Abstract
Vi har karakterisert et nytt 21 aminosyre-peptid avledet fra antrum slimhinner Protein (AMP) -18 som formidler vekst markedsføringen av dyrkede normale epitelceller og reduserer stråling-indusert oral mukositt i dyremodeller, mens undertrykke
in vitro
funksjon av kreftceller. Målet med denne studien var å evaluere disse to potensielle terapeutiske effekten av AMP peptid i en klinisk relevant dyremodell av hode og nakke kreft (HNC) ved samtidig å vurdere dens effekt på tumorvekst og stråling-indusert oral mukositt i en orthotopic modell av HNC . Bioluminescerende SCC-25 HNC-celler ble injisert inn i det fremre tunge og svulster som ble dannet ble deretter utsatt for fokal strålebehandling. Tumorstørrelse ble målt ved hjelp av et
in vivo avbildning
system, og graden av oral mukositt ble sammenlignet mellom dyr behandlet med AMP peptid eller bærer (kontroller). Synergi mellom AMP peptid og strålebehandling ble foreslått av funn at svulster i AMP peptid /strålebehandling kohorten viste hemmet vekst vs. strålebehandling-bare behandlet svulster, mens AMP peptid-behandling forsinket utbruddet og redusert alvorlighetsgraden av stråling terapi- indusert oral mukositt. En differensiell effekt på apoptose synes å være en mekanisme ved hvilken AMP-18 kan stimulere vekst og reparasjon av skadde mukosale epitelceller, mens inhibering av proliferasjon av HNC celler. RNA microarray analyse identifisert trasé som er forskjellig målrettet av AMP-18 i HNC vs ikke-transformerte celler. Disse observasjonene bekrefter forestillingen om at normale celler og kreftceller kan reagere ulikt på vanlige biologiske stimuli, og at utnytte dette funnet i tilfelle av AMP-18 kan gi en klinisk relevant mulighet
Citation. Chen P, Mancini M, Sonis ST, Fernandez-Martinez J, Liu J, Cohen EEV, et al. (2016) A Novel Peptide for Samtidig Forbedret behandling av hode og nakke kreft og Mitigation av oral mukositt. PLoS ONE 11 (4): e0152995. doi: 10,1371 /journal.pone.0152995
Redaktør: Craig Murdoch, University of Sheffield, Storbritannia
mottatt: 01.10.2015; Godkjent: 22 mars 2016; Publisert: 06.04.2016
Copyright: © 2016 Chen et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Cancer Institute (www.cancer.gov): CA 176 032 til FGT. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Biomodels, LLC. gitt støtte i form av lønn for forfattere MM, STS og JFM, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er artikulert i forfatterens Bidrag delen
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser. Maria Mancini, Stephen T. Sonis og Juan Fernandez-Martinez er ansatt Biomodels, LLC. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endret ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
Til tross for sin hyppighet, alvorlighetsgrad og symptomatisk og økonomiske konsekvensene, er det ingen effektiv intervensjon for oral mukositt (oM) indusert av kjemoterapeutiske eller strålebehandling regimer (CRT) som brukes til å behandle hode og nakke kreft (HNC) [1-4]. Klinisk er OM preget av slimhinnene sammenbrudd resulterer i omfattende, dype sår, alvorlig funksjons altering smerte, økt risiko for sekundære infeksjoner, bakteriemi og sepsis, og utvidet behov for gastrostomi feedings, og ambulerende og innlagte pasienter støttebehandling. Nesten alle pasienter som mottar CRT for behandling av HNC utvikle minst moderat OM; mer enn to tredjedeler lider av alvorlige former for tilstanden.
Gjeldende standardbehandling for mukositt er overveiende palliativ mens fokusert på smerte kontroll og vedlikehold av ernæring. Den eneste godkjente behandling for mukositt hittil er palifermin (Kepivance®), og dens anvendelse er begrenset til mukositt hos pasienter som gjennomgår kondisjoneringsregimer før hematopoetisk stamcelletransplantasjon [5].
