Abstract
Bakgrunn
Adherens veikryss består av trans cadherins, som samhandler intracellulært med p120ctn, ß-catenin og α-catenin. p120ctn er kjent for å regulere celle-celle adhesjon ved å øke cadherin stabilitet, men effekten av andre adherens koblingskomponenter på celle-celle adhesjon har ikke blitt sammenlignet med den av p120ctn.
metodikk /hovedfunnene
Vi viser at uttømming av p120ctn av små interfererende RNA (siRNA) i DU145 prostatakreft og MCF10A bryst epitelceller reduserer uttrykket nivåer av adherens koblings proteiner, E-cadherin, P-cadherin, ß-catenin og α-catenin, og induserer tap av celle-celle adhesjon. p120ctn-utarmet celler har også økt migrasjon hastighet og invasjon, som korrelerer med økt Rap1 men ikke Rac1 eller RhoA aktivitet. Nedregulering av P-cadherin, β-catenin og α-catenin, men ikke E-cadherin induserer et tap av celle-celle-adhesjon, migrasjon økt og forbedret invasjon lik p120ctn uttømming. Men bare fører p120ctn utarming til en nedgang i nivåene av andre adherens koblings proteiner.
Konklusjon /Betydning
Våre data tyder på at P-cadherin men ikke E-cadherin er viktig for å opprettholde adherens Forbindelsesstykke i DU145 og MCF10A celler, og at uttømming av enhver av de cadherin-assosierte proteiner, p120ctn, ß-catenin eller α-catenin, er tilstrekkelig til å forstyrre adherens knutepunkter i DU145-celler og øke migrering og invasjon kreftcelle.
Citation: Kümper S, Ridley AJ (2010) p120ctn og P-cadherin men ikke E-cadherin Regulere cellemotilitet og invasjon av DU145 prostata kreft celler. PLoS ONE 5 (7): e11801. doi: 10,1371 /journal.pone.0011801
Redaktør: Robin Charles mai, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 02.02.2010; Godkjent: 29 juni 2010; Publisert: 27.07.2010
Copyright: © 2010 Kuemper, Ridley. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Cancer Research UK, Bettencourt-Schueller Foundation, og EU-kommisjonen Work 6 kontrakt (LSHG-CT-2003-502935, Main). SK ble støttet av en PhD student fra Kings College London School of Biomedical og helsefag. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i løpet av metastase, kreftceller ofte få muligheten til å migrere og invadere vev ved å regulere deres interaksjon med andre celler og deres ekstracellulære miljø. Mange studier viser at endringer i celle-celle-adhesjon korrelerer med epitelial tumorprogresjon og metastase [1]. Kreftceller kan invadere enten som enkeltceller eller kollektivt som grupper av celler [2], [3], [4]. Begge typer invasjon involverer ødeleggelse av epitelet som vanligvis krever en svekkelse av celle-celle-kontakter og en forandring i celleform. Cadherins og catenins danne adherens veikryss, som er sentrale formidlere av celle-celle adhesjon. Expression of adherens koplings proteiner er ofte redusert i svulster, og tilberedning av funksjonelle adherens veikryss kan gå tilbake til invasiv fenotype av kreftceller [5], [6], [7].
Den klassiske cadherins (E-, VESA, N- og P-cadherin) er de sentrale trans proteinene i adherens krysset komplekse og megle Ca
2 + -avhengig homofilist intercellulære interaksjoner. β-catenin og plakoglobin /γ-catenin binder til cadherin intracellulære domener i en gjensidig utelukkende måte og α-catenin i sin tur binder seg til p-catenin [8]. P120-catenin (p120ctn) på den annen side binder seg til et annet område av cadherins til p-catenin [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Sammensetningen av proteiner av adherens krysset komplekset er avhengig av celletype og cadherin uttrykk. α-catenin gir et viktig bindeledd mellom adherens veikryss og aktin cytoskjelettet. Dets interaksjon med aktin filamenter Det ser imidlertid ut til å være gjensidig utelukkende for sin binding til p-catenin som tyder på en indirekte forbindelse mellom knutepunkt og aktin cytoskjelettet [15], [16].
p120ctn er blitt funnet å regulere adherens veikryss stabilitet
in vitro product: [17], [18], [19] og
in vivo product: [20], [21], [22]. Dens uttømming av RNAi fører til en reduksjon i adherens koblings proteiner og opphever celle-celle adhesjon [17], blant annet ved å øke cadherin endocytose og degradering [19], [23]. p120ctn også påvirker aktiviteten til de små GTPases RhoA, Rac1 og Cdc42 i enkelte celletyper [24], [25], [26], [27], som spiller en sentral rolle i å regulere cytoskeletal dynamikk, dannelse og vedlikehold av adherens veikryss og cellemigrasjon [28], [29]. p120ctn kan derfor koble adherens veikryss og Rho GTPases.
