Abstract
Selv om prostatakreft (PCA) har langsom progresjon, hormon ildfast (HRCP) og metastatisk enheter er vesentlig dødelig og mangler effektive behandlinger. Transkripsjonsfaktor Slug er avgjørende i å regulere metastaser i ulike tumorer inkludert PCa. Her studerte vi målrettet terapi mot Slug bruker kombinasjon av 3 legemidler rettet mot 3 veier henholdsvis konvergerende via Slug og ytterligere regulerer PCa metastasering. Ved hjelp av
in vitro
analyser vi bekreftet at Slug oppregulering pådratt hemming av E-cadherin som var anti-metastatisk, og hemmet Bim-regulert celle apoptose ved PCA. Upstream PTEN /Akt, mTOR, ERK, og AR /HSP90 trasé var ansvarlige for Slug oppregulering og hver av disse kan bli målrettet av rapamycin, CI-1040, og 17-AAG hhv. I 4 PCA cellelinjer med ulike egenskaper i form av PTEN tap og androgen følsomhet testet vi effekten av mono- og kombinasjonsbehandling med legemidler. Vi har funnet at metastatiske kapasitet av cellene ble inhibert maksimalt bare når alle 3 stoffene ble slått sammen, på grunn av krysstale mellom banene. 17-AAG synker Slug uttrykk via blokade av HSP90 avhengige AR stabilitet. Kombinasjon av rapamycin og CI-1040 reduserer invasivitet mer potent i PCA celler som er androgen ufølsom og med PTEN tap. Slug hemmet Bim-mediert apoptose som kan bli reddet av mTOR /Erk /HSP90-hemmere. Ved hjelp av musemodeller for sirkulerende PCa DNA kvantifisering, fant vi at kombinasjonen av mTOR /Erk /HSP90 hemmere redusert sirkulerende PCA celler
in vivo
betydelig mer potent enn kombinasjon av to eller monoterapi. Sikkert, kombinasjon av mTOR /Erk /HSP90 hemmer metastaserende kapasitet for prostatakreft via Slug hemming
Citation. Ding G, Feng C, Jiang H, Ding Q, Zhang L, Na R, et al. (2013) Kombinasjon av Rapamycin, CI-1040, og 17-AAG Hemmer metastatisk Kapasitet av prostatakreft via Slug Hemming. PLoS ONE 8 (10): e77400. doi: 10,1371 /journal.pone.0077400
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 22 april 2013; Godkjent: 02.09.2013; Publisert: 10. oktober 2013
Copyright: © 2013 Ding et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Ungdoms Elites Scientific finansiering av Fudan University (No.144) og Youth Scientific finansiering av National Natural Science Foundation of China (NSFC-81202002). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er en vanlig svulst, som fortsatt rangerer høyt som den ledende dødsårsaken blant urologiske kreftformer, og forblir den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn [1]. Selv tidlig deteksjon av PCA har forbedret klinisk utfall, metastatisk PCa og hormon ildfast prostatakreft (hrpc) er fortsatt en av de mest utfordrende kliniske problemer, noe som fører til et sent stadium hendelse med en dårlig prognose. PCA har en slående tendens til å metastasere til ben. Den 5-års overlevelse av primær prostatakreft nærmer seg 100%, og likevel synker til 33% hvis bein metastasering er diagnostisert [2]. Androgen-deprivasjon terapi (ADT) er i dag foreslått for menn som er diagnostisert med eller utvikle avansert eller metastatisk PCa etter lokalbehandling [3]. Dessverre, motstand mot ADT til slutt kommer ut, vanligvis manifestert som tumor-gjenvekst forbundet med en økning i serum prostata-spesifikt antigen (PSA) nivåer, og i tilfelle av prostatakreft, er dødelig utfall vanligvis assosiert [4,5]. Tradisjonelle terapeutiske strategier (kjemoterapi og strålebehandling) er ofte forbundet med utilfredsstillende resultater i denne populasjonen. Derfor har målrettet terapi dukket opp som et lovende alternativ modalitet for pasienter med metastatisk PCa eller HRPC. Utvikling av mer effektive terapeutiske intervensjoner basert på de molekylære studier av hvilke svulster utvikler resistens mot terapeutiske legemidler er derfor et presserende behov. Nyere arbeider har vært med sikte på å identifisere viktige molekyler involvert i metastaser som terapeutiske mål.
