Abstract
Formål
Exosomal microRNAs (mirnas) har vært å tiltrekke stor interesse som potensielle diagnostiske biomarkører for kreft. Målet med denne studien var å karakterisere miRNA profiler av serum exosomes og å identifisere de som er endret på tykktarmskreft (CRC). For å vurdere sin bruk som diagnostiske biomarkører, forholdet mellom spesifikke exosomal miRNA nivåer og patologiske forandringer av pasienter, inkludert sykdom scenen og tumor reseksjon, ble undersøkt.
Experimental Design
Microarray analyser av miRNAs i exosome-beriket fraksjoner av serumprøver fra 88 primær CRC pasienter og 11 friske kontroller ble utført. Uttrykket nivåer av mirnas i kulturmediet av fem tarmkreftcellelinjer ble også sammenlignet med de i kulturmediet av en normal tykktarm-avledet cellelinje. Uttrykket profiler av mirnas som ble forskjellig uttrykt mellom CRC og kontrollutvalget settene ble bekreftet ved hjelp 29 parvise prøver fra post-tumorreseksjon pasienter. Følsomheten til utvalgte mirnas som biomarkører for CRC ble vurdert og sammenlignet med de kjente tumormarkører (CA19-9 og CEA) ved hjelp av en mottaker som opererer karakteristisk analyse. Uttrykket nivåer av utvalgte mirnas ble også validert av kvantitativ real-time RT-PCR analyser av et uavhengig sett av 13 CRC pasienter.
Resultater
Serum exosomal nivåer av syv mirnas (brev 7a, MIR-1229, MIR-1246, MIR-150, MIR-21, MIR-223, og MIR-23a) var signifikant høyere i primære CRC pasienter, selv de med tidlig stadium sykdommen, enn hos friske kontroller, og var signifikant nedregulert etter kirurgisk reseksjon av tumorer. Disse mirnas ble også utskilt ved betydelig høyere nivåer av koloncancer cellelinjer enn ved en normal tykktarm-avledet cellelinje. De høye følsomhet for de sju utvalgte exosomal mirnas ble bekreftet av en mottaker som opererer karakteristisk analyse.
Konklusjon
Exosomal miRNA signaturer synes å speile patologiske forandringer av CRC pasienter og flere mirnas er lovende biomarkører for ikke -invasive diagnose av sykdommen
Citation. Ogata-Kawata H, Izumiya M, Kurioka D, Honma Y, Yamada Y, Furuta K, et al. (2014) Sirkulasjons Exosomal microRNAs som Biomarkører for tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (4): e92921. doi: 10,1371 /journal.pone.0092921
Redaktør: Tadayuki Akagi, Kanazawa University, Japan
mottatt: 13 november 2013; Godkjent: 26 februar 2014; Publisert: 04.04.2014
Copyright: © 2014 Ogata-Kawata et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Bevilgninger gitt av Advanced Research for medisinske produkter Mining Program av National Institute of Biomedical Innovation (Nibio) (08-02), https://www.nibio.go.jp; Grant-in-Aids fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds (13802015), https://www.mhlw.go.jp/; Grant-in-Aids fra departementet for utdanning, kultur, Sport Teknologi fra Japan (13314780), https://www.jsps.go.jp/; National Cancer Center Research and Development Fund (23-B-08), https://www.ncc.go.jp. National Cancer Center Biobank er støttet av National Cancer Center Research and Development Fund. . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser: Hideki Ohta, Hiroyuki Okamoto og Hikaru Sonoda, er ansatte i Shionogi Co., Ltd Shionogi Co, Ltd har en eksklusiv lisens for flere mirnas presenteres i dette arbeidet. Shionogi Co Ltd har søkt om patent (WO2011 /040525) for utviklingen av disse miRNAs som diagnostiske markører. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Tykktarmskreft (CRC) er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis [1]. Systematiske metoder for diagnostisering av patologiske tilstander kan bidra til en høy oppklaringsprosenten av pasienter på tidlige stadier av CRC, som fører til en reduksjon i dødelighet. Gjennomføring av fekalt skjult blod og fleksibel sigmoidoskopi som screeningsmetoder har redusert CRC dødelighet [2], [3]. Imidlertid har disse teknikkene har iboende begrensninger; følsomheten for påvisning av skjult blod i avføring test er forholdsvis lav og fleksibel sigmoidoskopi er invasiv og ubehagelig for pasienten. Karbohydrat antigen 19-9 (CA19-9) og carcinoembryonic antigen (CEA) har vært mye brukt som tumor markører for deteksjon av mange typer kreft, inkludert tykktarm, lever, bukspyttkjertel og mage. Imidlertid er følsomheten av disse markører for påvisning av CRC lav, spesielt i de tidlige stadier av sykdommen [4]. Det er derfor et behov for utvikling av CRC-spesifikke diagnostiske markører for hurtig, ikke-invasiv, og svært følsom screening av pasienter.
