Abstract
Tykktarmskreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Sykdommen er herdbare når oppdages på et tidlig stadium. Men etterlevelse sats med gjeldende screening anbefalinger forblir fattige. En nøyaktig, minimal invasiv blodprøve som har potensial for større pasient compliance vil være en velkommen tillegg til dagens metoder. Nyere data har vist at genuttrykk profil av perifere blodceller kan reflektere sykdomstilstander og dermed har diagnostisk verdi. I denne studien ble genom-wide genuttrykk profilering av perifere blodceller fra 20 friske kontroller og 20 pasienter med kolorektal kreft utføres ved hjelp PAXgene ™ -teknologi og Affymetrix GeneChip® mikromatriser. Vi identifiserte en liste over 1,469 gener som var forskjellig uttrykt mellom de friske kontroller og kreftpasienter. Gene merknader og funksjonell berikelse analyse viste at disse genene er i hovedsak relatert til immunforsvaret. Spesielt et sett av gener som hører til Toll-like receptor trasé ble oppregulert i pasienter med kolorektal kreft. Disse funnene gir en ny forståelse av blod genuttrykk profil i tykk- og endetarmskreft. Vårt resultat kan tjene som grunnlag for videre utvikling av blod biomarkører for diagnostisering og behandling av tykktarmskreft
Citation. Xu Y, Xu Q, Yang L, Liu F, Ye X, Wu F et al . (2013) Gene Expression Analyse av perifere blodceller avslører Toll-like receptor Pathway Deregulering i tykktarmskreft. PLoS ONE 8 (5): e62870. doi: 10,1371 /journal.pone.0062870
Redaktør: Frank T. Kolligs, Universitetet i München, Tyskland
mottatt: 17 september 2012; Godkjent: 29 mars 2013; Publisert: 01.05.2013
Copyright: © 2013 Xu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av bioMérieux selskap. Denne studien ble også støttet med tilskudd fra den kinesiske National Clinical Key Discipline (2011-2012) og Shanghai Science and Technology Commission av Shanghai kommune (antall 10DJ1400500). Som QX, FW, FL, XY, BM og XM er de ansatte i bioMérieux selskap og har bidratt til dette arbeidet, derfor, som en av de bevilgende myndighet, spilte bioMérieux selskapet en rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere og utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Flere forfattere (QHX, FW, FL, XY og XM) er de ansatte i bioMérieux (Shanghai) Co. Ltd. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Andre forfattere erklærer ingen interessekonflikter.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er den tredje vanligste kreftformen hos menn og den nest vanligste kreftformen hos kvinner over hele verden. I 2008 ble mer enn 1,234,000 tilfeller nylig diagnostisert, og mer enn 608,000 mennesker døde av sykdommen [1]. Gitt sin langsomme utviklingen fra flyttbare forstadier til kreft og fra de herdbare tidlige stadier, screening for CRC har potensial til å redusere både forekomst og dødelighet av sykdommen [2]. De tilgjengelige screening verktøy inkluderer fekal okkult blod test (FOBT), krakk DNA-test, fleksibel sigmoidoskopi, CT colonography og koloskopi. Ulike screening strategier er på plass i ulike land. Men samsvar med gjeldende CRC screening anbefalinger forblir fattige. Den lave deltakelsen i CRC screening skyldes en rekke faktorer, inkludert lav nøyaktighet eksisterende avføring basert screening metoder, pasienten ubehag og dårlig aksept for endoskopi baserte metoder. En nøyaktig, minimal invasiv blodprøve som har potensial for større pasient compliance vil være en velkommen tillegg til dagens metoder. Når noe unormalt har blitt oppdaget av blodprøve, vil ytterligere tester som involverer koloskopi og patologisk undersøkelse bli anbefalt å bekrefte om det oppdages avvik er CRC.