Slug (Snai2) er et medlem av Snail familien, som er en sink-finger transkripsjonsfaktor. Det er også en av de virveldyr-spesifikke gener assosiert med sneglen. Det har blitt confimred i en rekke in vitro-studier at Slug er kritisk for metastase og invasjon evne av kreftceller [6,7]. Studier har også vist at Slug uttrykk kan økes i visse organer (bryst og mage tumor vev), men decresed i andre (for eksempel kolon, eggstokk og spiserør normalt vev). Vår tidligere studie viser at Slug protein er sterkt uttrykt i prostata kreft vev, og at Slug protein er uttrykt i PC-3, LNCaP, DU-145, og 22RV1 PCA cellelinjer. Dens uttrykk kan bli utsatt for regulering på transkripsjon eller post-oversettelse modifisering. Vi har også funnet at Slug proteinet er sterkt uttrykt i tumorprøver, men ikke i normal prostatavev [8]. Derfor, i denne studien tar vi sikte på å studere hvordan Slug er innblandet i metastatisk kapasitet PCa og teste effekten av målrettet terapi mot Slug relatert trasé.
Materialer og metoder
reagenser
Rapamycin, CI-1040, 17-AAG, DHT (0,1 mg /ml) og primære antistoffer av Slug (kanin), PS6 (pSer235 /236, kanin), Pakt (pSer473, kanin), PTEN ( kanin), HIF-1α (mus), ble HSP90 (kanin), AR (kanin), og β-aktin (mus) kjøpt fra Sigma-Aldrich, München, Tyskland. Antistoffer over Perk (pThr202 /pTyr204, kanin), og Erk (kanin) ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Sekundære antistoffer ble kjøpt fra Santa Cruz, USA. Den SuperSignal West Pico kjemiluminescenssubstrat kit (Thermo Scientific, IL) ble brukt. Menneske Slug og kontroll sirnas ble kjøpt fra Santa Cruz.
Cell kultur
Menneskelig DU145, PC-3, LNCaP og 22RV1 prostata adenokarsinom cellelinjer var kommersiell og ble kjøpt fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). LnCap og 22RV1 celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (PAA, Tyskland) med 10% føtalt bovint serum (FBS) (PAA). DU145 og PC-3-celler ble dyrket i Hams F-12 media (Gibco, NY) med L-glutamin (300 mg /l, NaHCO
3 1,5 g /l) og 10% FBS. Celler ble inkubert med 5% CO
2 ved 37 ° C.
Western blotting
Total protein fra lysater ble ekstrahert og renset. Lik protein mengde av 25 ug ble fylt på 10% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel for elektroforese. Gelene ble deretter overført til nitrocellulosemembran. Membranene ble blokade for 1 time med 5% fettfri melk. Primære antistoffer i Slug, PS6, pakt, PTEN, Perk, Erk, HIF-1α, HSP90, AR, og β-aktin ble deretter tilsatt, og membranene ble inkubert ved 4 ° C over natten. Tilsvarende sekundære antistoffer ble anvendt, fulgt av pepperrot peroksidase anvendelse.
migrering og invasjon assay
In vitro-migrerings analyser ble utført som tidligere beskrevet. Kort fortalt celler ble sådd i den øverste kammeret av 8.0μm pore størrelse cellekultur innstikk som enten var belagt eller ubestrøket med matrigel for migrasjon og invasjon analyser, henholdsvis. Da innsatsene ble plassert i en 24-brønns plate som er fylt med medium med 5% føtalt bovint serum. Celler som gjennomtrengt til undersiden overflater av innsatsene ble fiksert og farget med Diff-Quick (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) metode og ble tellet under mikroskop. Gjennomsnittet av tre kraftige felt for hver tilstand ballen triplicates ble beregnet.