Virkningene av p120ctn på cellemigrering og invasjon varierer avhengig av celletype, analysebetingelser og typer cadherins uttrykt [30], [31], [32] . Det er ikke klart i hvilken grad effekten av p120ctn formidles gjennom adherens veikryss eller Rho GTPases. For å løse dette, har vi slått ned p120ctn i DU145 prostatakreftceller og MCF10A mammary epitelceller, som begge normalt har adherens veikryss som inneholder E-cadherin og P-cadherin. I begge celletyper uttømming av p120ctn fører til avbrudd av celle-celle-kontakter, nedregulering av adherens junction proteiner og økt celle motilitet. Interessant, gjorde knockdown av p120ctn ikke påvirke aktivitetsnivået i Rho GTPases Rac1 og RhoA men førte til en økning i aktiv Rap1. For første gang har vi slått ned cadherins samt catenins og vise at P-cadherin, β-catenin og α-catenin men ikke E-cadherin uttømming etterligne effekten av p120ctn undertrykkelse og føre til tap av celle-celle kontakter og forbedret invasjon.
Resultater
Undertrykkelse av p120ctn uttrykk fører til nedregulering av celle-celle adhesjon proteiner og avbrudd i celle-celle kontakter
for å undersøke effektene av p120ctn på celle -celle adhesjon, sammenlignet vi effektene av p120ctn uttømming i to forskjellige cellelinjer som har adherens veikryss, den humane prostatacancercellelinje DU145 og human bryst epitelcellelinje MCF10A. DU145 og MCF10A celler dannet celle-celle-kontakter og uttrykt både E- og P-cadherin, og lokalisert til celle-celle-kontakter (fig. 1A, B). DU145 og MCF10A cellene hovedsakelig uttrykker to p120ctn isoformer som, basert på deres molekylvekt, er anslått til å være isoformer 1 og 3 [33] med isoform 3 (lavere band) blir uttrykt på litt høyere nivåer (Fig. 1).
DU145 (A) og MCF10A (B) celler ble transfektert med sirnas for p120ctn (p120ctn (1), (2)), tak siRNA eller med transfeksjon reagens bare (mock). Etter 72 timer ble cellene fiksert og farget for F-aktin, p120ctn og E-cadherin eller P-cadherin (venstre paneler), eller lysert og analysert ved immunblotting for de angitte celle-celle adhesjon molekyler og p120ctn knockdown effektivitet (høyre panel) . Skala barer = 25 mikrometer. ERK ble anvendt som en kontroll for lasting immunoblot.
knockdown av p120ctn med to forskjellige sirnas i DU145 og MCF10A celler indusert ødeleggelse av celle-celle adhesjon resulterer i en «spredt» fenotype (Fig. 1, fig. 2). I tillegg gjorde DU145-celler som stabilt tømt for p120ctn ikke har stabil adherens krysset (Fig. S1). Denne fenotype var spesielt på grunn av p120ctn uttømming, siden ekspresjon av shRNA-resistente mus p120ctn (GFP-fusjon) reddet knutepunkt formasjon, som bestemt ved lokalisering av p120ctn og E-cadherin (fig. S1).