Kompleksiteten i mukositt som en biologisk prosessen har bare blitt verdsatt nylig [6-8]. Det har blitt foreslått at tilstanden representerer en sekvensiell interaksjonen av orale slimhinneceller og vev, reaktive oksygenforbindelser, pro-inflammatoriske cytokiner, mediatorer av apoptose, og lokale faktorer som spytt og munnfloraen. Det ser ut til at de tidlige forandringer assosiert med strålings-indusert toksisitet mucosal skje innen endotelet, og bindevevet i submukosa [6]. Dette til slutt resulterer i skade og forstyrrelse av epitelial barriere, den mest kritiske trinnet i utviklingen av mukositt. Epitelial barrierefunksjon avhenger i stor grad av inter veikryss på apikale-de fleste områder av plasmamembranen, dvs. de tett veikryss (TJs) som regulerer paracellulære permeabilitet over epitelet i monolagscellekulturer og
in vivo product: [9 ].
Vi har identifisert og karakterisert en ny 21-aminosyrepeptid avledet fra aminosyrer 77-97 av antrum Mucosal Protein (AMP) -18, også kjent som gastrokine-1 (GKN1) [10-12 ], som ble først oppdaget i epitel-celler i mageslimhinnen [10]. Både AMP-18 og peptidet beskytte mot og hastighet utvinning fra mucosal skade i dyremodeller av OM indusert ved stråling og /eller kjemoterapi som brukes for å behandle pasienter med HNC [13, 14]. Den peptid kan lett syntetiseres, og viser langsiktig stabilitet. I en musemodell av OM indusert av en enkelt dose av stråling til snute, AMP peptidet administrert en gang daglig i fire dager før bestråling og fortsatte 10 dager etterpå effektivt hindret fullstendig tap av tungen epitel observert hos bestrålte mus som fikk bærer (saltvann) [13 ]. I etablerte hamster OM modeller indusert av en enkelt dose av stråling, fraksjonert stråling, eller fraksjonert stråling sammen med cisplatin for å simulere vanlige behandlinger av HNC, daglig subkutan administrering av AMP peptid forsinket starten på slimhinne erytem, reduserte alvorlighetsgraden av sårdannelse og akselerert oral slimhinnene utvinning i alle tre modeller, sannsynligvis delvis av sin anti-apoptotiske effekter sett i kulturer av epitel og endotelceller [14].
i motsetning til andre for tiden praksis eller symptomlindrende midler nå i bruk for å behandle oral mukositt, AMP peptid og rekombinant humant (rh) AMP-18 ser ut til å unikt målrette TJs som kobler tilstøtende epitelceller ved å øke opphopning av TJ proteiner, noe som begrenser deres tap i løpet av skade, og legge til rette for dannelse av nye TJs følgende mucosal barriere skade [12, 15]. Dette TJ-forsterke effekten er nært knyttet til omorganisering av perijunctional aktin og dannelse av » polaritet protein «komplekser. AMP-18 ser ut til å oppnå de terapeutiske effekter ved binding til gastrin /cholecystokinin B reseptor (CCKBR) og aktivering av flere signalveier som MAPK, PI3K /AKT, RhoA og PKCζ [13, 15, 16].
for å fortsette utviklingen av AMP peptid som en effektiv og trygg terapeutisk agent, dens virkninger på veksten av kreftceller i innstillingen av strålebehandling protokoller
in vivo
ble undersøkt i en xenograft modell ved hjelp inokulert menneskelig carcinoma celler til generere tumorer i nakne rotter [14]. Vi rapporterte at midtstrålebehandlingen betydelig redusert tumorvolumet som forventet. Uventet, administrering av AMP peptid vesentlig tilsatt til strålings-indusert veksthemming, som viser tumor suppressor egenskapen av AMP-18 vi og andre observert tidligere [11, 17, 18]. Sammen disse funnene antydet at AMP peptid behandling av OM ikke ville forstyrre den terapeutiske effekten av stråling protokoller i behandling av hode og nakke svulster, eller fremme veksten av kreftceller, men kan i stedet sensitivkreftceller til stråling.
i denne studien vi setter ut for å finne ut om AMP-18 kan bevisst HNC celler til kjemoterapi, og også demonstrere i samme dyr, gunstige effektene av munnslimhinnen beskyttelse sammen med undertrykkelse av tumorcellevekst etter strålebehandling.