Realtime PCR
Total RNA ble ekstrahert med RNAiso reagens (Takara, Dalian, Kina). Etter konsentrering ble bestemt med Thermo Nanodrop spektrofotometer 1000, ble RNA omdannet til cDNA med PrimeScript RT Reagent Kit (Takara) under forutsetning av 37 ° C, 15 min; 85 ° C, 5 sek. Forover og bakover primere av Slug, E-cadherin og internkontroll GAPDH (glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase) ble syntetisert (Invitrogen) som følger sekvenser (Tab. 1): for human E-cadherin, følelse, 5′-ACA GCC CCG CCT TAT GAT T-3 «og antisense, 5′-TCG GAA CCG CTT CCT TCA-3′; for Bim, følelse, 5»-GGT CCT CCA GTG GGT ATT TCT CTT-3 «og antisense, 5′-ACT GAG ATA GTG GTT GAA CTG GGC G-3′; for Caspase-3, følelse, 5»-GAC AGA CAG TGG TGT TGA TGA TGA C-3 «og antisense, 5′-GCA TGG CAC AAA GCG ACT GGA T-3′; for Slug, følelse, 5»-TTC GGA CCCACA CAT TAC CT-3 «og antisense, 5′-GCA GTG AGG GCA AGA AAA AG-3′; for GAPDH, følelse, 5»-ATG GAA ATC CCA TCA CCA TCT T-3 «og antisense, 5′-CGC CCC ACT TGA TTT TGG-3». Prøvene ble behandlet med SYBR Grønn Premiks Ex Taq (Takara) i 20 ul system på ABI 7500N (Applied Biosystems, Forster City, CA). Prøvene ble kjørt ved 95 ° C, 30 sek og ble amplifisert for 40 sykluser (95 ° C, 5 sek ved 60 ° C, 34 sek). For hver prøve ble den gjennomsnittlige verdien av terskelsyklusen normalisert til GAPDH nivå med formelen, 2
-ΔΔCt. Resultatene ble dermed presentert av uttrykks folder over kontrollen.
Xenotransplantat og intravenøs tumormodell
Mann BALB /c atymiske nakne mus ved 6 ukers alder (Vital River, Beijing, Kina) ble avlet i lisensiert SPF (spesiell patogen-fri) karakter laboratorium. Alle mus gikk orchiectomy for androgen deprivasjon. Totalt 2 × 10
6 celler (DU145, PC-3, LNCaP, 22RV1 henholdsvis) ble i 100 ul PBS injisert subkutant på begge flankene av hver mus. Vehicle kontrollgruppen fikk 100 ul PBS. Tumorvekst ble overvåket og perifert blod ble samlet på 1 mnd. For intravenøse injeksjoner, 2 x 10
5-celler ble injisert inn i den laterale halevenen og perifert blod ble oppsamlet i 24 timer. Alle protokoller ble godkjent av Fudan University dyreetikk komité.
Celledød deteksjon
Celledød ble oppdaget ved hjelp av MTT-analyse, en metode som var godt etablert. I korthet ble cellene først gitt forskjellige behandlinger, og deretter eksponert for 400 uM H
2o
2 i 4 timer. I kontrollgrupper, ble RIN-mβ celler kun behandlet med 400 mikrometer H
2o
2 og tilsvarende legemiddel, henholdsvis. Ved slutten av behandlingene ble media fjernet og cellene ble farget og målt ved 495 nm ved hjelp av en Autoplate leser (Bio-Tek, USA). Behandlingen med 400 uM H
2o
2 i 4 timer kunne indusere apoptose av omtrent halvparten av PCA-celler (~ 50%), og dosen ble derfor valgt som en optimal tilstand.
Sirkulasjons tumor-DNA påvisning
mus blod (0,5 ml) ble oppsamlet ved indikerte tider av intraokulær blødning, og de røde blodcellene ble lysert før DNA-ekstraksjon. Quick-gDNA MiniPrep kit (epigenetikk, USA). Kort sagt ble 400 ul lyseringsbuffer tilsatt til 100 pl plasma. Etter kraftig vortex, ble alt innholdet flyttet til kolonner og ble sentrifugert. Pre-vaskebuffer ble deretter tilsatt etterfulgt av en annen sentrifuge og tilsetningen av vaskebuffer. DNA ble til slutt eluert med DNA elusjonsbuffer og ble kvantifisert ved hjelp av TaqMan-kjemi basert realtime PCR-analyser som nevnte for menneskelig Slug og E-cadherin uttrykk.
Statistisk analyse
Ett-prøven og Two sampler t-tester, og Mann-Whitney-testen ble anvendt for in vitro og in vivo studier. En p-verdi eller 0,05 ble akseptert som statistisk signifikans. Data ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD).