DU145 ( A, C, D) og MCF10A (B, C) celler ble transfektert med sirnas for p120ctn (p120ctn (1), (2)), siRNA for E-cadherin (E-cadherin), kontroll siRNA (kontroll) eller med transfeksjon reagent bare (mock). Etter 56 timer ble cellene overvåket av time-lapse mikroskopi, skaffe et bilde hvert 10. minutt over en periode på 16 timer. Representative eksempler på fase kontrast av celler fra filmene (venstre panel) og migrasjons spor (høyre panel, startpunktet for hver celle er plottet i skjæringspunktet mellom x- og y-aksen) er vist for kontroll-transfektert og p120ctn-utarmet DU145 (A) og (B) MCF10A celler. Skala barer = 50 mikrometer. (C, D) Migrasjon hastigheter er avbildet som boksen og whisker plott som viser median, interkvartilt område (bokser) og høyeste og laveste verdiene (værhår). (C) Migrasjons hastigheter på DU145 og MCF10A celler. (D) Migrasjons hastigheter på DU145 kontrollceller i kolonier i forhold til enkeltceller. Dataene er fra tre forskjellige eksperimenter som hver ble utført i duplikat, analysere 15 celler per felt (~90 celler totalt). *** P 0,001, sammenlignet med kontroll og bestemmes av t-test
Både E-cadherin og P-cadherin samt β- og α-catenin ble nedregulert i p120ctn-oppbrukt. celler. Nedregulering av cadherins korrelert med graden av p120ctn uttømming: ved 72 timer etter transfeksjon med sirnas målretting p120ctn, p120ctn nivåene var lavere enn ved 48 timer, og E-cadherin nivåene var lavere ved 72 timer enn 48 timer (data ikke vist)
p120ctn-utarmet celler var imidlertid ikke sannsynlig å ha gjennomgått epitelial til mesenchymale overgang (EMT) som nivåer av EMT markørproteiner som vimentin ikke ble økt i forhold til å styre-transfekterte DU145 celler (data ikke vist).
p120ctn regulerer migrasjon av DU145 og MCF10A celler
for å teste om cellemigrasjon ble påvirket av p120ctn uttømming ble cellene overvåket av time-lapse mikros over 16 timer (fig. 2A, B) og spores til bestemme deres migrasjon hastighet. p120ctn fattig DU145 og MCF10A celler både migrert raskere enn kontrollcellene (fig. 2, Filmer S1, S2, S3 og S4). I motsetning til dette har uttømming av E-cadherin ikke forandre cellemigrering hastighet (fig. 2C), selv om dets ekspresjon nivået ble redusert med p120ctn knockdown (fig. 1). Migrasjonen hastighet kontrollceller ble bestemt fra celler lokalisert innenfor cellekolonier (Fig. 2C), men noen celler i befolkningen migrerte som enkeltceller (filmer S1 og S3). Imidlertid var det ingen forskjell i migrasjon hastigheten av DU145 celler i kolonier eller enkle celler (fig. 2D), utelukker muligheten for at p120ctn-utarmet celler migrerte raskere fordi de var overveiende enkeltceller i stedet for i kolonier.
Cell migrasjon ble også analysert i ripe sår analyser på konfluente monolag av DU145 cellene. De fleste p120ctn-utarmet celler migrerte som individuelle celler inn i såret, mens kontrollcellene migrerte som et ark, opprettholde celle-celle-kontakter (fig. 3A, filmer S5, S6). p120ctn-utarmet celler migrert raskere enn (Fig. 3B) kontrollceller. Imidlertid p120ctn-utarmet celler viste en reduksjon i utholdenhet (fig. 3B) som indikerer at de forandre retning oftere. Dermed, til tross for økt migrasjon hastighet, sårheling tid var lik styre-transfekterte celler (fig. 3C).
DU145 cellene ble transfektert med sirnas for p120ctn (p120ctn (2)) og kontroll siRNA (kontroll) . Etter 56 timer ble en konfluent monolag såret ved hjelp av en pipette og cellene overvåkes av time-lapse mikroskopi, skaffe et bilde hvert 10. minutt over en periode på 16 timer. (A) Phase kontrast av celler fra første bilde fra hver video vises uten eller med representative spor av celler (7 /image; spores i 16 timer) lagret (øverst bilder). I tillegg er skrape sårene til kontrollcellene og p120ctn fattige celler vist på 0 h og 16 timer etter såret (bunnpaneler). Skala barer = 50 mikrometer. (B) Migration hastighet (til venstre) og utholdenhet (høyre; fortrengning /sporlengde) ble bestemt. Migrasjons hastigheter er avbildet som boksen og whisker plott som viser median, interkvartilt område (bokser) og høyeste og laveste verdiene (værhår). (C) området okkupert av celler i skrape sår ble bestemt fra fase kontrast bilder tatt på forskjellige tidspunkter fra filmer. Dataene er fra tre forskjellige eksperimenter som hver ble utført i duplikater, analysere 15 celler per felt (~90 celler totalt). * P 0,05; *** P. 0,001, sammenlignet med kontroll og bestemmes av t-test
Undertrykkelse av p120ctn uttrykk fører til økt Rap1 aktivitet
Regulering av Rho GTPase aktiviteter ved p120ctn har tidligere blitt korrelert med øket celle motilitet [25], [26]. Det ble imidlertid ikke observert noen forskjeller i nivåene av aktive RhoA, Rac1 eller Cdc42 mellom p120ctn fattig og kontroll-transfektert DU145 cellene (figur 4A, B;. Data for Cdc42 ikke vist). Siden p120ctn knockdown induserte et tap av celle-celle-kontakter og den GTPase Rap1 har tidligere vært forbundet med stabilisering av E-cadherin i plasmamembranen og må aktiveres etter E-cadherin frakopling [34], nivåer av aktive Rap1 ble analysert. p120ctn-utarmet DU145-celler viste økt nivå av Rap1 aktivitet (Fig. 4A, B).