Materialer og metoder
Material
kjemisk syntetisert AMP peptid (LDALVKEKKLQGKGPGGPPPK), en egge peptid (GKPLGQPGKVPKLDGKEPLAK), og rekombinant human (rh) AMP-18 ble utarbeidet av GenScript (Piscataway, NJ) som tidligere beskrevet [13]. Kort, rhAMP-18 er uttrykt og renset som Hans
6-tagget fusjonsprotein. Den kodende sekvensen for full-lengde human AMP-18 ble klonet inn i en
E
.
coli
ekspresjonsvektor, pGSE3, og det uttrykte protein ble renset fra 5 l av kulturmediet ved affinitets kolonnekromatografi. AMP peptid og rhAMP-18 ble funnet å være like effektive i å utløse cellulære responser som tidligere rapportert [13-15]. Cellekulturmedium, føtalt bovint serum (FBS), penicillin og streptomycin ble oppnådd fra Gibco BRL, Life Technologies (Gaithersburg, MD). Tumor nekrose faktor (TNF) -α ble kjøpt fra Peprotech (Rocky Hill, NJ), og andre reagenser fra Sigma-Aldrich mindre annet er spesifisert.
Cellekulturer
For å undersøke effekten av behandling med AMP peptid eller AMP-18 i kreftceller eksponert for cisplatin, to etablerte humane HNC cellelinjer som ble vist i preliminære studier for å oppvise forskjellig sensitivitet til cisplatin ble anvendt: SCC-25 (American Type Culture Collection, ATCC CRL1628) (Manassas, VA) som er mer følsom enn SCC-61 [19]. SCC-25 cellelinjen har blitt opprettholdt i forfatternes lab i 3 år; SCC-61 celler ble etablert og godkjent av Weichselbaum
et al
. [20-22], mottatt som en gave, og opprettholdt i 4 år. Celler ble dyrket i en 1: 1 blanding av Dulbeccos modifiserte Eagles medium og Hams F12-medium inneholdende 1,2 g /l natriumbikarbonat, 2,5 mM L-glutamin, 15 mM HEPES og 0,5 mM natriumpyruvat, og supplert med 400 ng /ml hydrokortison, 10% FBS, penicillin (50 U /ml) og streptomycin (50 ug /ml), ved 37 ° C i en fuktet inkubator supplert med 5% CO
2. SCC-25 og SCC-61-celler (2 x 10
3 /brønn) ble dyrket på 96-brønners plater i 24 timer i medium inneholdende 1% FBS, og ble deretter forblir ubehandlet, utsatt for cisplatin bare (2 uM for SCC-25-celler, 10 um for SCC-61-celler), cisplatin i nærvær av 2 ug /ml AMP peptid, eller rhAMP-18 (oppløst i fosfatbufret saltoppløsning, PBS, kjøretøy) i 48 timer. Celleviabilitet ble analysert ved CellTiter-Blue reagens ved hjelp av en mikroplateleser (Bio-Tek, Winooski, VT). Forsøk ble utført i fire paralleller. Human, voksen, (lav konsentrasjon) Kalsium, forhøyet temperatur (HaCaT) hud keratinocytter, et ikke-omformet cellelinje som brukes til å modellere normal stratifisert plateepitel i munnslimhinnen [23], ble oppnådd fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) og opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium med FBS, penicillin og streptomycin, som beskrevet [13] i 5 år. Oral tert-2 udødelig keratinocytter ble ansett som en celle modell for å sammenligne med munnhulekreft [24], men HaCaT cellelinjen ble valgt fordi det har blitt mer allment brukt til dette formålet.
Opprettelse av ortotopiske Modell av HNC i Nude Mice
for å studere mulige synergieffekter av AMP peptid på å begrense veksten av kreft celler samtidig beskytte mot oM i samme dyr, en orthotopic modell av HNC ble brukt. Svulster i tungen ble samlet, deres størrelse ble vurdert ved hjelp av en
in vivo
bildesystem (IVIS), og graden av strålingsinduserte OM ble sammenlignet mellom dyr behandlet med AMP peptid eller bærer (kontroller). Animal bruk ble godkjent av Biomodels «Institutional Animal Care og bruk Committee (12-1016-01). Riks Laboratory Animal Welfare forsikring nummer er A4591-01.