microRNAs (mirnas) er endogene, små, ikke-kodende RNA og deres vev-spesifikk ekspresjon bidrar til nøyaktig styring av forskjellige biologiske prosesser [5], [6]. Dysfunksjon av mirnas er funnet i en rekke kreftformer og de endogene ekspresjons-profiler av mirnas kan brukes til å klassifisere krefttyper [7], [8]. Flere mirnas som viser høye nivåer av ekspresjon i kreftvev har blitt rapportert som egnede diagnostiske eller prognostiske markører [9]. Nyere studier har vist at mirnas utskilles fra forskjellige celler, inkludert kreft celler, inn i kroppsvæsker slik som blod, urin, brystmelk og spytt,
via
exosomes [10] – [12]. Exosomes er små membranvesiklene på omtrent 100 nm som bygger protein, lipider, mRNA, og mirnas, avhengig av opprinnelsen av sekresjonsceller [13], [14]. Derfor kan exosomal mirnas i kroppsvæsker være nyttige diagnostiske biomarkører for diagnostisering av kreft [10], [15]. Men det er for tiden mangel på informasjon om forholdet mellom exosomal miRNA profiler i blodet og den patologiske tilstanden til kreftpasienter.
Her har vi utført mikromatrisebasert profilerings av exosomal miRNAs i sera fra friske kontroller (HC’er ) og primær CRC pasienter. Mirna profiler i exosomes fra tykktarmskreft cellelinjer ble også undersøkt for å identifisere kandidat biomarkører utskilt av tykktarmskreftceller. De exosomal miRNA signaturer skilte mellom CRC pasienter og kontroller. Ved å sammenligne miRNA profiler av kliniske prøver og cellelinjer, åtte mirnas (la-7a, MIR-1224-5p, MIR-1229, MIR-1246, MIR-150, MIR-21, MIR-223, og MIR-23a) som ble signifikant forhøyet i serum exosomes fra primær CRC pasienter og ble nedregulert etter operasjonen ble identifisert. CRC-forbundet høyde på syv av disse exosomal miRNAs ble validert i en uavhengig prøvesett ved hjelp av kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR). Til sammen resultatene presentert her viser at exosomal miRNA signaturer reflektere patologiske forandringer i CRC pasienter og gjelder for utvikling av diagnostiske strategier for påvisning av primær CRC.
Materialer og metoder
kliniske prøver
Serumprøver prøver~~POS=HEADCOMP fra 88 CRC pasienter (i alderen 35 til 65 år) med en primærtumor ble levert av National Cancer Center Hospital Biobank, Japan (Tokyo, Japan) fra 2003 til 2004. Serumprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble også samlet inn fra 29 av pasientene etter kirurgisk reseksjon av primærtumor fra 2003 til 2004. for validering av QRT-PCR, ble serumprøver fra 13 ulike CRC pasienter (i alderen 45 til 70 år) med en primærtumor levert av National Cancer Center Hospital Biobank , Japan i 2009. Kirurgiske prøver av primær tykktarmskreft og omkringliggende ikke-kreft regioner ble innhentet fra pasienter behandlet ved Teikyo universitetssykehus (Tokyo, Japan) [16]. Sera fra 19 personer (i alderen 35 til 65 år) som gjennomgikk en fullstendig fysisk screening ved NTT Medical Center Tokyo (Japan) i 2011 ble brukt som HC prøver. Serumprøver ble lagret ved -20 ° C inntil bruk.
