Abstract
Vi forsøkte å identifisere en prostatakreft DNA hypermethylation microarray signatur (betegnet som PHYMA) som skiller prostatakreft fra benign prostatahyperplasi (BPH), høyt fra lavgradig og dødelig fra ikke-dødelige kreft . Dette er en ikke-randomisert retrospektiv studie i 111 lokale asiatiske menn (87 prostatakreft og 24 BPH) behandlet 1995-2009 i vår institusjon. Archival prostata epitel var laser-fangst microdissected og genomisk DNA ekstrahert og sulfitt-konvertert. Prøvene ble profilert hjelp Illumina Golden Metylering microarray, med rådata behandles av GenomeStudio. En klassifiseringsmodell ble dannet ved anvendelse av støttevektormaskin, som består av en 55-probe DNA-metylering signatur av 46 gener. Modellen ble uavhengig bekreftet på et indre test datasett som ga kreft følsomhet og spesifisitet på 95,3% og 100% henholdsvis, med total nøyaktighet på 96,4%. Second validering på en annen uavhengig vestlige kohort ga 89,8% sensitivitet og 66,7% spesifisitet, med samlet nøyaktighet på 88,7%. En PHYMA poengsum ble utviklet for hver prøve basert på tilstanden metylering i PHYMA signatur. Økende PHYMA poengsum var signifikant assosiert med høyere Gleason score og Gleason primær klasse. Menn med høyere PHYMA score har dårligere overlevelse på univariate (p = 0,0038, HR = 3,89) og multivariate analyser når kontrollert for (i) klinisk stadium (p = 0,055, HR = 2,57), og (ii) klinisk stadium og Gleason score ( p = 0,043, HR = 2,61). Vi utførte ytterligere bisulfitt genomisk sekvensering på 2 relativt ukjente gener for å demonstrere robusthet av analyseresultatene. PHYMA er dermed en signatur med høy sensitivitet og spesifisitet for kresne svulster fra BPH, og har en potensiell rolle i tidlig deteksjon og forutsi overlevelse
Citation. Goh LK, Liem N, Vijayaraghavan A, Chen G, Lim PL, Tay KJ et al. (2014) diagnose- og prognoseverktøyet av en DNA Hypermethylated Gene Signatur i prostatakreft. PLoS ONE 9 (3): e91666. doi: 10,1371 /journal.pone.0091666
Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 20 mars 2013; Godkjent: 13 februar 2014; Publisert: 13 mars 2014
Copyright: © 2014 Goh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien ble finansiert av Singapore National Medical Research Council (NMRC NIG /0033/2008) til HGS, Khoo Discovery Awards (KDP /2008/0002 og KDP /2009/0006) og Duke-NUS Signatur Research Program fase 1 finansiert av Direktoratet for Science, Technology and Research (A * STAR), og Helsedepartementet, Singapore, til LKG. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den mest hendelsen kreft i USA med anslagsvis nye 238,590 diagnoser (153 tilfeller per 100 000 per år). Som en årsak til død, er den beregnet til bare 29 720 tilfeller (12%) [1]. Dette disharmoni er også sett i Singapore, Japan og Korea, der forholdet mellom forekomsten til dødelighet er ca 0,2 [2] og har i stor grad blitt tilskrevet over diagnosen klinisk ubetydelige prostatakreft som følge av utbredt prostataspesifikt antigen (PSA ) testing.