Basert på foreløpige
in vivo
studier, ble SCC-25 celler merket med en lentiviral dual bioluminescent og fluorescerende bildebehandling vektor UBC-GFP -T2A-Luciferase (LUC) (System biovitenskap, Inc., Mountain View, CA), og injisert i fremre tungen til å danne svulster. Disse bioluminescerende SCC-25-celler, referert til som SCC-25-LUC, aktiverer
in vitro
utvalg av positive celler ved strømningscytometrisk sortering ved hjelp av grønt fluorescerende protein (GFP) og ikke-invasiv overvåking av cellulære dynamikk under anvendelse av en
in vivo
bildesystem (IVIS) (Perkin Elmer) for å måle tumorstørrelsen. SCC-25-LUC-celler ble sortert 3 ganger etter BD FACSAria (BD Biosciences), slik at GFP-positive celler var mer enn 95% (data ikke vist). Følsomheten og nøyaktigheten av
in vitro
og
in vivo
celleovervåkning tilbyr flere fordeler i forhold til tradisjonelle metoder som krever ofre dyr og histologisk analyse. I tillegg har histopatologiske korrelerer med de kliniske endringer vurderes i modellen blitt grundig dokumentert [13, 25], slik at histologi var ikke en del av denne studien.
atymiske nakne mus (Foxn1
nu ) (alder 6 til 8 uker, kroppsvekt 29,5 ± 2,0 g) ble innkjøpt fra Charles River Laboratories. Mus ble bedøvd med isofluran, og 1 x 10
6 SCC-25-LUC-celler suspendert i 30 pl 1 x HBSS ble injisert direkte inn i den fremre tungen ved hjelp av en 0,1 ml tuberkulinsprøyte med en 30 gauge nål, som beskrevet av Myers
m.fl.
. [26]. Etter 21 dager for å tillate tumorvekst, ble totalt 32 mus randomisert inn i 4 grupper (8 mus /gruppe) basert på en kvantitativ vurdering av tumor størrelse som bestemmes av total fluks fra hver tumor målt ved IVIS bildebehandling [27].
dagen for randomisering ble betegnet dag 0. Dyrene i gruppe 1 ble ikke behandlet, gruppe 2 mus mottok bærer (PBS), og grupper 3 og 4 mottas AMP peptid med en dose på 25 mg /kg en gang daglig ved subkutan (sc) injeksjon. På studie dag 4 ble dyrene i gruppene 2 og 4 gitt en enkelt akutt dose på 30 Gy av stråling rettet mot tungen for å behandle tumorer og indusere OM. Modellen isolerer målvevet (tunge) med en blyskjerm, og dermed unngå systemisk toksisitet. Etter administrasjon av anestesi, ble musene utstrålt med å bruke en 160 kilovolt potensial (18.75-ma) kilde ved en brennvidde på 15 cm, herdet med en 3,0 mm Al filtreringssystem. Behandling med AMP peptid eller vehikkel ble fortsatt i 14 dager.
Dyrene ble bedøvet, deres tunger forsiktig ekstrudert under anvendelse av en pinsett og fotografier ble tatt for å dokumentere tumorprogresjon. Tumorvekst ble målt og sammenlignet på dagene 5, 8, 10 og 14 ved hjelp av IVIS etter injeksjonen av D-luciferin. Etter bildene ble tatt, ble OM scoret klinisk, og dyrene ble avbildes ved hjelp av IVIS system. Før avbildning, mus ble injisert med 0,1 ml /20 g kroppsvekt av 15 mg /ml D-luciferin-K
+ bioluminescent substrat i PBS. Ti minutter etter injeksjonen ble musene bedøvet og anbragt i den IVIS® Lumina ved maksimal følsomhet i opptil 5 minutter eksponering for å detektere bioluminescens med en åpen utslipp filter. Lagrede bilder ble lastet inn Stue Image® analyse programvare og fargeskalaer ble matchet basert på maksimal og minimal utstråling (fotoner /andre /cm
2 /steradian). Identiske regioner av interesse ble trukket for hvert dyr og total fluks ble bestemt i form av fotoner /sekund for hver region av interesse.