Etikk erklæringen
Institutional Review Board godkjenninger for bruk av prøvene ble oppnådd ved NTT Medical Center, University of Tokyo, og National Cancer Senter. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasientene inkludert i studien.
Cellelinjer
Alle cellelinjer brukt i denne studien ble hentet fra den amerikanske Tissue Culture Collection. Normale humane føtale tykktarm-avledet FHC-celler ble dyrket i DMEM-F12 inneholdende 25 mM HEPES, 10 ng /ml koleratoksin, 5 ug /ml insulin, 5 ug /ml transferrin, 100 ng /ml hydrokortison, og 10% føtalt bovint serum [17]. Den HCT116, HT-29, RKO, SW48, og SW480 human koloncancercellelinjer ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum [18] – [20]. Dyrkningsmediet ble samlet opp etter vekst av cellene i 48 timer.
Fremstilling av exosome-anrikede fraksjoner
Exosome fraksjoner ble fremstilt ved en trinnvis sentrifuge-ultrasentrifugemetoden, slik som beskrevet tidligere med mindre modifikasjoner [13]. I korthet, ble kulturmediet fra tarmkreftcellelinjer ble sentrifugert ved 500 x g i 5 minutter for å fjerne celleavfall, og deretter sentrifugert ved 16 500 x g i 20 min ved anvendelse av en JA-30.50 rotor (Beckmann). Den klart Supernatanten ble ført gjennom et 0,20 um filter, og deretter ultrasentrifugert ved 120.000 x g i 70 min ved anvendelse av et TLA-110 rotor (Beckmann). Pelletene ble vasket med fosfat-bufret saltvann (PBS) og deretter resuspendert i 250 ul PBS som exosome-anrikede fraksjoner. Serumprøver (750 ul) fra CRC-pasienter og HC’er ble fortynnet åtte ganger med PBS, og de exosome-anrikede fraksjoner ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Berikelse av exosome markør CD81 i de preparerte fraksjoner ble bekreftet av immunoblot analyse (se Metoder S1 og figur S1).
Utarbeidelse av total exosomal RNA
exosome brøkdel forberedt fra serum ble blandet med 750 ul av Trizol-LS-reagens (Invitrogen) og den vandige fase ble samlet opp ved tilsetning av kloroform. Etter tilsetning av etanol til den vandige fase, ble total RNA renset ved anvendelse av RNeasy Mini sentrifugekolonner (Qiagen). RNA-prøven ble tørket ved anvendelse av en speed-vac sentrifugale konsentrator (Savant) og deretter oppløst i 10 ul av nuklease-fritt vann. Konsentrasjonen av RNA ble bestemt ved hjelp av en Nanodrop spektrofotometer (Thermo Scientific) og Quanti-iT RiboGreen RNA-analysesett (Invitrogen). Kvaliteten på RNA ble analysert ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer og små RNA-chips (Agilent Technologies).
miRNA microarray analyse
Total RNA fra exosome fraksjonene ble merket med PCP-Cy3 hjelp av Agilent miRNA merking reagens, og deretter hybridisert til et menneske miRNA oligonukleotid mikromatriser (8 × 15 K, versjon 3.0, Agilent Technologies), i henhold til produsentens instruksjoner. Etter hybridisering, ble rekken vasket med Gene uttrykk Wash Buffer kit (Agilent Technologies) og skannet med en Agilent DNA microarray scanner. Etter numerisk konvertering av rådata hjelp Feature Extraction programvare (versjon 10.7, Agilent Technologies), ble de transformerte data analysert ved hjelp GeneSpring GX-programvaren (versjon 12.5, Digital biologi). Signalintensitetene for flekker på microarray ble normalisert til den totale signalstyrken for matrisen og er vist som prosent. De miRNA microarray data har blitt deponert i NCBI Gene Expression Omnibus database med tiltredelse kode GSE40247.