Resultater
Androgen fremmer metastatisk potensial på PCa via oppregulering av Slug
Prostatakreft fôres på androgen i flertallet av saker og overgang til hormon ildfaste fenotype (hrpc) vanligvis nødvendig langsiktig androgen deprivasjon terapi. Vi derfor undersøkt her om Slug ble innblandet i androgen-mediert metastatisk vei i prostatakreft. Ved å anvende dihydrotestosteron (DHT) ved 1 nM til 4 PCA cellelinjer med ulike egenskaper, har vi funnet at celler som var forskjellig for deres iboende migrerende evne med forskjellig følsomhet for androgen (figur 1A). PC-3 celler var mest naturlig invasiv, og LNCaP og 22RV1 var mer følsomme for androgen stimulering med betydelige økninger i metastatisk profil. Lignende mønster av endring i invasivitet ble også observert i invasjonen analysen, noe som bekrefter at profilene ovennevnte (figur 1B). For å belyse hvorvidt Slug ble innblandet i hormonrelaterte metastase /invasjon forbedring, vi utforsket mRNA og proteinnivået i disse cellene. Følgelig uttrykk for Slug ble betydelig økt betydelig i LNCaP og 22RV1 celler som var hormon sensitiv i respons til DHT (figur 1C). Uttrykket forandring i mRNA også samsvarer med endringer i proteinnivået, som åpenbart i immunoblotting (figur 1D). E-cadherin, et protein avgjørende for celle-celle adhesjon er etablert for å påvirke ned-stream fra Slug, hemme epitelial-mesenchymale overgang (EMT) og påfølgende celleunndragelser. Vi videre undersøkt om aktivering av Slug av androgen pådratt hemming av E-cadherin å fremme celle migrasjon og invasjon. I tråd med tidligere analyser, ble både mRNA og proteinnivåer av E-cadherin redusert følgende DHT tillegg i celler som er følsomme for androgen (figur 1E, F). Sikkert, her viste vi forskjellene i androgen sensitiviteter av 4 PCA cellelinjer og viste at celler som er følsomme for androgen stimulert hadde økt evne til migrasjon og invasjon via forhøyet Slug og redusert E-cadherin aktivitet. Derfor, for celler ufølsomme til androgen, som var ment for å være hormonmangel motstandsdyktig, bør det være trasé som migrasjon avhang og som invasjonen kan bli rettet.
Migration (A) og invasjon (B ) analyser utført i 4 PCA cellelinjer behandlet med dihydrotestosteron (DHT) og kontroll. Nivåer av mRNA (C) og protein (D) av Slug i PCA-cellelinjer som ble behandlet med DHT eller kontroll. Nivåer av mRNA (E) og protein (F) av E-cadherin i PCA-cellelinjer som ble behandlet med DHT eller PBS (kontroll). (Feil bar = standardavvik, n = 3 for hver gruppe; * p 0,05, ** p 0,01).
Kombinasjon av rapamycin og CI-1040 reduserer invasivitet av PCa
Hyperaktivitet av PTEN /Akt /mTOR veien har vist seg å være pro-tumorigen i en rekke kreftformer, inkludert tumorgenesen av PCA hvor Slug var kjent for å være en ned-stream effektor av hypoksi induserbar faktor-1α ( HIF-1α). Vi deretter undersøkt om hemming av mTOR redusert metastatisk potensial for PCa via Slug. Vi oppdaget store tap av PTEN i DU145 og PC-3 celler, mindre tap i LNCaP celle i forhold til 22RV1 celle. Nedstrøms surrogater for Akt, mTOR, og HIF-1α aktiviteter ble alt økt i PTEN-null-celler, noe som indikerer en overgang til mTOR vei for androgen-insensitive fenotyper (Figur 2A). Tilsetting av rapamycin på 10 nM redusert Slug nivåer i alle cellelinjer, men basalnivået slug dukket høyere i DU145 og PC-3 celler (figur 2B). Rapamycin med samme dose hemmet migrasjon og invasjon av celler med PTEN tap av ~ 30% og ikke påvirke 22RV1 (figur 2C, D). Som mTOR-hemming kan medføre feedbacks som var tvert imot pro-tumorigent, undersøkte vi aktiviteten til ERK1 /2, som ble rapportert å spille alternativ rolle i reguleringen av den grove uttrykk ved