Oral mukositt
Utbruddet og progresjon av OM ble scoret klinisk hjelp et veletablert seks punkts skala: Grade 0, ingen avvik. Grad 1, lett slimhinne endringer preget av områder med mild erytem, slimhinnen intakt. Grad 2, milde mukositt definert av områder med moderat til alvorlig erytem og overfladisk epitel nekrose slik at det kan være mild sloughing, men epithelial base er intakt. Grad 3, moderat mukositt preget av frank sårdannelse. Sår vanligvis har områder av nekrose med tilhørende gulaktig /grå farge med pseudomembrane formasjon. Akkumulert område av sårdannelse ≤ 25% av tungen areal. Grad 4, alvorlig mukositt med sårdannelse påvirker 25% til 50% av tungen mucosa. Merket erytem og pseudomembrane formasjon. Tap av smidighet. 5. klasse, alvorlig mukositt sår dannelse av praktisk talt alle slimhinner områder i fare. Tap av mobilitet og bøyelighet [25, 28, 29]. Resultater av 1 og 2 indikerer milde stadier av mukositt. Ulcerøs mukositt er karakteristisk for karakterer 3-5 med grad 3 og 4 representerer alvorlige stadier av tilstanden. Representative bilder av denne skalaen er definert i figur 1. Etter visuell klinisk score, ble et fotografi tatt av hvert dyr munnslimhinnen ved hjelp av en standardisert teknikk. Ved avslutningen av forsøket, ble fotografier tilfeldig nummerert og scoret av to uavhengige, kvalifiserte observatører som graderte bildene i blindet måte ved hjelp av den ovennevnte skala (blindet scoring). For hvert bilde, ble selve blindet poengsum basert på gjennomsnittet av de 2 observatørenes score. Bare score fra blindet, fotografisk evaluering ble rapportert og brukt til statistiske analyser.
Representative bilder av stråling-indusert mukositt brukes for scoring vises. Se detaljer i metoder.
Dyrene ble veid og kontrollert for generell helse daglig. I tillegg til standarddiett, ble alle dyr gitt svært velsmakende myk mat i deres bur. Gruppe vektendring ble registrert som en gjennomsnittlig prosent vektendring.
Sodium Dodecyl Sulfate-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og Immunoblotting analyse av caspase 3 Cleavage
For å finne ut hvilken rolle apoptose som en rørledning for ulike AMP-18 effekter på normal epitel og HNC kreftceller, ble caspase 3 spalting brukt som en indeks på celle apoptose og sammenlignet i ikke-omformet HaCaT og HNC SCC-25-celler utsatt for TNF-α ved hjelp av immunblotting. For å forberede cellelysater ble kulturene skylt og deretter høstet i avkjølt PBS ved å skrape den monolayer med en celle løfteren. De frigjorte celler ble pelletert ved 4 ° C og ekstrahert på is i 30 minutter i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,25% natrium-deoksycholat, 150 mM NaCl, 100 mM NaF, 10 % glyserol, 10 mM EDTA) inneholdende protease og fosfatase-inhibitorer (2 mM natrium ortovanadat, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 50 ug /ml antipain, 1 ug /ml aprotinin, 1 pg /ml leupeptin, og 1 ug /ml pepstatin). Cellelysater ble avklart ved sentrifugering ved 14000 x
g
i 15 minutter ved 4 ° C. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA-analyse (Pierce).
For immunblotting-analyser, 30 til 50 ug protein /kjørefelt ble løst ved hjelp av SDS-PAGE, overført til Immobilon-membraner (Millipore, Bedford, MA), etterfulgt av blokkering med 5% bovint serumalbumin i TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 ved pH 7,5), og inkubert med angitte antistoffer. Etter inkubasjon med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundære antistoffer, var immunoreaktive bånd visualisert ved hjelp av kjemiluminescens (ECL, Amersham Biosciences). Når reprobed, ble blottene først strippet med en buffer inneholdende 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, og 0,1 M 2-merkaptoetanol. Bilder ble analysert ved densitometri. De immunoblotter vist i figuren representerer en av minst tre forsøk.
RNA microarray analyse Sammenligning transformerte og HNC celler behandlet med AMP-18
For å definere differensial biologisk effekt og relevans AMP- 18 på normal og svulstvev, og å identifisere mulige sti genet mål som kunne megle de to terapeutiske effektene vi sammenlignet effekten på genuttrykk av kultivert ikke-omformet (HaCaT) eller plateepitelkarsinom celler behandlet med AMP-18.