QRT-PCR
Exosomal mirnas ble revers transkribert ved hjelp MultiScribe revers transkriptase (Life Technologies) og miRNA- spesifikke primere. De mirnas ble kvantifisert ved real-time PCR bruker TaqMan mikroRNA kits (Life Technologies) og 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems), ifølge en standard protokoll [21]. Den komparative syklusen terskel (CT) ble anvendt for å evaluere den relative deteksjonsnivået av hvert miRNA i prøven, som ble bestemt ved å bruke 2
-ΔΔCT metoden [22]. I QRT-PCR-forsøk ble MIR-451 anvendt som en indre standard, fordi det var påvisbare i alle prøver og dens normaliserte intensiteten var ikke signifikant forskjellig mellom HC og CRC serum exosomes (
P
0,05).
statistisk analyse
en tosidig paret Student
t
-test eller Welch er
t
-test ble brukt til å bestemme statistisk signifikans av forskjeller i microarray signal intensiteter. Hierarkisk clustering analyse av datasettet for alle miRNA profiler ble utført ved hjelp av Ward metode. Mottakeren arbeidskarakteristikken (ROC) kurve, og arealet under kurven ble analysert for å vurdere muligheten for å bruke en valgt miRNA forhold til hverandre som en diagnostisk markør for CRC. Korrelasjonskoeffisienter av exosomal miRNA profiler mellom cellelinjer og av nivåene av CA19-9, CEA, og exosomal mirnas i pasientserum som kandidat CRC markører ble bestemt ved multivariat analyse. Disse analysene ble utført ved anvendelse JMP9 programvare. Den Jonckheere-Terpstra test (SPSS programvare, versjon 18) ble benyttet for å bestemme sammenhengen mellom CRC svulst /node /metastase (TNM) stadier og miRNA nivåer.
Resultater
Identifikasjon av exosomal miRNAs som er forhøyet i CRC ved mikromatriseanalyse
Microarray-basert screening ble brukt til å påvise miRNA nivåer i exosomal fraksjoner av serumprøver fra CRC og HC-pasienter, såvel som kulturmedium fra en normal tykktarm-avledet cellelinje og fem forskjellige menneskelige tykktarmskreft cellelinjer. Figur 1 viser en oversikt over den screening strategien anvendt. De exosome-anrikede fraksjoner ble fremstilt ved anvendelse av en trinnvis sentrifuge-ultrasentrifugemetoden, som vist i figur S1A. Anrikning av små RNA og CD81 i exosome fraksjonene ble bekreftet ved kapillær elektroforese og immunoblotanalyse, henholdsvis (fig S1B-D). En multivariat analyse og korrelasjons plott av microarray data indikerte reproduserbar deteksjon av exosomal miRNAs i uavhengige eksperimenter og korrelasjoner mellom miRNA profiler av de ulike kreftcellelinjer (figur S1E og tabell S1). De exosomal miRNA profiler av de fem tykktarmskreftcellelinjer og FHC cellelinjen var forskjellig fra de endogene cellulære miRNA profiler (figur S1F).
miRNA profiler av exosome fraksjoner av serumprøver fra 88 primære CRC pasienter (inkludert TNM kliniske faser I, II, Ula, Illb, og IV) og 11 HC’er ble bestemt ved anvendelse av mikromatriser. Karakteristikken av pasientene og de exosomal mirnas detektert i hver gruppe er vist i tabell 1. ble detektert Totalt 164 mirnas i alle serumprøver som ble undersøkt (fig S2A) og 69 mirnas ble uttrykt ved betydelig høyere nivåer i CRC-pasienter enn HCS (
P
0,05) (Tall S2B og S2C, Tabell S2). Analyse av exosomal miRNA profiler av kulturmedier fra fem forskjellige tykktarmskreft cellelinjer og normal tykktarm epitelceller FHC celler viste at 52 mirnas ble utskilt ved betydelig høyere nivåer fra alle fem tykktarmskreft cellelinjer enn fra FHC celler (Tall S3A og S3b, Tabell S3).