PCA tidligere. Påfallende, ble ERK1 /2 aktivitet forhøyet i alle 3 cellelinjer med PTEN tap følgende rapamycin søknad, noe som indikerer en forbi eksisterende omgå mTOR mot Slug (figur 2E). Vi har derfor undersøkt hvorvidt en kombinasjon av rapamycin og CI-1046, kan en ERK1 /2-inhibitor, som er i kliniske forsøk ytterligere redusere den metastatiske profilen i disse cellene. Western blotting viste at kombinasjonen av medikamenter reduseres vesentlig Slug nivået i alle PCA-cellelinjer (figur 2f). Vi testet om rapamycin skje via blokade av mTORC1 og utøvde sin nedstrøms effekt via ERK og på Slug. Behandling DU145 celler med ulike kombinasjoner av rapamycin, Raptor og Rictor sirnas, fant vi at selv om en fullstendig blokade av både MTOC-1 og -2 elementer resulterte i maksimal hemming av ERK og Slug, den hemmende effekten av rapamycin var muligens via mTORC1- ERK-Slug pathway (figur 2G). Den synergistiske virkning av kombinasjonen av 1 nM av rapamycin og 0,5 pm av CI-1040 ble vist i figurene 2 H, I. Det var større inhibering av migrering og invasjon kapasitet i celler med PTEN tap rekkende ~ 50% sammenlignet med monoterapi av rapamycin. I konklusjonen, androgen-insensitive PCa var generelt mTOR hyperaktive på grunn av PTEN tap. Monoterapi med rapamycin imidlertid medført ERK-aktivering, som aktiveres Slug som en bypass. Kombinasjon av mTOR og ERK hemmere dratt bedre effekt enn monoterapi.
Basal nivåer av PTEN, fosforylert Akt og S6, og HIF1α i PCA cellelinjer indikeres av Western blot (A). Endring av Slug nivå i PCA celler behandlet med rapamycin over kontrollen (B). Migrasjon (C) og invasjon (D) forsøk i PCA-cellelinjer med eller uten rapamycin behandling. Aktivering av Erk 1/2 reaksjonsveien i PCA-celler responderer på behandling rapamycin (E). Kombinasjonsbehandlinger av rapamycin (R) og CI-1040 (CI) i PCA-cellelinjer, og effekten på Slug (F). Kombinasjoner av rapamycin og Raptor /Rictor sirnas og effekter på ERK og Slug i DU145 celler (G). Migrasjon (H) og invasjon (I) forsøk i PCA-cellelinjer med eller uten kombinasjonsbehandling med rapamycin og CI-1040. (Feil bar = standardavvik, n = 3 for hver gruppe; * p 0,05, ** p 0,01).
17-AAG synker Slug uttrykk via blokade av HSP90-avhengige AR stabilitet
Riktignok hormonmangel hadde langvarig effekt på PCA kan det følge en rekke systemiske bivirkninger. Som androgen som utøves dens virkning gjennom binding til dets reseptor (AR), noe som induserte Slug aktivering, testet vi om målrettet terapi mot Slug reaksjonsvei kan være med sikte på AR. Det har blitt fastslått at varmesjokkprotein 90 (HSP90) er nødvendig for stabiliteten av proteiner, inkludert AR. Vi deretter undersøkt om bruk av HSP90 inhibitor 17-AAG kan redusere effekten av androgen på metastatiske profiler av PCa via hemming av Slug. Cellene ble behandlet enten med DHT alene eller med kombinasjonen av 300nm av 17-AAG. Som forventet, kombinasjon av 17-AAG blokade Slug aktivitet mer tilsynelatende i hormon sensitive cellelinjer (figur 3A). I tillegg inhibering av migrering og invasjon ble ikke bare observert i androgen-følsomme cellelinjer, men i PC-3-celler, så vel (figur 3B, C). For å oppsummere, blokade av HSP90 destabilisert AR fører til redusert effekt av androgen fremme celle migrasjon og invasjon. Krysstale virkning av 17-AAG kan eksistere som utøvde også effekt i androgen ufølsomme celler.
Slug nivåer i PCA-celler behandlet med DHT eller kombinasjon av DHT og 17-AAG (A). Migrasjon (B) og invasjon (C) forsøk i PCA-cellelinjer med eller uten kombinasjon behandlet med DHT eller kombinasjon av DHT og 17-AAG. (Feil bar = standardavvik, n = 3 for hver gruppe; * p 0,05, ** p 0,01).