Vi [13, 14] og andre [30-34] har utnyttet den menneskelige foreviget ikke-omformet hud keratinocyte HaCaT linjen [23] for å modellere i munnslimhinnen epitel og for sammenligning med plateepitelkreft i hode- og nakkekreftceller, mens immortalisert oral TERT-2 keratinocytter er blitt anvendt mindre ofte til å modellere oral mukositt.
Total RNA ble ekstrahert fra SCC-61 og HaCaT-celler, med eller uten AMP-18-behandling, ved bruk av RNeasy-sett (Quiagen) i henhold til produsentens spesifikasjoner. RNA integritet og konsentrasjon ble vurdert ved hjelp av en Agilent Bioanalyzer 2100. Total RNA ble behandlet i biotinylert cRNA bruker Illumina® TotalPrep ™ -96 RNA Amplification Kit (Ambion, katt nr: 4393543). CRNA ble hybridisert til Illumina HumanHT12v4 matriser ved hjelp Illumina gitt protokoller og skannet med en Illumina HiScan i University of Chicago Genomics Core-laboratorier.
Ved hjelp av microarray data fra HaCaT og SCC-61 celler hentet på 2 timer og 24 timer etter eksponering for AMP-18 (og ingen behandlingskontroll), brukte vi en tilnærming som er optimalisert en innledende overvåket komponent med påfølgende statistisk drevet hierarkisk rangering. Gener som var mest diskriminerende mellom de to gruppene ble rangert i henhold til deres diskriminerende verdi som er definert av deres Fishers forholdet hvori den prediktive nøyaktigheten av de forskjellige bestilte reduserte settene ble bestemt ved anvendelse av en bakovervendende trekk eliminering algoritme. Denne fremgangsmåten elimineres redundante eller irrelevante gener for å gi den mest presise sett av gener med størst prediktiv verdi. Vi vurderte deretter de differensielt uttrykte gener for sykdom attribusjon, sti forening, og genet ontologi hjelp GeneAnalytics programvare og testet funksjonelle /fenotypiske foreninger som bruker VarElect [8, 35, 36]. De 20 beste genene forskjellig uttrykt i SCC-61 og HaCaT celler behandlet med AMP-18 i 2 timer er vist i S1 tabell.
Statistiske analyser
mukositt ble scoret ved hjelp av anonymiserte fotografier, begynner på dag fire, og for hver dag etterpå. Statistiske forskjeller mellom behandlingsgrupper ble bestemt ved bruk av Mann-Whitney Rank Sum test og chi-kvadrat analyse med en kritisk verdi på 0,05. Effekten av medikamentbehandling på mukositt sammenlignet med bærerkontroll ble vurdert i henhold til de følgende parametre: 1. Forskjellen i antall dager mus i hver gruppe hadde alvorlig mukositt (score ≥ 3) ble analysert. På hver dag ble dyrene mottok (evaluering dag), ble antallet dyr med en blindet mukositt score på ≥ 3 i hver behandlingsgruppe sammenlignet med bærergruppen. Forskjeller ble analysert på en daglig samt en kumulativ basis. Behandling suksess ble bestemt av en statistisk signifikant lavere antall mus med dette resultatet i en behandlingsgruppe, kontra kjøretøy, som bestemmes av chi-kvadrat analyse. 2. Rank Sum forskjeller i daglige mukositt score i behandlingsgruppene versus kjøretøygruppe ble bestemt. For hver evaluering dag resultatet av bærergruppen ble sammenlignet med den i de behandlede grupper ved hjelp av ikke-parametrisk rang sum analyse. Behandling suksess ble bestemt av en statistisk signifikant reduksjon av score i den behandlede gruppen på to eller flere dager fra dag 4 til dag 14. En enveis ANOVA eller ANOVA på rekkene ble brukt til å evaluere arealet under kurven for dyr vekter og Ivis målinger. Data ble analysert med Minitab programvare (Minitab, State College, PA). Grupper ble sammenlignet med to-halet
t
test, eller for mer enn to grupper, ved analyse av varians. Vi vurderte
P
≤ 0,05 betydelig.