Vi og andre har tidligere vist potensiell bruk av genuttrykk profilering av fullblodprøver for kreft deteksjon og diagnose [3] – [9]. Forut for den kliniske manifestasjon av CRC, noe som vanligvis tar flere år, reagerer vert på implantering av kreftceller via den aktiverte immunsystemet [10]. Aktiveringen av immunsystemet er reflektert i forandringer i genekspresjonsprofiler av immun kompetente blodceller, og disse endringene er detekterbare i perifert blod [11], [12]. I denne studien utførte vi genuttrykk profilering av perifere blodceller ved hjelp PAXgene ™ -teknologi og Affymetrix GeneChip® mikromatriser. Et stort antall gener differensielt uttrykte mellom kontroller og CRC-pasienter ble identifisert. Spesielt rapporterte vi overekspresjon profiler av Toll-like receptor (TLR) signalveier relaterte gener i CRC for å bane vei for ytterligere funksjonelle studier.
Materialer og metoder
Pasienter og prøvetaking
Denne studien ble utført ved Fudan University i Shanghai Cancer Center (FDUSCC), Shanghai, Kina. Studien ble godkjent av etisk komité FDUSCC for klinisk forskning. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne. Tjue CRC pasienter ble rekruttert ved Institutt for tykktarms Surgery, FDUSCC. Ingen pasienter fikk preoperativ strålebehandling eller cellegift. Pasienter som lider av arvelig CRC eller inflammatoriske tarmsykdommer (Crohns sykdom eller ulcerøs kolitt) ble ekskludert fra denne studien. Tjue friske frivillige uten noen gastrointestinale symptomer (diaré og magesmerter) ble rekruttert gjennom FDUSCC. Alle deltakerne hadde blod samling minst sju dager etter koloskopi eksamen. For hver samling, 2,5 ml perifert blod ble trukket inn i en PAXgene ™ Blood RNA tube (PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, CH) og lagret ved -80 ° C.
RNA Utvinning og microarray eksperimenter
Total RNA ble ekstrahert med PAXgene ™ blod RNA System (PreAnalytiX GmbH). Mengden av total-RNA ble målt med et spektrofotometer ved 260 nanometer, og den RNA integritet ble vurdert ved hjelp av en RNA-6000 Nano LabChip® Kit på en BioAnalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Alle prøver møtte kvalitetskriteriet: RNA Integrity Number 7.0 [13]. Femti nanogram total RNA ble omvendt transkribert og lineært forsterket som enkeltrådet cDNA ved hjelp av Ribo-SPIA ™ -teknologi med WT-Ovation ™ RNA Amplification System (Nugen Technologies Inc., San Carlos, CA, USA), og produktene ble renset ved hjelp den QIAquick PCR ™ rensesett (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). To mikrogram forsterket og renset cDNA ble deretter fragmentert med RQ1 RNase-Free DNase (Promega Corp., Fitchburg, WI, USA) og merket med biotinylerte deoksynukleosidtrifosfater bruker Terminal transferase (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, USA) og GeneChip® DNA Merking Reagens (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA). Det merket cDNA ble hybridisert på GeneChip® HG U133 Plus 2.0 Array i en Hybridisering Ovn 640 (Agilent Technologies) 60 omdreininger i minuttet ved 50 ° C i 18 timer. Etter hybridisering ble arrays vasket og farget i henhold til Affymetrix protokollen EukGE-WS2v4 bruker en GeneChip® lufthåndtering Station 450 (Affymetrix). Arrays ble skannet med GeneChip® Scanner 3000 (Affymetrix). Microarray data har blitt deponert i ArrayExpress offentlig register [14] med tiltredelse nummer E-MEXP-3756.
Statistical Analysis
genuttrykk dataanalyser ble utført ved hjelp av R-programvare og pakker fra Bioconductor prosjektet [15] – [17]. Rådata ble samlet inn fra CEL filer og preprocessed bruker Robust Multi-chip Average (RMA) algoritme for bakgrunnskorreksjon, quantile normalisering og median polsk samandrag [18], [19]. De probe-set-nivå data var log2-transformert. I tillegg benyttet vi et bioinformatikk-basert filtrering tilnærming ved hjelp av informasjon i Entrez Gene Database [20]. Probe sett uten Entrez Gene ID merknad ble fjernet. For flere probe setter kartlegging til samme Entrez Gene ID, bare sondere sett viser det største inter quantile utvalg ble holdt, og resten ble ekskludert.
Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM) metoden [21] ble brukt til å identifisere gener differensielt uttrykt mellom Kontroll og CRC grupper. For genuttrykk studier med mikromatriser, har det blitt vanlig praksis å fokusere på kontroll av den falske funnraten (FDR), som anslår den forventede andel av feil avslag blant de forkastede hypoteser [22], [23]. For å minimere falske positiver, setter vi terskelen til FDR på 0,01 for alle sammenligninger. Gene ontologi (https://www.geneontology.org) [24] og Panther pathway analyse (https://www.pantherdb.org/pathway) [25] ble utført ved hjelp av GeneCodis bioinformatikk verktøy [26] og programvare MetaCore ™ (GeneGo Inc., USA).
Gene Expression analyse av kvantitativ real-time PCR
for hver prøve, 200 ng av total RNA ble revers-transkribert til cDNA ved hjelp av Prime Script ™ revers transkriptase (Takara, Dalian, Kina). Kvantitativ real-time PCR ble utført av LightCyclerH 480 system (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) i 96-brønners plater ved hjelp SYBR Premiks Ex Taq ™ (Takara, Dalian, Kina). Primer sekvenser av målgener ble gitt i tabell S1.
CSNK1G2 plakater (kasein kinase 1, gamma 2) hadde tidligere blitt vist å bli stabilt uttrykt i humant fullblod [27], og således ble brukt som en intern kontroll. Den relative Kvantifiseringen av mRNA-ekspresjon ble beregnet ved anvendelse av metoden beskrevet av Vandesompele
et al product: [28]. Sammenligninger av genuttrykk profiler mellom to prøver ble vurdert ved hjelp av Welch t test. Betydningen testene var tosidig, og en
P
verdi under 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
Vår studie inkluderte 20 CRC pasienter og 20 friske kontroller. Alle deltakerne var kinesisk, hvorav 18 menn og 22 kvinner med en median alder på 58 år (fra 42-69 år). Alder og kjønnsfordeling ble balansert mellom Kontroll og CRC grupper. Tumorene ble satt opp i henhold til den Tumor-Node-Metastase (TNM) system. To av pasientene var CRC stadium I, 7 var fase II, 6 var stadium III, og 5 var stadium IV. Detaljerte pasient spesifikasjoner er beskrevet i Tabell 1 og Tabell S2.
Den nylige utgivelsen av HG-U133plus2 microarray tilbyr 54.000 probe sett for screening 38.500 menneskelige gener. Konfrontert med en slik overveldende mengde informasjon, var det nødvendig å redusere det totale antall gener analysert til et håndterlig antall gener med bekreftede biologiske merknader og bruk visualisering ordninger for å lette godkjenningen av mønstre i dataene [29]. Vi utførte derfor en bioinformatikk-basert filtrering prosedyre for å oppsummere sonde sett på gennivå og inkluderer disse sondesett med lavgradige biologiske merknader. Etter filtrering ble uttrykket profiler av 9,529 unike gener i 20 CRC pasienter og 20 kontroller beholdes for nedstrøms analyse.
Differensial uttrykte gener (degs) mellom styringen og CRC grupper ble identifisert med SAM-analyse (FDR = 0,01; Type = «Two klasse uparet»; testobservator = «t-statistikken»; antall permutasjoner = 1000). I alt ble 881 og 588 gener funnet å være opp- og ned-regulert i CRC pasienter. Funksjonell berikelse analyse av Gene ontologi og Panther veien ble utført med en betydning terskel på 0,05 for den justerte
P
verdi. The Panther pathway analyse viste en liste over 22 kanoniske trasé som ble betydelig konsentrasjon av C-listen. Som forventet, ble reaksjonsveier assosiert med spesifikke immunfunksjoner godt representert og meget signifikant, inklusive B-celleaktivering, T-celleaktivering, Interferon-gamma signalveien, og interleukin-signalreaksjonsveien. Parallelt ble flere angiogenese-relaterte pathways inkludert PDGF, VEGF og FGF signalveier også betydelig overrepresentert. De ti beste forbundet molekylære stier og relevante gener er vist i tabell 2. I tillegg til å identifisere de betydelige kanoniske trasé, vi også sjekket gener assosiert med funksjonelle kategorier. Den Gene ontologi Analysen avdekket totalt 74 biologisk prosess kategorier som var betydelig overrepresentert, inkludert medfødte immunrespons, signaltransduksjon, protein transport, apoptotiske prosessen, protein fosforylering og viral reproduksjon. De ti beste assosiert biologisk prosess Kategoriene er oppført i tabell 3.