DU145-celler ble transfektert med sirnas for p120ctn (p120ctn (1), (2)), tak siRNA (kontroll) eller med transfeksjon reagens bare (mock). Etter 72 timer ble cellene lysert og inkubert med GST-Rhotekin-RBD, GST-PAK1-PBD eller GST-RalGDS-RBD på glutation perler til å trekke ned aktiv RhoA, Rac1 og Rap1 hhv. Lysater av mock-transfekterte celler inkubert med GTPyS til å forhåndslaste GTPases ble anvendt som en positiv kontroll for pulldown analyser. (A) Eksempler på immunoblot for GTPase aktivitetsanalyser. ERK nivåer på immunoblot ble anvendt som en kontroll lasting. Ponceau farging av immunoblot viser nivåene av GST-fusjonsproteiner. (B) Grafer viser data fra tre (RhoA, Rac1) eller 4 (Rap1) uavhengige eksperimenter og resultater i forhold til total RhoA, Rac1, Cdc42 og normalisert til kontroll. Feilfelt representerer SEM. * P 0,05, sammenlignet med kontroll og bestemmes av t-test
Nedbryting av cadherins, ß-catenin eller α-catenin påvirker ikke uttrykk nivåer av andre adherens koblings proteiner
Siden p120ctn uttømming redusert nivåene av adherens krysset proteiner E-cadherin, P-cadherin, ß-catenin og α-catenin (fig. 1), undersøkte vi effekten av å tappe hver av disse proteinene på adherens veikryss. DU145-celler ble transfektert med 2 eller 3 forskjellige siRNA oligoer for E-cadherin, P-cadherin, β-catenin, α-catenin og p120ctn (Fig. 5A).
DU145-celler ble transfektert med de angitte sirnas for E-cadherin, P-cadherin, α-catenin og β-catenin, eller med kontroll siRNA (kontroll), eller transfeksjon reagens bare (mock). (A) Etter 72 timer ble cellene lysert og proteinnivåer av angitte proteiner analysert ved immunblotting. Total ERK eller GAPDH-proteinnivåer ble anvendt som en kontroll lasting. (B) Grafer viser protein nivåer av P-cadherin, E-cadherin, α-catenin og p120ctn etter knockdown av de indikerte proteiner, kvantifisert ved Odyssey skanning av immunoblotter (venstre) eller β-catenin knockdown, kvantifisert ved densitometri (til høyre), fra 4 uavhengige forsøk. Resultatene er normalisert til å kontrollere. Barer representerer SEM. *** P 0,001, ** p 0,01, * p. 0,05, sammenlignet med kontroll og bestemmes av t-test
Expression nivåer av hver av disse proteinene ble deretter bestemt ved kvantifisering av immunoblot. Nivåer av P-cadherin, β-catenin, α-catenin og p120ctn proteinene ble ikke påvirket av E-cadherin mangel (fig. 5A, B). Knockdown av P-cadherin svakt reduserte nivåer av E-cadherin, ß-catenin og α-catenin, men ikke p120ctn, men dette ble bare observert for siRNA oligo (1) som ga de sterkeste (mer enn 80%) reduksjon av P-cadherin . To andre oligos at redusert P-cadherin nivåer ved -50% ikke påvirke nivåene av andre synaptiske proteiner. ß-catenin eller α-catenin uttømming endret ikke nivåene av andre adherens koblings proteiner betydelig (Fig. 5). Det er således bare p120ctn uttømming som fører til en reduksjon i nivåene av alle de andre celle-celleadhesjonsmolekyler (Fig. 5B).