økningen i deteksjon av tidlig prostatakreft har ikke blitt fulgt av nøyaktig bestemmelse av risiko for sykelighet og dødelighet. Dette har resultert i overbehandling i noen menn og under-behandling i andre. Gleason gradering, et lavt strømforbruk mikroskopisk evaluering av prostatakreft arkitektur beskrevet i 1966 av Donald Gleason, har vært bærebjelken i prostatakreft prognostication [3], [4]. Men karaktersystemet, er gjenstand for inter-observatør forskjeller og mangler presisjon i prognosticating tidlig stadium prostata kreft som stadig blir diagnostisert [5], [6]. Dette er blitt delvis løst ved modifikasjoner [7], inkludering av tertiære Stillingen [8] og anvendelse av kliniske nomogrammer [9]. Merket scenen migrasjon til 80% av prostatakreft blir diagnostisert på et organ-begrenset stadium har avstumpet effekten av disse verktøyene på det punktet av diagnose. Aktiv overvåking, en strategi med selektivt å forsinke radikal behandling i meget lav risiko tidlig prostatakreft, innebærer hyppig oppfølging og årlige prostatabiopsier – en kilde til betydelig engstelse og kostnads [10]. Mens andre blod og vev biomarkører til prognosticate prostatakreft er i utvikling, noen av dem har blitt grundig validert og ingen av dem er i klinisk bruk [11].
epigenetiske forandringer, som involverer mekanismer som setter i gang og opprettholde arvelig genekspresjonsmønster uten å endre sekvensen av genomet, er en prosess med flere lag av kompleksitet [12]. Disse inkluderer histonmodifikasjonene, kromatin remodeling, nucleosome belegg og DNA metylering. Av disse mekanismene, er DNA metylering den mest godt beskrevet og studert. Promoter hypermethylation og påfølgende transkripsjonen Slå har blitt funnet å være utbredt og forbundet med hundrevis av gener i nesten alle krefttyper og har dukket opp som en viktig del av epigenetisk forskning [12], [13], [14]. Bevis fra tidligere studier har knyttet promoter hypermethylation av spesifikke gener til patogenesen og tumorprogresjon i prostatakreft, f.eks
APC, RARβ
, og
GSTP1 product: [15]. Men disse studiene fokusert på utvalgte denaturert gener i stedet for den globale gen metylering, som begrenser sensitivitet og spesifisitet for diagnose og prognose. En diagnostisk eller prognostisk signatur som involverer flere gener kan forbedre diskriminerende makt. Selv om molekylær signatur fra genuttrykk arrays viste lovende sensitivitet (93-97%) og spesifisitet (87-100%) [16], [17], stabilitet i DNA-materiale gjør hypermethylation signatur en mer levedyktig alternativ, spesielt for arkivert parafin- innebygde vevsprøver. Mens en rekke studier har benyttet genom bred metylering matriser [18], [19], [20], [21], [22], er resultatene fremdeles begrenset til å nærme seg kandidat gener. Rask fremgang i epigenetikk har gjort det mulig å utvikle høy gjennomstrømning teknikker for å analysere metylering mønstre av prostata kreft gener å belyse molekylære signaturer som kan være surrogat for Gleason gradering.
Vårt mål var å identifisere unike globale genet hypermethylation endringer som var kreft-spesifikke og som vil diskriminere ulike prostatakreft fenotyper. Vi brukte high-throughput DNA metylering mikromatriser og analysert et stort antall genloci i menneskelige prostata kreft vev med målene for å identifisere diagnostiske DNA hypermethylation signatur som skiller prostata hyperplasi (BPH), lav karakter og høy klasse prostatakreft med sikte på å skille dødelig fra ikke-dødelige prostatakreft.
Materialer og metoder
studie~~POS=TRUNC og pasientinkluderings
Godkjenning for denne studien ble gitt av SingHealth Sentralisert institusjonelle Review Board B (Godkjenningsnummer nummer~~POS=HEADCOMP CIRB # 32B /2007). Behovet for samtykke ble frafalt av gjennomgangen styret i lys av den retrospektive natur studien og lang arkiv periode av de involverte vev.
Dette er en ikke-randomisert retrospektiv studie av genet hypermethylation i prostatakreft og godartet prostata hyperplasi (BPH). Tilfeller av prostatakreft ble stratifisert basert på scenen og klasse. Klinisk og patologisk iscenesettelse ble utført ved hjelp av 2007 AJCC TNM staging og histologisk gradering var basert på Gleason gradering systemet [7].