En sammenligning av de 69 oppregulert mirnas fra CRC pasienter og de 52 oppregulert mirnas fra tykktarmskreft cellelinjer viste at 16 mirnas var tilstede i begge settene (figur 2 ): la-7a, MIR-1224-5p, MIR-1229, MIR-1246, MIR-1268, MIR-1290, MIR-1308, MIR-150, MIR-181b, MIR-181d, MIR-1915, speil 21, MIR-223, MIR-23a, MIR-483-5p, og MIR-638. De endogene ekspresjonsnivåene av disse mirnas ble deretter målt i FHC og tykktarmskreftcellelinjer, så vel som kreft i tykktarmen og som samsvarer ikke-cancerøse vev fra fire andre pasienter. Med unntak av MIR-181d, som var signifikant oppregulert i begge kreftceller og vev ingen av disse mirnas ble uttrykt i kreft vev (Figur S3C) eller cancercellelinjer (
P
0,05 ) (figur S3D) ved betydelig høyere nivåer enn de samsvarende ikke-cancervev eller FHC-cellelinjen, henholdsvis. Disse resultater indikerer at utskillelsen av mirnas er ikke avhengig av deres cellulære ekspresjonsnivåer og antyder at opp-regulert endogene mirnas i kreftceller er ikke nødvendigvis er substrater for exosome-mediert sekresjon. Colon kreft celler synes å skille ut en undergruppe av miRNAs i ekstracellulære rom via exosomes.
Serum exosomal miRNA nivåer i 11 HCS (blå) og 88 CRC pasienter (rød) på ulike TNM stadier (I-IV). Signalintensitetene ble normalisert til den totale signalstyrken for microarray. De horisontale linjer angir den midlere normaliserte signalintensiteten for hver gruppe. Statistisk signifikante forskjeller ble bestemt av Welch er
t
-test.
Forholdet mellom serum exosomal nivåer av 16 mirnas og kliniske stadier av tykktarmskreft
Neste, vi analyserte forholdet mellom de 16 vanligvis opp-regulert mirnas og kliniske stadier av CRC ved separering av CRC-pasienter på grunn av deres TNM stadium. For hver miRNA, ingen signifikant korrelasjon (
P
0,05) mellom exosomal nivå og det kliniske stadium av sykdommen ble identifisert ved en Jonckheere-Terpstra test (fig S4)
ned. -regulation av åtte mirnas etter fjerning av primærtumor
for å avgjøre om de 16 vanligste oppregulert mirnas stammer fra kreftceller, ble microarray analyser benyttet for å bestemme nivåene av disse mirnas i exosome-beriket fraksjoner av matchet serum prøvene samles inn etter kirurgisk reseksjon av primærtumor (n = 29 pasienter). Ekspresjonsnivåene av åtte av de mirnas ble signifikant redusert (
P
0,05) etter fjernelse av de primære tumorer (Figur 3 og Tabell S4): la-7a, MIR-1224-5p, MIR-1229, MIR-1246, MIR-150, MIR-21, MIR-223, og MIR-23a. Disse resultatene tyder på at disse åtte mirnas kan utledes fra exosomes utskilt av kreftceller, og at deres nivå kan reflektere tykktarmskreft status av pasienter.
(A) punktplott av 16 vanlige oppregulert serum exosomal mirnas i CRC pasienter (n = 29) før (Pre) og etter (Post) kirurgisk fjerning av svulster. Prøvesettet er inkludert trinn I (n = 6), trinn II (n = 6), trinn Illa (n = 5), trinn Illb (n = 9), og stadium IV (n = 4) pasienter. De data som representerer de gjennomsnittlige normaliserte signal intensiteter (%). De røde prikkene indikerer de åtte mirnas som var signifikant nedregulert etter tumorreseksjon: la-7a, MIR-1224-5p, MIR-1229, MIR-1246, MIR-150, MIR-21, MIR-223, og speil 23a. (B) Individuelle endringer i serum exosome nivåene av de åtte nedregulert mirnas i CRC-pasienter (n = 29) før (pre) og etter (post) kirurgisk fjerning av svulster. Statistisk signifikante forskjeller mellom gjennomsnitts Pre verdier og gjennomsnitts Innlegg verdier ble bestemt av paret Students
t
-UNDERSØKELSER.