Undertrykkelse av p120ctn, P-cadherin, β-catenin og α-catenin men ikke E-cadherin fører til avbrudd av celle-celle kontakter og forbedrer kreftcelle invasjon
Siden nedregulering av p120ctn førte til et tap av celle-celle veikryss og en økning i celle migrasjon hastighet, effekten av å tappe andre adherens forbindelses proteiner på celle-celleadhesjon og celle-motilitet ble undersøkt. Knockdown av E-cadherin, P-cadherin, ß-catenin og α-catenin av RNAi var svært effektiv både i kolonier og i enkeltceller, som observert ved immunfluorescens, men ikke discernibly påvirke p120ctn nivåer (Fig. 6).
(A) DU145 cellene ble transfektert med de angitte sirnas for E-cadherin, P-cadherin, β-catenin, α-catenin, kontroll siRNA (kontroll) eller med transfeksjon reagens bare (mock). Etter 72 timer ble cellene fiksert og farget for P-cadherin, E-cadherin, β-catenin, α-catenin og p120ctn å korrelere knockdown fenotyper med ekspresjon av banket ned proteinene. Skala barer = 25 mikrometer.
knockdown av P-cadherin, β-catenin og α-catenin av hver av 2 forskjellige siRNAs (eller 3 for P-cadherin) førte til avbrudd av celle-celle kontakter, tilsvarende til p120ctn uttømming (fig. 6, fig. S2, fig. S3). Spesielt, alle tre sirnas 1, 2 og 3 er målrettet mot P-cadherin indusert tap av celle-celle-kontakter, selv om de reduserte P-cadherin nivåer ved ulike mengder (fig. 5, fig. 6, fig. S3). I motsetning til dette, fikk knockdown av E-cadherin i DU145-celler ikke indusere et tap av celle-celle-kontakter (fig. 2C, Fig. 6, Fig. 7).
DU145-celler ble transfektert med de angitte sirnas for E-cadherin, P-cadherin, β-catenin, α-catenin og p120ctn, med kontroll siRNA (kontroll) eller transfeksjon reagens bare (mock). 56 timer etter transfeksjon, ble cellene overvåket av time-lapse mikroskopi, anskaffe et fasekontrastrikt bilde hvert 10. minutt over en periode på 16 timer. Representative eksempler på kontrast fase i starten og migrasjons spor etter 16 h vises. Skala barer = 25 mikrometer. (B) Migration hastighet ble bestemt ved hjelp ImageJ programvare. Analyse av migrasjon hastighet er avbildet som boksen og whisker plott som viser median, interkvartilt område (bokser) og høyeste og laveste verdiene (værhår). Dataene er fra minst 50 celler fra tre forskjellige eksperimenter. *** P. 0,001, sammenlignet med kontroll og bestemmes av t-test
Cells tømt for hver adherens krysset protein ble sporet fra timelapse filmer å bestemme deres migrasjon hastighet (fig 7.). Som p120ctn uttømming, knockdown av P-cadherin, β-catenin og α-catenin har ført til en økning i cellemigrering fart, tilsvarende resultater oppnådd med p120ctn tømming, mens E-cadherin uttømming endret ikke migrasjon hastighet (fig. 7). Tilsvarende P-cadherin, men ikke E-cadherin uttømming i MCF10A celler førte til avbrytelse av celle-celle-kontakter og økt migrasjon hastighet (fig. 8).