Parafin innebygd arkiv vev av lokale asiatiske befolkningen ble innhentet fra én institusjon (Singapore General Hospital) . Vev for krefttilfeller ble oppnådd fra pasienter med tidlig klinisk lokalisert prostatakreft og avansert metastatisk prostatakreft. Vev fra førstnevnte gruppe ble innhentet fra menn som gjennomgikk radikal prostatektomi; vev fra den sistnevnte gruppe ble oppnådd fra mennesker som gjennomgikk transuretral reseksjon av prostata og bilateral orkidektomi samtidig. Regional lymfeknutemetastase ble oppdaget av mage-bekken CT og MR skanner og beinmetastatisk sykdom ble bekreftet av positive Technetium
99 bein skanner. Pasienter som gjennomgikk stråling eller androgen deprivasjon terapi før transurethral reseksjon ble ikke inkludert. BPH tilfeller ble innhentet fra transurethral reseksjon hos menn med benign prostata utvidelse og PSA 4 ng /ml før operasjon og godartet status ble bekreftet histologisk. Kontroll vev ble hentet fra BPH, som BPH er vanlig i kohorten av menn utsatt for prostatakreft, og det er fortsatt den vanligste differensialdiagnose hos disse mennene. Vi brukte ikke tilstøtende normalt vev hos menn med prostatakreft for å unngå eventuelle feltet endringer [23].
Prøvetaking
klasse og stadium av hver prøve ble først bekreftet i henhold haematoxylin og eosin flekken av patologen. Kreft rike områder ble merket og prostata epitel isolert av laser capture mikrodisseksjon teknikker som bruker Zeiss P.A.L.M. system (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Tyskland). Pasient demografisk og tumor profil, inkludert alder, pre-operative PSA-nivå, klinisk og patologisk stadium og patologisk Gleason grad ble oppnådd. Varighet av oppfølging, og tid til biokjemisk tilbakefall og kreftspesifikk dødelighet ble registrert.
DNA Extraction og Prøve Profilering
Genomisk DNA ble ekstrahert ved bruk av 300 mL av fordøyelsen bufferløsning (50 mM Tris HCI, 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20) med 20 ul proteinase K (20 mg /ml, Qiagen, Valencia, CA). Prøvene ble inkubert ved 55 ° C i 48 timer i en roterende ovn. Proteinase K ble inaktivert etter inkubering ved 94 ° C i 10 minutter og sentrifugert kort i 5 minutter ved 260
g
. Mengden av ekstrahert DNA ble bedømt ved sanntids-PCR som tidligere beskrevet [24]. For å optimalisere DNA-konvertering og redusere variasjon mellom prøvene, 500 ng genomisk DNA var sulfitt-omregnes EZ DNA Metylering kit (Zymo Research, Orange, CA) i henhold til produsentens anbefalinger. Bisulfite konvertering av genomisk DNA resulterer i unmethylated cytosin omdannes til uracil mens denaturert cytosines forblir uendret. Prøvene ble deretter profilert på Illumina Golden BeadArray i henhold til produsentens spesifikasjoner. I korthet gjennomgår bisulfitt-konvertert DNA-hybridisering for å allel spesifikk oligonukleotid og locus-spesifikke oligonukleotid som er avhengig av den C /T-nukleotid polymorfisme i hver CpG område. Fluorescens-merket PCR-primere for Cy3 ble anvendt for å amplifisere unmethylated templat DNA, mens Cy5 merkede primere ble anvendt for å amplifisere denaturert templat DNA. Intensiteten av de 2 fluorescenssignaler ble analysert på en Sentrix Array matrise, og nivået av metylering ved CpG-lokuset ble målt ved β verdi hvor β = [max (Cy
5
, 0)] /(
