres (*)
Vi har også undersøkt effekten av fem og 10 mM aspirin på luciferase aktivitet i RKO og SW480 celler transfektert med konstruksjoner som inneholder GC-rik promoter innsatser fra SP1 (pSp1For4, -751 til -20), sP3 (pSp3For5, -417 til -38), VEGF (pVEGF, -2018 til 50), og survivin ( pSurvivin, -269 til 49) gener (fig. 2E). Med unntak av VEGF konstruere, 5 og 10 mM aspirin nedsatt luciferase-aktivitet, og disse resultatene korrelert med redusert ekspresjon av det tilsvarende Sp1, sp3, VEGF og Survivin proteiner i RKO og SW480-celler i betydelig grad. Økningen i luciferaseaktivitet i RKO-celler ble behandlet med 5 mM aspirin og transfektert med pVEGF kan være på grunn av den relativt langsomme nedregulering av dette proteinet som bare ble observert etter 48 timer ved 10 mM konsentrasjon, noe som tyder på at andre aspirin-induserte reaksjonsveier kan også skal aktivere VEGF.
Aspirin er raskt metaboliseres til salicylat [27] og effekter av salicylat om tykktarmskreft cellevekst, Sp proteiner og Sp-regulerte gener ble også undersøkt (fig. 3). Salisylat (natriumsalt) (2,5-10 mM) også inhiberte veksten av alle 4 cellelinjer (fig. 3A og 3B), og den veksthemmende effekt var lik den som er observert for aspirin (fig. 2A og 2B). Veksthemming ble fulgt av den tidsavhengige nedregulering av Sp1, sp3, Sp4 og Sp-regulerte genprodukter (bcl-2, cyclin D1, Survivin og VEGF) i RKO og SW480 (fig. 3C) og HCT116 og HT29 (fig. 3D) celler. Dette mønsteret av reaksjoner for natriumsalicylat var sammenlignbart med det som ble observert for aspirin (fig. 1 og 2), og lignende effekt ble også observert for metylsalicylat (data ikke vist), som også raskt metabolisert til salicylat.
Inhibering av RKO og SW480 (A) og HCT116 og HT29 (B) cellevekst. Celler ble behandlet med 2,5-10 mM natriumsalicylat i opptil 3 dager, og celletall ble bestemt som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. Protein nedregulering i RKO og SW480 (C) og HCT116 og HT29 (D) celler. Celler ble behandlet med 5 eller 10 mM salicylat i 24 eller 48 timer, og hele cellelysater ble analysert ved hjelp av western blot som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter.
Aspirin-indusert undertrykkelse av NFkB og β-catenin skyldes delvis til Sp-nedregulering
Det har tidligere blitt rapportert at aspirin forbedret atom NFkB opphopning [13] – [15], og dette ble ytterligere undersøkt i RKO og SW480-celler ble behandlet med 5 og 10 mM aspirin i 48 timer. Nivåer av cytosoliske P65 og P50-nivåene ble redusert, mens atom P65 og P50-nivåer var forholdsvis uforandret etter behandling med acetylsalisylsyre (figurene 4A og 4B.) Og disse resultatene skilte seg med tidligere studier [13] – [15]. Videre generelle nivået av kjerneproteiner var 10% av cytosoliske proteiner, og dette ble bekreftet ved western blot-analyse av hele cellelysater fra celler behandlet med 5 eller 10 mM aspirin som viste at både P65 og P50-proteinene ble redusert i begge cellelinjene innen 48 timer etter behandling med acetylsalisylsyre (fig. 4A og 4B). Aspirin nedsatt også luciferaseaktivitet i SW480 og RKO celler transfektert med en pNFκB-luc-konstruksjon (fig. 4C) og disse resultatene var i overensstemmelse med den observerte nedregulering av både p65 og P50 proteiner (Fig. 4A og 4B). Tidligere studier har rapportert at aspirin redusert β-catenin uttrykk i tykktarm kreft celler [12] og våre resultater bekreftet at 5-10 mm aspirin reduserer også β-catenin uttrykk i RKO og SW480 tykktarmskreftceller (fig. 4D).
Redusert p65 /p50 i RKO (A) og (B) SW480-celler. Cellene ble behandlet i 48 timer med 5 eller 10 mM, og hele cellen, nukleære og cytosoliske ekstrakter ble analysert ved hjelp av western blot-analyse som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. Nivåene av P65 og P50 proteiner (i forhold til p-aktin) i helcellelysater ble kvantifisert fra 3 replikere eksperimenter, og ble betydelig redusert med aspirin. (C) Aspirin reduserer NFkB-luc. Konstruksjonen ble transfektert inn i RKO og SW480-celler behandlet med DMSO eller aspirin, og luciferaseaktiviteten bestemmes som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. Resultatene er gjennomsnitt ± SE (3 replikater), og signifikant (p 0,05) inhibisjon er indikert (*). (D) nedregulering av β-catenin. Celler ble behandlet med 5 eller 10 mM aspirin i 48 timer, og hele cellelysater ble analysert ved hjelp av western blot som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter.