(A) MCF10A-celler ble transfektert med de angitte sirnas for E -cadherin, P-cadherin eller med kontroll siRNA (kontroll). Etter 72 timer ble cellene fiksert og farget for F-aktin og p120ctn. Skala barer = 25 mikrometer. (B) 56 timer etter transfeksjon, ble cellene overvåket av time-lapse mikroskopi, anskaffe et fasekontrastrikt bilde hvert 10. minutt over en periode på 16 timer. Migrasjon hastighet ble bestemt ved hjelp ImageJ programvare. Analyse av migrasjon hastighet er avbildet som boksen og whisker plott som viser median, interkvartilt område (bokser) og høyeste og laveste verdiene (værhår). Dataene er fra minst 50 celler fra tre forskjellige eksperimenter. *** P. 0,001, sammenlignet med kontroll og bestemmes av t-test
Basert på endringer i celle-celle adhesjon og migrasjon hastighet observert, effekter av p120ctn, E-cadherin, P-cadherin, og β- α-catenin på invasjon gjennom Matrigel ble undersøkt. Knockdown av p120ctn med to forskjellige sirnas økt invasjon gjennom Matrigel mens E-cadherin uttømming ikke påvirker invasjon (Fig. 9A, B). Knockdown av P-cadherin på den annen side ført til en økning i invasjon lik p120ctn uttømming (fig. 9). Uttømming av β-catenin, så vel som α-catenin induserte en økning i invasjon lik p120ctn og P-cadherin. For å utelukke muligheten for at forskjeller i antallet av celler på bunnen av Matrigel-belagte Transwells var på grunn av endret celleproliferasjon, ble cellene tellet 48 timer etter at de hadde blitt transfektert med sirnas. Ingen endringer i celleantall sammenlignet med kontroll siRNA-transfekterte celler ble observert (fig. 9C). Som konklusjon, knockdown av P-cadherin, β-catenin og α-catenin, men ikke E-cadherin induserte en forstyrrelse av celle-celle-kontakter og en økning i kreftcelle migrering og invasjon lik den knockdown av p120ctn.
DU145 cellene ble transfektert med de angitte sirnas for p120ctn, P-cadherin, E-cadherin, α-catenin og β-catenin, med kontroll siRNA (kontroll) eller transfeksjon reagens bare (mock). Etter 55 timer ble cellene sådd ut på Transwell membraninnsatser inneholdende et lag av Matrigel. FCS ble anvendt som en kjemoattraktant i bunnkammeret. Analyser ble stoppet etter 17 timer ved å fiksere cellene på undersiden av membranen ved hjelp av innsatsene krystallfiolett. Bilder av åtte forskjellige synsfelt ble kjøpt og celler i alle bildene telles og analysert. (A) Grafer viser data fra tre uavhengige eksperimenter, hver utført i tre eksemplarer. Resultatene er normalisert til å kontrollere. Barer representerer SEM. ** P 0,01, * p 0,05, sammenlignet med kontrollen, bestemt ved t-test. (B) Representative bilder av celler på bunnen av Transwell membraner. Skala barer = 50 mikrometer. (C) 48 timer etter transfeksjon ble cellene tellet og sammenlignet med sicontrol. Grafene viser data fra minst tre uavhengige forsøk. Resultatene er normalisert til å kontrollere. Barer representerer SEM.
Diskusjoner
p120ctn uttrykk er ofte tapt eller nedregulert i et stort utvalg av kreft hos mennesker [35] og redusert p120ctn nivåer korrelerer med svulsten klasse [36], [37], [38], [39]. Vi har vist her at uttømming av p120ctn i E-cadherin og P-cadherin-uttrykke DU145 og MCF10A celler forstyrrer celle-celle kontakter, og øker migrasjon og invasjon av DU145 cellene, som støtter en modell der p120ctn fungerer som en invasjon eller metastase demper [48]. Disse effektene korrelert med redusert uttrykk av adherens krysset proteiner E-cadherin, P-cadherin, ß-catenin og α-catenin. Det er imidlertid bare nedregulering av P-cadherin og ikke E-cadherin var i stand til å indusere en lignende fenotype til p120ctn tømming, noe som indikerer at E-cadherin ikke er nødvendig for å opprettholde celle-celle-adhesjon i DU145 eller MCF10A celler.
i motsetning til våre resultater har p120ctn blitt rapportert å være påkrevet for invasjon av E-cadherin-manglende celler delvis ved å stabilisere mesenchymale cadherins N-cadherin eller cadherin-11, som er kjent for å fremme invasjon [32]. På den annen side den kollektive invasjonen av E- og P-cadherin-uttrykkende A431-celler ble hemmet ved celle-celle-kontakter ble avbrutt enten ved p120ctn knockdown eller den samtidige knockdown av E-cadherin og P-cadherin [35]. I disse studiene HGF eller EGF henholdsvis ble brukt som chemoattractants i invasjon og migrasjonsanalyser, mens vi brukte serum. En mulighet er at p120ctn kan spesielt bidra til HGF /EGF-indusert migrering eller invasjon som det tidligere har vært knyttet til HGF- eller EGF-indusert celle spredning [40].
p120ctn er blitt vist å stimulere Rac og /eller Cdc42-aktivitet og /eller inhibere RhoA aktivitet i celler som mangler E-cadherin, inkludert fibroblaster og kreftcellelinjer [32], [41]. I kontrast, fant vi at i DU145 cellene som uttrykker P- og E-cadherin men ikke N-cadherin, gjorde uttømming av p120ctn ikke påvirke aktivitet av RhoA og Rac1. Tilsvarende, i E-cadherin /P-cadherin-uttrykke A431 celler, p120ctn uttømming endret ikke RhoA /Rac1 aktivitet [31].