Potensielle serum exosome mirnas for applikasjons som diagnostiske biomarkører
for å estimere sin makt som potensielle diagnostiske markører, cut-off verdiene av de åtte mirnas som var oppregulert i tykktarmskreft og nedregulert etter tumorreseksjon ble analysert ved hjelp av en ROC-kurve (figur 4). Den sanne positiver av MIR-1246 og MIR-23a for identifisering av de 88 CRC pasientene var 95,5% og 92,0%, henholdsvis; disse mirnas hadde også lave falske positive for identifisering av de 11 HCS (9% og 0%, henholdsvis). Den sanne positiver av MIR-21, MIR-150, la-7a, MIR-223, MIR-1224-5p, og MIR-1229 for identifisering av CRC var 61,4%, 55,7%, 50,0%, 46,6%, 31,8% og 22,7%, henholdsvis; falske positiver av disse mirnas varierte fra 0% til 9% (figur 4). Det skal bemerkes at en kombinert bruk av 8 mirnas ikke viste mer diagnostisk kraft enn de i Mirs-1246 og -23a (data ikke vist). Til sammenligning følsomheten til CEA og CA19-9, som er kjent biomarkører av CRC, var 30,7% og 16,0%, respektivt. En multivariat analyse viste ingen sammenheng mellom nivåene av de åtte utvalgte mirnas i serum exosomes og serumnivåer av CEA og CA19-9 (tabell S5). Derfor har vi revurdert uttrykket nivåer av de åtte mirnas i serum exosomes ved QRT-PCR-analyser av ytterligere prøvesett som inkluderte åtte HC’er, syv trinn I CRC pasienter og seks trinns II CRC pasienter (Tabell S6). Nivåene av syv av de miRNAs, nemlig la-7a, MIR-1229, MIR-1246, MIR-150, MIR-21, MIR-223, og MIR-23a, var signifikant høyere i serum exosomes fra CRC pasienter enn de fra HCS (
P
0,05) (figur 5). Statistisk signifikant økning i uttrykk nivåer av disse mirnas selv ble observert for tidlig (TNM stadium I) CRC prøver (Figur S5). Disse resultatene tyder på at serum exosomal mirnas kan være nyttig for tidlig deteksjon av primære CRC.
Signalintensitetene til de mirnas er vist som prosentandeler av den totale signalintensiteten. De cut-off verdiene av de åtte mirnas som var oppregulert i tykktarmskreft og nedregulert etter tumorreseksjon ble analysert ved hjelp av en ROC kurve. Svarte bokser indikerer pasienter over cut-off verdien av biomarkører eller miRNA nivåer. De normaliserte intensiteter av ikke målbare mirnas i serum exosomes ble beregnet som 0.
Box-and-whisker plott av uttrykket nivåer av de åtte utvalgte mirnas i et uavhengig sett med HCS (n = 8) og CRC pasienter med primær tumor (n = 13). Statistisk signifikante forskjeller mellom HC og CRC datasett ble bestemt av Welch er
t
-UNDERSØKELSER. Den komparative syklus terskel (Ct) metoden ble brukt til å kvantifisere nivåene av exosomal mirnas i HC og CRC pasienter. Den relative forholdet ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode. Den Ct-verdien av MIR-451 ble anvendt som en indre standard. Hvert datapunkt ble normalisert til et representativt HC prøve.
Diskusjoner
Nylig har mirnas tiltrukket stor interesse som et middel for å analysere de molekylære stier involvert i kreftutvikling og progresjon. I tillegg til sine viktige cellulære funksjoner, er det mulig at utskilling mirnas innleiret i exosomes kan være diagnostiske markører for diagnose av kreft. Her, omfattende analyser av exosomal miRNA profiler identifisert 16 mirnas som ble uttrykt ved betydelig høyere nivåer i tykktarmskreft cellelinjer og serumprøver fra CRC pasienter enn normalt kolon-deriverte celler og serumprøver fra HC’er hhv. Endogene ekspresjonsnivåene av de fleste av disse mirnas ikke ble oppregulert i kreftcellelinjer og cancervev, noe som tyder på at exosomal sekresjon av mirnas er ikke avhengig av cellulære ekspresjonsnivåer. På den annen side, MIR-181, en kontekstavhengig kreft-assosiert miRNA [23], [24], bare antydet oppregulert cellulære og exosomal uttrykk nivåer i cancercellelinjer og kliniske prøver, noe som tyder på en interessant hypotese at funksjonen av exosomal MIR-181 kan være involvert i tykktarmskreft utvikling og progresjon.