Resultater
hemmende effekter av AMP Peptide og rhAMP-18 på HNC Cells
For å undersøke effekten av AMP peptid eller AMP-18 på HNC celler i kultur, menneskelige hode og hals plateepitelkarsinom SCC-25 (figur 2, panel A) og SCC-61 (panel B) celler ble stående ubehandlet, utsatt for AMP-18 (2 mikrogram /ml), cisplatin (2 uM for SCC-25-celler, 10 uM for SCC-61-celler) bare, cisplatin i nærvær eller fravær av AMP peptid eller rhAMP-18. Celleviabilitet ble vurdert med CellTiter-Blue® celleviabilitet assayreagenser (Promega) ved hjelp av en mikroplateleser. AMP-18 alene hemmet veksten av SCC-25 (P = 0,02) og SCC-61 (P = 0,04) celler ved hjelp av 10-15% (figur 2). Cisplatin signifikant hemmet veksten av begge cellelinjer: SCC-25-celler med 25%, og SCC-61-celler med 50% sammenlignet med kontrollkulturer (P 0,001). Tilsetning av enten AMP peptid eller rhAMP-18 forsterket cytotoksisitet av cisplatin ved å hemme vekst av SCC-25-celler ved 30% (AMP peptid, P = 0,013; rhAMP-18, P = 0,03) og SCC-61 celler ved 65 % (P 0,05) og 75% (P 0,02)., henholdsvis
SCC-25 (A) eller SCC-61 (B) celler ble ubehandlet, utsatt for AMP-18 (2 ug /ml), cisplatin (2 uM for SCC-25-celler, 10 uM for SCC-61-celler) bare, cisplatin i nærvær av 2 ug /ml AMP peptid, eller rhAMP-18 i 48 timer. Cellenes levedyktighet ble analysert ved CellTiter-Blue-reagens. Forsøk ble utført i fire paralleller. Verdier er gjennomsnitt ± SE. Tilsetning av enten AMP peptid eller rhAMP-18 forsterket cytotoksisitet av cisplatin ved å hemme vekst av SCC-25-celler ved 30% (AMP peptid, P = 0,013; rhAMP-18, P = 0,03) og SCC-61 celler ved 65 % (P 0,05) og 75% (P 0,02), henholdsvis
AMP Peptide Behandling additivt hemmer kreft vekst med Stråling
Forrige bevis for at AMP peptid kan bevisstgjøre kreftceller. for stråling i en xenograft modell [14] og to menneskelige HNC cellelinjer til cisplatin i kultur (fig 2), sammen med våre undersøkelser med mus og hamstere at behandling med peptidet hatt gunstige kliniske effekter i radiation- og cisplatin-indusert OM [ ,,,0],13, 14], ledet oss til å spørre om disse to virkningene av AMP peptid kan bli demonstrert i en orthotopic modell av HNC i samme dyr. Fire grupper av dyr ble undersøkt: 1. ubehandlet; 2. PBS (kjøretøy) og stråling; 3. AMP peptid; og 4. AMP peptid og stråling.
For å fastslå effekten av behandlingen med AMP peptid på tumorprogresjon med og uten strålebehandling, ble svulster alle dyrene vurdert ved hjelp av IVIS system. I ikke-bestrålte mus, de ortotopiske svulster i tungen vokste gradvis, og administrasjon av AMP peptid ikke endre størrelsen på svulsten betydelig (gruppe 1 og 3) (fig 3). På dag 5 og 8 Ivis verdier for ubehandlet (6,59 × 10
7 ± 9,6 × 10
6) og AMP peptid behandlet (6,50 × 10
7 ± 8.67 × 10
6) var ikke statistisk annerledes, som også var tilfellet på dag 10 og 14 når Ivis verdier for ubehandlet (1,78 × 10
8 ± 2.47 × 10
7) og AMP peptid behandlet (1,61 × 10
8 ± 2.32 × 10
7) ikke forskjellig. I mus som ble gitt stråling (30 Gy), svulststørrelsen målt som midlere IVIS utstråling, fortsatte å vokse med PBS (kjøretøy) behandling (gruppe 2), men forble uendret med AMP peptid behandling mellom Dager 5 og 8 og Dager 10 og 14 ( gruppe 4) (fig 4). Tumorstørrelse (gjennomsnitt ± SE) i utstrålte mus, gitt AMP peptid sammenlignet med mus som fikk PBS, ble signifikant redusert (p = 0,03) når de vurderes på dagene 10 og 14 (fig 4). Denne observasjon antydet at AMP peptid ikke interferere med evnen av fokuserte stråling for å hemme cellevekst, men snarere stanset veksten av kreftceller.