Bemerkelsesverdig, TLR signalveier var den mest betydelig anriket element i både Panther sti og GO analyse (GO0002224: Toll- like receptor signalveien,
P =
1.7E-8; GO0002755: MyD88 avhengig toll-like receptor signalveien,
P =
1.1E-7, GO0034142: toll-like receptor 4 signalveien,
P =
1.1E-7 og Panther00054: Toll reseptor signalveien,
P =
1.1E-06). TLR signalveier fra MetaCore ™ -programvaren er grafisk representert i figur 1. Som observert fra grafen, flere TLRs (
TLR1, TLR2, TLR4, TLR6 Hotell og
TLR8
), samt som sine nedstrøms mål, var signifikant oppregulert i CRC pasienter. I tillegg ble det endogene ligander for TLRs også identifisert, inkludert
HSP70 Hotell og
HMGB1
, som har vist seg å opp-regulere
TLR2 Hotell og
TLR4
på kreftcelleoverflater og indusere tumorprogresjon og metastase [30], [31]. De aktiverte TLRs deretter rekruttere
MyD88
, fører til påfølgende aktivering av nedstrøms mål, inkludert
NF-kB
, mitogen-assosiert protein (MAP) kinase og interferon regulatoriske forhold [32].
den veien illustrasjonen ble generert og koblet med tilgjengelige eksperimentelle data i MetaCore ™ suite. Tolv gener (
TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR8, MyD88, MD-2, Beclin 1, TAB2, TAK1, IRAKM Hotell og
ikb)
at oppregulert i CRC pasienter er knyttet til Toll-like receptor signalveier og kan visualiseres på kartet som termometer lignende figurer. Up-avdelingen termometre har en rød farge og indikerer oppregulert nivåer av genekspresjon i CRC-pasienter.
kvantitativ real-time PCR er generelt ansett som «gullstandard» analyse for å måle genet uttrykk og er ofte brukt for å bekrefte funnene i microarray studier [33]. Vi dermed valgt seks TLR signalveier relaterte gener (
IRAK3, MD2
,
TLR1, TLR2, TLR4 Hotell og
TLR8
) for kvantitativ real-time PCR validering. Resultatene, som vist i tabell 4, indikerer at genekspresjonsprofiler bestemt av microarray hybridisering og kvantitativ sanntids analyse var meget sammenlignbare. De genet overekspresjon profiler i CRC pasienter ble bekreftet i real-time PCR data.
Diskusjoner
Tidlig påvisning av CRC er avgjørende for vellykket behandling og pasientens overlevelse. Men mangelen på samsvar fortsatt den største utfordringen i dag begrenser CRC screening effektivitet. De rike innhold av ulike cellulære og molekylære elementer i blodet, som gir informasjon om helsetilstanden til en person, gjør det til et ideelt rom for å utvikle ikke-invasive tester for CRC deteksjon [34]. I denne studien utførte vi global genekspresjon profilering av perifere blodprøver samlet inn fra 20 kontroller og 20 CRC pasienter. Vi identifiserte en liste over 1,469 konsensus gener som forskjellig uttrykt mellom kontrollene og CRC. Våre resultater er i overensstemmelse med tidligere studier [3], [5], [9] og viser at de fleste degs er involvert i immunresponser, samt celledelt apoptose, signaltransduksjon, protein transport- og genekspresjon regulering.