serum exosomal nivåer av åtte av disse 16 mirnas var signifikant nedregulert etter kirurgisk reseksjon av primærtumor, noe som tyder på at disse mirnas skilles fra tumorceller. Men vi ikke utelukke at disse mirnas skilles fra andre celler, inkludert immun og inflammatoriske celler, som oppstår tilfeldig i primær lesjoner av vevet. Til slutt, CRC-assosiert økning av de exosomal nivåer av syv miRNA nivåer (la-7a, MIR-1229, MIR-1246, MIR-150, MIR-21, MIR-223, og MIR-23a) ble validert ved QRT-PCR , noe som indikerer at disse mirnas kan være egnede biomarkører for å oppdage tykktarm kreft. De høye følsomhet og spesifisitet av disse exosomal mirnas bestemmes av ROC-analyse (figur 4) støtter deres bruk som diagnostiske biomarkører.
exosomal nivåene av de syv utvalgte mirnas var ikke avhengig av den kliniske fasen av CRC (figur S4 ). Faktisk, MIR-23a og MIR-1246 viste høy følsomhet for stadium I prøver av 95% og 90%, henholdsvis. Til sammenligning følsomheten CA19-9 og CEA for scene jeg CRC er bare 10 og 15%, henholdsvis. Videre QRT-PCR viste reproduserbar påvisning av disse mirnas ved høye nivåer i et uavhengig sett av serum exosomes fra trinn I CRC pasienter (fig S5). Disse funnene tyder på at disse mirnas er egnede biomarkører for påvisning av tidlig stadium CRC. Imidlertid er ytterligere validering nødvendig for å støtte dette forslaget.
En fersk rapport viste at la-7a blir uttrykt ved høye nivåer i exosomes utskilt i serum ved hjelp av glioblastom tumorceller [15]. I tillegg, er MIR-1246 påvises i hele serumprøver, snarere enn exosome fraksjoner, fra esophageal kreftpasienter [25]. Vi målte også la-7a, MIR-1224-5p, og MIR-150 nivåer i kulturmediet av pankreatiske cellelinjer og funnet at nivåene var lik de som utskilles av fem kolon cancer-cellelinjer (data ikke vist), noe som tyder at disse ofte mirnas utskilt fra ulike kreftceller. Flere rapporter har foreslått bruk av sirkulerende mirnas i hel plasma eller serum, som blant annet MIR-141, MIR-21, MIR-221, MIR-29, og MIR-92a, som diagnostiske biomarkører for CRC [26] – [30]. Disse mirnas ble vist å vise sensitivitet og spesifisitet sammenlignbare med de for tykktarmskreftmarkører for tiden er i bruk. Spesielt ble MIR-141, MIR-221, og MIR-21 rapportert å være oppregulert i kreftvevet [31] – [33]; den totale miRNA sett fra hel plasma eller serum kan inneholde endogene celle mirnas avledet fra oppløste eller sirkulerende tumorceller [34], [35], som kan forklare hvorfor MIR-141, MIR-221, og MIR-21 er tilstede på et høyt nivå i hele serum- eller plasmaprøver fra kreftpasienter. I tillegg ble serum /plasma mirnas, som ikke er forbundet med vesikler, rapportert å vise forskjellige stabilitet for behandling med RNase A [36], som tyder på at exosomal mirnas er mer å foretrekke som biologiske prøver for utvikling av diagnostiske biomarkører på grunn av deres stabilitet i serum /plasma. Faktisk er resultatene presentert her viser at exosomal miRNA nivåer også reflektere kreft-bærende status og patologiske forandringer av pasienter. Exosomes aktivt frigjort fra kreftceller og deres spesifikke bestanddeler avhengig av cellen hvorfra de stammer. Faktisk kan kreftceller bruke en foreløpig uidentifisert mekanisme for å bygge inn en undergruppe av miRNAs i exosomes.