en ortotopisk modell av HNC kreft ble etablert ved å inokulere bioluminescent SCC-25-LUC celler i den fremre tunge på nakne mus. Tumorstørrelse i forskjellige grupper ble undersøkt og sammenlignet på dag 5 og 8, samt Dager 10 og 14 ved hjelp av IVIS etter injeksjonen av D-luciferin. Mus i gruppe 1 og gruppe 3 ble ikke bestrålt, mens dyrene i gruppene 2 og 4 mottok 30 Gy på dag 0 i undersøkelsen. Behandling med PBS (gruppe 2) eller AMP peptid (gruppe 4) ble administrert ved injeksjon s. c. en gang om dagen. I de bestrålte musene ble behandlingen med AMP-peptid forbundet med mye lavere IVIS stråleglans sammenlignet med behandling med PBS, noe som indikerer at AMP peptid redusert tumorvekst. Representative Ivis bilder av tunge svulster fra 32 mus vises.
Bestrålte dyrene ble behandlet med AMP peptid eller PBS, og IVIS utstråling ble målt på dag 5 og 8, og deretter på dag 10 og 14. middelverdier ± SE ble sammenlignet. Hos mus gitt PBS, IVIS utstråling syntes å øke mellom dag 5 og 8 og 10 og 14, mens utstråling i dyr behandlet med AMP peptid var uendret fra Days 5 til 14. På dag 10 og 14, behandling med AMP peptid betydelig redusert tumorstørrelse sammenlignet med behandling med PBS (* P = 0,03). I ikke-bestrålte mus, de ortotopiske tumorer i tungen vokste progressivt; administrasjon av AMP peptid ikke endre tumorstørrelse signifikant (ikke vist).
AMP peptid ikke viser noen negative effekter på kroppsvekt. Mus i alle 4 grupper utstilt vekttap etter svulster ble etablert i tungen som ble mer markert i bestrålte dyr (data ikke vist).
terapeutiske effekten av AMP Peptide på stråleindusert Oral mukositt
etter avtale med resultatene fra tidligere studier, AMP peptid dempet utviklingen oral mukositt forårsaket av stråling [14]. Mens Strålings kontroll (PBS) dyr alle utviklet ulcerøs mukositt (gruppe 2) ved dag 12, ble bare 37,5% av AMP-behandlede dyr (Group 4) så påvirket (P = 0,03), mens på dag 11, mucosal sårdannelse dukket opp i 62,5 % i gruppe 2, men ingen gitt AMP peptid (P = 0,003) (fig 5). Således AMP peptid forsinket inntreden av ulcerøs mukositt og positivt påvirket dens varighet.
Bestråling av tungen og munnslimhinnen ble etterfulgt av daglig behandling med AMP peptid eller bærer (PBS). Ulcerøs oral mukositt som utviklet ble scoret som beskrevet i
Metoder
. En mukositt score på 3,0 (stiplet) viser mucosal sårdannelse som korrelerer med betydelige menneskelige oral mukositt. Dyr behandlet med bilen nådde en score på 3 på dag 12, mens mus behandlet med AMP peptid ikke. Mukositt minutter ble signifikant lavere på dagene 11 (* P = 0,003) og 12 (** P = 0,03), men ikke dag 13 (p = 0,1) i dyr som ble behandlet med AMP peptid sammenlignet med de som er gitt i kjøretøyet. Verdier er gjennomsnitt ± SE.
AMP-18 hemmet apoptose i HaCaT men ikke i HNC Cells
Nyere resultater fra våre studier [10-15] og andre [17] tyder på at AMP-18 har pleiotrope effekter. AMP-18 stimulerer vekst og er anti-apoptotiske i epitel-celler, inkludert HaCaT keratinocytter [13]. Det ser også ut til å fungere som en tumor suppressor [37], eventuelt ved å indusere apoptose [38], inhibering av epiteliale-mesenkymale overgang (EMT) og kreftcellevandring [39], og /eller indusere cellulær senescens [40]. Faktisk er uttrykk for AMP-18 nedregulert eller fraværende i magekreft vev [11, 17, 18], og minker som kronisk gastritt utvikler seg til bli svekket og metaplasi [40, 41].
For å finne ut om apoptose kunne