Kanskje det mest slående resultatet å dukke opp fra data er overekspresjon av TLR signalveien relaterte gener i CRC pasienter. TLRs, pattedyr homologer av Drosophila toll protein, er den beste-preget familien av mønstergjenkjenning reseptorer (PRRS) [35]. Hittil har TLRs 1-10 er identifisert hos mennesker [36]. TLR’ene spiller en avgjørende rolle i den medfødte immunrespons og den påfølgende induksjon av adaptive immunresponser mot mikrobiell infeksjon eller skade vev [37], [38]. Nyere studier viser at funksjonelle TLR’ene uttrykkes ikke bare på immunceller, men også på kreftceller, og dermed impliserer en rolle TLR’ene i tumorbiologi [39], [40]. En voksende mengde likene av bevis har antydet at TLRs fungere som et tveegget sverd i kreftceller [41]. På den ene siden, TLR’ene spille sentral rolle i aktiveringen av antitumorimmunresponser for å hemme tumorprogresjon. På den annen side, deregulert TLR signalisering kan gi en mikromiljøet som er nødvendig for tumorceller til å spre seg og unngå immunresponsen [42].
Spesielt har det vært flere studier som rapporterer en sammenheng mellom TLRs og tykktarms neoplasi. Fukata
et al.
Viste at TLR4 ble overuttrykt i mus betennelse-assosiert kolorektal neoplasi. De TLR4-mangelfull mus ble betydelig beskyttet mot tykktarmskreftutvikling [43]. Wang
et al.
Rapporterte høye uttrykk nivåer av TLR4 og MyD88 forbundet med levermetastaser og dårlig prognose i CRC pasienter [44]. I tillegg ble TLR4 og IL-6-ekspresjon i tumormikromiljøet assosiert med tilstedeværelse av adenokarsinom, og høyere nivåer av TLR4 ekspresjon i tumor stroma ble notert med sykdomsprogresjon [45].
I den første linje av immunforsvar, perifere blodceller er blitt vist å uttrykke alle TLR’ene og utviser høyere nivåer av TLR-mRNA sammenlignet med annet vev [46]. Vi postulerer at oppregulering av TLR-signaliserings-relaterte gener i perifert blod er sannsynlig på grunn av både infiltrasjon av TLR-uttrykkende inflammatoriske celler og opp-regulering av reseptorekspresjon på disse cellene som forekommer som respons på tumorvekst stimuli. Videre forskning vil være nødvendig for å forstå mekanistiske forholdet og de biologiske betydningene av overekspresjon av TLR trasé relaterte gener i CRC pasienter. Gitt terapeutisk bruk av TLR-agonister har blitt undersøkt i flere kreft modeller [41], systemisk studie av TLR «funksjoner kan bidra vesentlig til utviklingen av nye mål for diagnostisering og behandling av CRC.
I konklusjonen viser vi at overvåking genuttrykk i blod resulterer i forskjellige transkripsjons profiler mellom kontroller og CRC pasienter. Dermed holder microarray-baserte blod genuttrykk profilering store løftet for å utvikle nye biomarkører for CRC deteksjon. Fremtidige studier bør inkludere flere prøver for biomarkør identifisering og validering. Videre, gitt at CRC er ansett for å være en genetisk heterogen og epigenetiske sykdom [47], vil det også være interessant å undersøke blod genekspresjon profilen til forskjellige undertyper, noe som kan tilveiebringe en ny forståelse av CRC.
støtte Informasjon
Tabell S1.
Primer sekvenser av TLR-relaterte gener og
CSNK1G2
referanse genet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062870.s001 plakater (docx)
Tabell S2.
Detaljert klinisk informasjon av kontroller og CRC Pasienter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0062870.s002 plakater (docx)
Takk
Vi ønsker å takke alle av deltakerne i denne studien for deres bidrag. Vi setter stor pris på innsatsen til Wencui Huang og hennes kolleger ved Institutt for kolorektal inngrep, Fudan University i Shanghai Cancer Center, og deres utmerkede arbeid i prøvetakingen.