Slug hemmer Bim-mediert apoptose som kan bli reddet av mTOR /ERK /HSP90 hemmere
Så langt har vi etablert effekter av målretting 3 Slug-relaterte pathways med dyptgripende virkninger i hemme metastaserende profiler. Som Slug var også ansvarlig for sine nedstrøms anti-apoptotiske virkninger i kreftceller, undersøkte vi om kombinasjonen av Slug-målretting narkotika konferert pro-apoptotiske effekter. Vi først etterlignet Reaktive oksygenarter (ROS) ved hjelp av H
2o
2, og fant at celler med androgen ufølsomhet var mer resistente mot ROS og androgen kunne redde apoptose i hormon sensitive cellelinjer (figur 4A). Som Bim var ansvarlig for Slug-mediert anti-apoptose, vi videre bestemt uttrykk for Bim i alle celler behandlet med DHT. Uttrykk for Bim uendret i androgen ufølsom celle og redusert betydelig i androgen sensitive celler (figur 4B). For bedre å karakterisere rollen Slug i anti-apoptose, søkte vi siRNA mot Slug uttrykk i alle cellelinjer (figur 4C). Den inhibitoriske effekt var fremtredende bortsett 22RV1 celle, hvori Slug aktiviteten var konstitutivt lav, og utgjør det laveste iboende metastatisk kapasitet (figur 1A). Vi testet ytterligere caspase-3-aktivitet etter Slug knockdown. Uttrykk for Caspase-3 var betydelig redusert i 3 cellelinjer med hyperaktive Slug og forble uendret i 22RV1 celler (Figur 4E). Deretter påføres en kombinasjon av rapamycin, CI-1040, og 17-AAG til de ikke-transfekterte celler for å teste de synergistiske effekter. Påfallende, kombinasjonen reddet anti-apoptotisk effekt av Slug initiert av androgen og ROS i alle cellelinjer, der statistiske betydninger ble innhentet for DU145, PC-3 og LNCaP celler (Figur 4F). I alt Slug konferert anti-apoptotiske virkninger i PCA celler via hemming av Bim, pathway mer sannsynlig å bli aktivert i hormon sensitive celler med tilstedeværelse av androgen. En pan-blokade av mTOR /ERK /HSP90 syntes å være i hemme Slug samt det s nedstrømsaktivitet.
Cell død i PCA celler behandlet med DHT i respons til ROS simulert ved H
2o
2 (A). Ekspresjonsnivået av Bim i PCA-celler behandlet med DHT (B). Knockdown av Slug med siRNA (C) og mRNA nivået av Bim i PCA cellelinjer følgende Slug knockdown (D). Endring av caspase 3 mRNA nivå i PCA celler etter Slug knockdown (E). Effekt av Kombinasjon av rapamycin, 17-AAG, og CI1040 i celledød av PCA celler behandlet med DHT og H
2o
2. (Feil bar = standardavvik, n = 3 for hver gruppe; * p 0,05, ** p 0,01).
Kombinasjon av mTOR /Erk /HSP90-hemmere reduserer sirkulerende PCA celler
in vivo
PCa er mye mer utsatt for beinmetastaser enn andre organer, som hematogenous metastaser er forutsetning. Vi har således etablerte dyremodeller for å teste effekten legemiddelkombinasjonen in vivo. I stedet for å etablere beinmetastatisk modell, som var vanskelig å spore minimalt metastatiske lesjoner, forsøkte vi å oppdage sirkulerende tumorceller, profilering av metastatisk kapasitet av primærtumor. Vi først etablert xenograft modeller med 4 cellelinjer henholdsvis. For å normalisere maksimalt androgen nivå, utførte vi orkidektomi i alle mus injisert og 200 ug av DHT i sesamolje-etanol subkutant annen hver dag. Mus ble injisert med 200 ul av en 1,2 mg /ml oppløsning av rapamycin daglig (5 dager i uken). Mus ble også behandlet to ganger om dagen ved intraperitoneal injeksjon (IP) av 100 mg /kg CI-1040, mens 17-AAG (80 mg /kg /d i steril maisolje) ble levert av en IP-injeksjon pr dag. I løpet av behandlingen ble kroppsvekten hos alle musene overvåket for toksisitet overvåking. Figurene 5A, B, C, D viste vekten av mus implaneed med forskjellige PCA-cellelinjer under forskjellige