Siden NFkB (p65) og β-catenin promotorer inneholde GC-rik Sp bindingssteder [28], [29], brukte vi RNAi å bestemme hvilken rolle SP1, sp3 og Sp4 i regulering av p65, p50 og β-catenin i tykktarm kreft celler. RKO og SW480 celler ble transfektert med små hemmende RNA målretting SP1 (iSp1), SP3 (iSp3), og Sp4 (iSp4) alene og i kombinasjon (iSp1 /3/4). Figur 5A viser at hver enkelt oligonukleotid redusert uttrykk for sin individuelle mål (SP1, SP3 og SP4) og iSp1 /3/4 slått ned alle tre proteiner. iSp1 også redusert ekspresjon av Sp4 (men ikke sp3), og dette er i overensstemmelse med tidligere studier som viser kryss-regulerende interaksjoner mellom de Sp transkripsjonsfaktorer på grunn av deres GC-rik promotorer [22], [25]. Figur 5B illustrerer cellekontekstavhengige forskjeller i effekten av iSp1, iSp3 og iSp4 på p65 uttrykk i RKO og SW480 celler hvor SP1, sp3 og Sp4 knockdown resulterte i små endringer i p65 i RKO celler og SP1 og i mindre grad Sp4 knockdown redusert p65 i SW480 celler. iSp1 /3/4 (kombinerte oligonukleotider) ble redusert p65-ekspresjon i begge cellelinjene, mens det minimale effekter ble observert for p50. Således aspirin-indusert nedregulering av p50 (fig. 4A og 4B) ble Sp-uavhengig. Figur 5C viser at iSp1 /3/4 reduserte også luciferaseaktivitet i RKO (90%) og SW480 (40%) celler transfektert med den NFkB-Luc konstruktet, og de forskjellige virkninger av Sp knockdown i disse cellene antyder et mer dominerende rolle for Sp-avhengig regulering av NFkB i RKO enn SW480 celler. Sp knockdown (kombinert) også redusert β-catenin protein i RKO og SW480 celler og resultatene av knockdown av enkelt Sp proteiner tyder på at SP1 og Sp4 er de dominerende transkripsjonsfaktorer som kreves for konstitutiv ekspresjon av β-catenin i RKO celler, mens knockdown av SP1 , sp3 og Sp4 redusere β-catenin proteinnivåer i SW480 celler (fig. 5D). Interessant, viser RNAi studier som PARP cleavage (apoptose) induseres primært etter knockdown av sp3 i både RKO og SW480 celler (Fig. 5E).
knockdown av SP1, SP3, Sp4 og Sp1 /3/4 (A) og p65 /P50 (B) i tykktarmskreftceller. -Celler ble transfektert med forskjellige oligonukleotider, og hele cellelysater ble analysert ved hjelp av western blot-analyse som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. (C) knockdown av Sp1 /3/4 (kombinert) inhiberer NFkB-luc. Celler ble transfektert med iLamin (kontroll) og iSp1 /3/4 (kombinerte oligonukleotider) og NFKB-Luc, og luciferase-aktiviteten ble bestemt som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SE (3 replikater), og signifikant (p 0,05) redusert aktivitet er indikert (*). Sp knockdown reduserer β-catenin (D) og induserer PARP-spaltning (E). Cellene ble transfektert med ulike oligonukleotider, og helcellelysater ble analysert ved western blot som beskrevet i de eksperimentelle prosedyrer.