Samlet utgjør disse resultatene indikerer at effekten av p120ctn på Rho GTPase aktiviteter er celletypespesifikk. Dette kan skyldes forskjeller i sammensetningen av p120ctn komplekser, for eksempel komplekser som inneholder GEFs som kunne aktivere Rac1 /Cdc42 eller hull å nedregulere RhoA [26], [41]. Interessant, i MDA-MB-231 brystkreftceller, aktivering av Rac ved p120ctn krever cadherin binding [32], som tyder på at mesenchymale cadherins kan spesielt bidra til Rac aktivitet. Selv Rho GTPase aktivitet ikke ble påvirket av p120ctn, fant vi at Rap1 aktiviteten økes i p120ctn-utarmet DU145 cellene. Rap1 er en viktig regulator av celle-celle veikryss, og aktiveres av E-cadherin engasjement [42], [43]. Forstyrrelse av adherens veikryss av ekstracellulært kalsium uttømming induserer også en økning i Rap1 aktivitet [44]. Våre resultater med p120ctn uttømming er i samsvar med hypotesen om at endocytose av E-cadherin øker Rap1 aktivitet [44].
Overraskende er det knockdown av P-cadherin, og β- α-catenin, men ikke E-cadherin ledede til forstyrrelser i celle-celle-kontakter. Antagelig P-cadherin erstatning for E-cadherin å opprettholde celle-celle kontakter, men ikke E-cadherin for P-cadherin. Denne hypotese støttes av studier i MDCK-celler, hvor det har blitt vist at E-cadherin er viktig bare for opprettelse men ikke vedlikehold av celle-celle-kontakter, mens α-catenin som var nødvendig for å opprettholde celle-celle-kontakter [45]. I tillegg, P-cadherin uttømming alene ble rapportert å indusere tap av celle-celle-kontakter og nedregulering av E-cadherin nivået i MCF10A celler [46] og overekspresjon av P-cadherin i MDA-MB-231 brystcancerceller redusert cellemigrering og invasjonen [47]. I kreft de fleste studier har konsentrert seg om sammenhengen mellom E-cadherin downregulation og økt kreft aggressivitet og invasjon, men det er også indikasjoner på at P-cadherin påvirker tumorprogresjon. For eksempel blir P-cadherin nivåer nedregulert i løpet av melanom progresjon [48] og P-cadherin ofte går tapt i prostata cancer [49]. I DU145-celler, har vi funnet at P-cadherin uttømming induserer tap av celle-celle kryss uten i vesentlig grad å påvirke nivåene av andre adherens koplings proteiner, noe som indikerer at det er den store cadherin som kreves for celle-celle-adhesjon i disse cellene.
knockdown av β- og α-catenin også indusert forstyrrelse av celle-celle kontakter og en økning i invasjonen men ikke endre p-cadherin eller p120ctn protein nivåer. Det er mulig at de påvirker lokaliseringen av P-cadherin og /eller p120ctn snarere enn nivåer. p- og a-catenins har blitt rapportert å påvirke cadherin-mediert adhesjon [15], [16], og uttømming av β-catenin i en E-cadherin-manglende cellelinje førte til en nedgang i invasjon [50], men så langt vi vet lite om sine roller i migrasjon og invasjon. β-catenin har også en viktig rolle i Wnt-signalisering og cancer celleproliferasjon som antas å være uavhengig av dens funksjon cadherin [51].
Våre resultater viser at p120ctn regulerer uttrykket nivåer av ß og α -catenin samt cadherins i DU145 cellene. Siden vi har vist at P-cadherin nivåer er viktigere enn E-cadherin i å opprettholde celle-celle-adhesjon i DU145 og MCF10A celler, postulere vi at den økte migrering og invasjon vi observere følgende p120ctn, ß-catenin eller α-catenin knockdown er enten skyldes redusert P-cadherin stabilitet eller endringer i sin lokalisering.