behandlinger. Det var ingen signifikante endringer mellom behandlingene og kontrollgruppene, noe som indikerer ikke-toksiske effektene av behandlingene. Etter at blodet hadde blitt høstet kvantitativ sanntids PCR viste at LNCaP celler var den mest potente i metastatisk kapasitet mens 22RV1 celler neppe spredning. Den trippelterapi effektivt dempet svulst unndragelser i det sirkulerende system i resten 3 cellelinjer i forhold til enten 2 narkotika eller hormonmangel alene (kontroll) (figur 5E). Vi ved forsøkte å undersøke om kombinasjonen berørte forankring kapasitet av de sirkulerende tumorceller og vi således injiserte tumorceller i mus sirkulasjon. Etter behandling med en enkelt dose av rapamycin og 17-AAG, og to ganger injeksjon av CI-1040 som tidligere nevnte, ble blod høstet ved set tidspunkt. Som vist i figur 5B, er trippelterapi betydelig redusert sirkulerende tumorceller. Kombinasjon av rapamycin og CI-1040 oppnådde tilsvarende effekter i forhold til androgen deprivasjon. Tatt sammen, ikke bare vist at trippel medisinering av mTOR /ERK /HSP90 hemning redusert metastatisk kapasitet av tumoren, men viste også at en slik målrettet terapi overveldet følsomheten til androgen av cellene. Den inhibitoriske var konsistent i celler med eller uten hormonsensitivitet, og uavhengig av tilstedeværelsen av androgen (figur 5F).
Trend av vektendring i løpet av behandlingsperioden i alle 4 PCA celle xenograft mus (A-D). Sirkulerende PCa DNA kvantifisering i xenograft musemodeller implantert med 4 PCA cellelinjer og behandlet med forskjellige medikamentkombinasjoner (E). Sirkulerende PCa DNA kvantifisering 24 h etter venøs injeksjon av PCA-celler i mus som mottar enkelt behandling av medikamentkombinasjoner (F). (Feil bar = standardavvik, n = 6 for hver gruppe; * p 0,05, ** p 0,01).
Diskusjoner
Bekjempelse PCa er fortsatt et stort helse problem, spesielt for pasienter med avansert stadium sykdommen, for hvem målrettet terapi kan bringe håp. Her har vi vist at kombinert målrettet terapi mot Slug er effektiv i metastatiske PCA-modeller. Basert på tidligere litteratur og våre resultater, kan vi konkludere med de ulike egenskapene til PCA celler, som kan ha nytte fremtidige studier for passende modell etablissementer (Figur 6A). Enda viktigere, kan vi foreslå at Slug ligger ved konvergens av mTOR /Erk /HSP90-AR sti og derfor reagerer mer til kombinasjonen snarere enn monoterapi (figur 6B). Ved å blokkere den opp-stream fra Slug, bør hemming av metastatisk kapasitet direkte nytte av E-cadherin aktivering. E-cadherin er en kalsium-avhengig celle-celle adhesjon protein og fungerer som en tumor suppressor. Tapet av E-cadherin ekspresjon eller funksjon er et vanlig arrangement i tumorprogresjon [9]. Nedregulering av E-cadherin er nøkkelmålet av epitelial til mesenchymale overgang (EMT) modulatorer, som er kjent for å demontere cadherin-medisinerte celle-celle kryss og avgjørende for embryoutvikling, kreft progresjon, og kjemoterapi motstand [10,11] . På grunn av sin avgjørende rolle i EMT, krever E-cadherin en stram kontroll i kreft. Så i de fleste tilfeller av kreft, er E-cadherin uttrykk undertrykkes på transkripsjonsnivået. Forskjellige pro-tumorigene reaksjonsveier, slik som MAPK /Erk, PI3K /Akt /mTOR, og HSP90 /AR, delta i reguleringen EMT [12,13], og alle deler en felles endepunkt: aktivering av en serie av transkripsjonsfaktorer som direkte undertrykke E-cadherin. Flere transkripsjonsfaktorer har blitt identifisert som undertrykker E-cadherin inkludert Snail, Slug, Twist og ZEB1 via deres interaksjon med E-box bindingssete i E-cadherin promoter [14,15].