Mekanisme aspirin-indusert nedregulering av SP1, sp3 og Sp4
flere veier er blitt beskrevet for forbedret Sp degradering i kreftcellelinjer, og disse inkluderer aktivering av proteasomer, caspaser og ROS [17] – [20], [22] – [26] og også en vei som innebærer atom eksport av Sp1 fulgt av proteolytisk nedbrytning i cytosol [30]. Western blot analyse av kjernefysiske og cytosolfraksjonen fra RKO og SW480 celler viser at SP1, sp3 og Sp4 er lokalisert i kjernen og behandling med aspirin redusert SP1, SP3 og SP4 proteinnivåer i kjernen uten noen åpenbar translokasjon til cytosol (fig. 6A). Lignende resultater ble observert etter cotreatment med aspirin og atom eksport inhibitor leptomycin B (kombinert), noe som indikerer at kjernefysisk eksport av SP1, SP3 eller Sp4 ikke var nødvendig for aspirin-induced nedregulering av SP1, SP3 og SP4. Andre legemidler som nitro-NSAID GT-094 og betulinsyre Sp proteiner i RKO og SW480 celler redusert gjennom ROS-avhengig induksjon av Sp transcriptional repressor ZBTB10 og denne responsen ble svekket av antioksidanter som GSH eller DTT [17], [31 ]; resulterer imidlertid i figur 6B viser at disse antioksidantene ikke blokkerer aspirin-indusert nedregulering av Sp proteiner. Resultater av foreløpige studier viser at aspirin-induced nedregulering av Sp proteiner ble heller ikke blokkert av proteasomhemmere (data ikke vist), men ble påvirket av cotreatment med pancaspase inhibitor Z-VAD-FMK. Figurene 6C og 6D viser at aspirin-indusert Sp nedregulering i RKO og SW480-celler ble hemmet etter cotreatment med pancaspase inhibitor (Z-VAD-FMK), caspase-2 (Z-VDVAD-FMK), og caspase-8 (Z- IETD-FMK) hemmere, men bare delvis blokkert med caspase 9 (Z-LEHD-FMK) inhibitor.
(A) Effekter av leptomycin B. Celler ble behandlet med 10 mM aspirin i nærvær eller fravær av leptomycin B i 48 timer, og hele cellelysater ble analysert ved hjelp av western blot-analyse som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. Effekter av antioksidanter (B) og kaspaseinhibitorer (C, D) på aspirin-induced Sp protein downregulation. Celler ble behandlet med DMSO, aspirin alene eller i kombinasjon med antioksidanter eller kaspaseinhibitorer, og etter 48 timer ble hele cellelysater analysert ved hjelp av western blot som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter.
Favier og medarbeidere [ ,,,0],32], [33] som tidligere er rapportert i HeLa-celler som sink chelatering av den gjennomtrengelige metallioner chelator TPEN aktivert flere kaspaser (3-, 8- eller 9-) og redusert ekspresjon av Sp1, SP3 og SP4 proteiner som inneholder sinkioner i sin katalytiske seter. Behandling av RKO og SW480 celler med 25 eller 50 mikrometer TPEN for 18 timer indusert PARP cleavage og aktivering (spalting) av caspases 8, 9, 3 og 7 (Fig. 7A). Den kritiske rolle av sink uttømming i å mediere denne reaksjon og nedregulering av Sp-proteiner ble bekreftet ved behandling av tykktarmskreftceller med TPEN alene eller i kombinasjon med 50 uM ZnSO
4 (fig. 7B). TPEN redusert uttrykk av SP1, sp3 og Sp4 og tillegg av ZnSO
4 helt snudd den TPEN avhengige nedregulering av SP1, SP3 og SP4 proteiner. Som TPEN, aspirin også indusert PARP-spaltning og aktivering (spalting) av caspaser 8, 9, 3 og 7 (fig. 7C). Aspirin-indusert PARP-spaltning ble også inhibert av sinksulfat (figur 7D.); Videre behandling av RKO og SW480-celler med aspirin alene eller i kombinasjon med 50 uM ZnSO
4 viser at ZnSO
4 også redusert aspirin-mediert nedregulering av Sp1, sp3 og Sp4 (fig. 7E), noe som bekrefter at aspirin, som TPEN induserer caspase-avhengig spalting av Sp proteiner som skyldes sink ion uttømming.
(A) TPEN induserer aktivering (spalting) av kaspaser. Celler ble behandlet med 25 eller 50 uM TPEN i 18 timer, og hele cellelysater ble analysert ved hjelp av western blot som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. (B) TPEN reduserer Sp protein expression og sink sulfat blokkerer effekten av TPEN på Sp downregulation. Celler ble behandlet med 50 uM ZnSO
4 i 18 timer, og hele cellelysater ble analysert ved hjelp av Western blot. (C) Aspirin aktiverer kaspaser. Celler ble behandlet med aspirin i 48 timer, og hele cellelysater ble analysert ved hjelp av western blot som beskrevet i de eksperimentelle fremgangsmåter. (D) Aspirin-indusert PARP spalting er blokkert av ZnSO
4. Cellene ble behandlet i 48 timer med aspirin alene eller i kombinasjon med ZnSO
4 og PARP-spaltning ble analysert ved hjelp av western blot av helcellelysater. (E) Effekter av ZnSO
4 på aspirin-induced nedregulering av Sp proteiner.