Materialer og metoder
sirnas
Alle sirnas brukte ble hentet fra Dharmacon (Fisher Scientific Storbritannia, Loughborough, UK). Følgende ON-TARGET
pluss
enkle oligonukleotider ble brukt targeting p120ctn (CTNND1 (1) 5′-UAGCUGACCUCCUGACUAA-3 «, (2) 5′-GGACCUUACUGAAGUUA-3′), E-cadherin (CDH1 (1 ) 5»-GGCCUGAAGUGACUCGUAAU-3 «, (2) 5’GAGAACGCAUUGCCACAUA-3»), P-cadherin (CDH3 (1) 5’GUGACAACGUCUUCUACUA-3 «, (2) 5′-GAGGGUGUCUUCGCUGUAG-3», (3) 5- «-GAAAUCGGCAACUUUAUAA-3′), β-catenin (CTNNB1 (1) 5»-GCGUUUGGCUGAACCAUCA-3 «) og α-catenin (CTNNA1 (1) 5′-GAUGGUAUCUUGAAGUUGA-3′, (2) 5»-GUGGAUAAGCUGAACAUUA-3- «). Non-targeting siRNA ble brukt som en kontroll i alle forsøkene (ON-TARGET kontroll # 1; 5»-UGGUUUACAUGUCGACUAA-3 «).
Cellekultur og trans
DU145 prostatakreftceller var dyrkes i RPMI supplert med 10% FCS, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. MCF10A mammary epitele celler ble dyrket i DMEM /F12 supplert med 5% hesteserum, 100 IU /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 20 ng /ml EGF, 0,5 ug /ml hydrokortison, 100 ng /ml koleratoksin og 5 ug /ml insulin. Celler ble sådd ut på 1,8 x 10
5 per brønn i 24-brønners plater og omvendt transfektert med sirnas (sluttkonsentrasjon 20 nM) i antibiotika-fritt medium ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Paisley, UK) i henhold til produsentens instruksjoner . Etter 6-8 timer ble cellene reseeded på 2 × 10
4 celler per brønn (DU145) eller 10
4 celler per brønn (MCF10A) for immunfluorescens og time-lapse mikroskopi og ved 1 × 10
5 per brønn (24-brønns plate) for immunoblottingforsøk og ripe sår analyser. For etablering av stabile p120ctn-utarmet DU145 cellene ble pSuperior vektorsystem (Oligoengine, Seattle, Washington) brukes. Sekvensen av shRNA oligo rettet mot human p120ctn ble utformet som beskrevet [52]. En stabil celle basseng inneholdende shRNA ble valgt i medium inneholdende 5 ug /ml puromycin. For redningsforsøk murine p120ctn-GFP [26], som ikke er følsom for shRNA targeting menneskelige p120ctn ble transient transfektert inn DU145 cellene ved hjelp Amaxa nucleofection (Lonza, Köln, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll (www.lonzabio.com) .
Immunoblotting
Celler dyrket til omtrent 80% konfluens ble vasket en gang med kald PBS og lysert i enten kalde 2 × SDS sample buffer (Invitrogen) direkte og homogenisert med en 21G nål eller i lyse -buffer (50 mM Tris pH 7,5, 1% Triton-X-100, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl
2, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM Na
3VO
4, 25 mM NaF, komplett mini EDTA-fri proteasehemmer (Roche, Welwyn Garden City, UK), PhosSTOP fosfatase inhibitor (Roche)) og deretter fjernet ved sentrifugering. Lysater ble separert ved SDS-PAGE og underkastet immunoblotanalyse. For reprobing, ble PVDF-membraner inkubert med strippebuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM β-merkaptoetanol, 2% SDS) i 20 minutter ved 65 ° C. Primære antistoffer ble brukt ved en fortynning på 1:1000: p120ctn (# 610134), E-cadherin (# 610182) ble kjøpt fra BD Biosciences (Oxford, UK), P-cadherin (# 05-916), Rac1 (# 05 -389) fra Upstate (Millipore, Watford, UK), β-catenin (# C2206), α-catenin (# C2081) fra Sigma-Aldrich (Dorset, UK), ERK (# sc-94), RhoA (# sc -418) fra Santa Cruz Bioteknologi (Insight Bioteknologi, Wembley, UK) og Rap1A /Rap1B (# 4938) fra Cell Signaling (New England Biolabs, Hitchin, UK).