Profilering av PCA celler er basert på denne studien basert på våre resultater og litteraturrapporter (A). Den skjematiske mønster som viser hvordan kombinasjonen av narkotika effekt via målretting Slug-relaterte sti der Slug ligger i navet (B).
PI3K /Akt /mTOR signalveien er godt dokumentert å være ofte deregulert og fungerer som et onkogen sti i flere typer karsinom [16]. Det har blitt godt etablert at mTOR-signalveien regulerer proteinsyntese som respons på forskjellige vekstfaktorer og følgelig påvirker både celleoverlevelse og celleproliferasjon [17]. I denne studien, hemming av PI3K /Akt /mTOR signalering, av rapamycin, delvis opphevet HIF-1α-indusert sneglen og Slug uttrykk nivåer på kort varighet, noe som tyder Slug uttrykk kan reguleres ved PI3K /Akt /mTOR signale [18, 19]. Aktiveringen av PI3K /Akt signalering er blitt funnet å stimulere sneglen og Slug uttrykk via GSK-3β /β-catenin signalering og deretter å ned-regulere E-cadherin i ulike cellulære sammenhenger [20]. Den nåværende data støtter en avgjørende rolle for HIF-1α /PI3K /Akt /mTOR signalveien i formidling av Slug-regulering av E-cadherin ved PCA. Ikke desto mindre langvarig inhibering av mTOR av rapamycin som vises redusert nedregulering av Slug, noe som er en indikasjon på en bestandig bane blir aktivert.
Som nye bevis tyder på at både MAPK /ERK og PI3K /Akt veier er involvert i reguleringen av E-cadherin, undersøkte vi Erk aktivering og er overrasket over å finne ut at bypass med ERK regnskapet for motstand mot mTOR-hemming for Slug. I prostatakreftceller, Slug avhengig opp-regulering har vist seg å ned-regulere E-cadherin ekspresjon via MAPK /ERK-signalveien [21]. Preget pattedyr Aktivert protein kinase (MAPK) pathway medlemmer er delt inn i tre hovedunderfamilier; Ekstracellulære signalregulerte kinase 1/2 (ERK 1/2), p38 MAPK, og c-Jun N-terminal kinase (JNK); Konservert gjennom evolusjon, er ERK 1/2 signalveien organisert i en tre-kinase fosforylering kaskade involverer Raf (eller MAPK kinase kinase), MEK (eller MAPK kinase), og ERK 1/2 (eller MAPK) [22,23] . Aktivering av ERK 1/2 i respons på en rekke eksterne stimuli kan fremme ekspresjonen av spesifikke gener via fosforylering av mange transkripsjonsfaktorer slik som Elk-1 [24]. På grunn av nærheten til mTOR vei, er Erk svært sannsynlig å bli shunted når mTOR aktiviteten hemmes, som vist i vår studie. Derfor er inhibering av MAPK /ERK veier, ved Cl-1040 kan både brukes som en frittstående terapi og som sensibilisator for rapamycin.
varmesjokkproteiner 90 (HSP90) består av en høyt konservert familie av proteiner som er nødvendige for stresstoleranse i levende celler. HSP90 er et allestedsnærværende molekyl anstand, funnet å være overuttrykt i en rekke kreftformer, inkludert prostata cancer, som er unik blant molekylære anstand som de fleste av de kjente substrater er signaloverføringsproteiner [25]. Blant klient proteiner er transkripsjonsfaktorer, cellesyklus regulatorer, signal kinaser, mediatorer av apoptose samt steroidhormonreseptorer, som for eksempel androgenreseptoren (AR), som har avgjørende rolle i prostata karsinogenese og i progresjon til hrpc [26] . Videre driver AR veksten av hrpc gjennom en rekke mekanismer som intimt er avhengige av HSP90 for celleoverlevelse, spesielt AR overekspresjon og gain-of-funksjon AR genmutasjoner [27]. Derfor rettet mot HSP90 er et spesielt attraktivt kreft tilnærming for prostatakreft. Den brede inhiberende virkning av HSP90-inhibitorer ser ut til å være effektive i celler som uttrykker spleisede varianter av AR som er blottet for det ligandbindende domene og er derfor motstandsdyktig mot konvensjonelle AR-antagonister [28]. Den første klassen av HSP90-inhibitorer undersøkt var geldanamycin analoger, spesielt 17-allylamino-17-demetoksy-geldanamycin (17-AAG).