I sammendraget, forsøk har nylig blitt gjort for å bruke mirnas i serum eller plasma som diagnostiske biomarkører for ulike kreftformer [37] ; men det er foreløpig ingen samlet oversikt over hvilke mirnas bør velges som markører. De unike egenskapene til exosomes, inkludert deres evne til å legge inn spesifikke mirnas, deres stabilitet i omløp, deres reproduserbar deteksjon og, viktigst av alt, det faktum at de gjenspeiler egenskapene til kreftceller, kan gjøre dem nyttige for utviklingen av svært sensitive diagnostiske strategier for rask og ikke-invasiv monitorering av patologisk tilstand av kreftpasienter.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Fremstilling av exosome-anrikede fraksjoner fra serum eller cellekulturmedium. (A) Oversikt over exosome-berikelse prosedyre. (B) Immunoblot-analyse av CD81-nivåer i humane sera før exosome-anrikning og før (spor 2) eller etter overnsight lagring ved 4 ° C (kolonnene 5 og 6), -20 ° C (kolonnene 7 og 8), eller – 80 ° C (sporene 9 og 10). Føtalt bovint serum (FBS) før (spor 1) og etter lagring over natten ved 4 ° C (kolonnene 3 og 4) ble anvendt som en kontroll. Den exosome-anrikede fraksjon ble deretter fremstilt fra 1 ml av serum ved hjelp av ultrasentrifugemetoden beskrevet i Materialer og metoder (felt 11). Fem mikroliter av hver serumprøve, eller 300 ng av det anrikede fraksjon ble applisert på en 10-20% gradient SDS-polyakrylamidgel. CD81, et exosome markør, ble oppdaget ved hjelp av et spesifikt antistoff. (C) Deteksjon av RNA liten fraksjon av cellulære total RNA (endogene) og exosomal RNA (exosomal) fra HCT116-celler (30 ng av hver). De RNA ble lastet på 5-150 nt små RNA chips (Agilent) og kapillær elektroforese ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer. En liten RNA fraksjon som inneholder mirnas påvises ved ca 10-40 nt. Toppen på 4 representerer nt en størrelsesmarkør. De fylte og åpne piler indikerer 5S tRNA og små rRNAs hhv. FU, fluorescens enheter. (D) Immunoblot-analyse av CD81-ekspresjon i serumfritt kulturmedium fra HCT116-celler før og etter exosome-anrikning. De angitte mengder av proteinprøver fra cellepelleten, kulturmedium og exosome-anrikede fraksjoner ble underkastet immunoblotanalyse anvendelse av antistoffer målrettet mot CD81 eller anti-γ-tubulin, en representativ intracellulært protein. Lanes 1-4, cellepelleten; baner 5-7, serumfritt kulturmedium; baner 8-10, exosome-anrikede fraksjon. (E) Spredningsplott av normalisert signal intensitet (%) av exosomal mirnas (venstre panel) og endogene cellulære mirnas (høyre panel) i de angitte cellelinjer. (F) Hierarkisk clustering av endogene og exosomal mirnas i normal FHC cellelinje og fem humane tykktarmkreft cellelinjer. Dataene representerer middelverdier av normaliserte signal intensiteter (%) av n = 3 uavhengige eksperimenter. Totalt 489 mirnas var påvises i alle prøvene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0092921.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
Microarray analyse av miRNA profiler i exosome-beriket serumprøver fra CRC pasienter og HC’er. (A) Hierarkisk clustering av exosomal miRNAs i prøver fra 11 HC’er og 88 CRC pasienter (TNM: stadium I, n = 20, fase II, n = 20; stadium IIIa, n = 20; stadium IIIb, n = 16; stadium IV , n = 12). Den blå og røde skyggelegging indikerer HC og CRC pasienter. Signalintensitetene til hver miRNA er vist som en prosentandel av det totale signalintensitet på matrisen. Totalt 64 mirnas ble påvist i alle serumprøver ble undersøkt. (B) Hierarkisk gruppering av de 69 mirnas som ble uttrykt ved betydelig høyere nivåer i CRC pasienter enn HCS (
P
0,05 av Welch er
t
-test). (C) Punktdiagram av den normaliserte signalintensitetene av de 69 exosomal mirnas som var oppregulert i CRC-pasienter (y-aksen) i forhold til HC’er (x-aksen). Dataene representerer gjennomsnittsnormaliserte signal intensiteter av hver miRNA fra CRC og HC pasienter
doi:. 10,1371 /journal.pone.0092921.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Microarray analyse av exosomal mirnas fra tykktarmskreft cellelinjer og endogene uttrykk nivåer av miRNAs. (A, B) Uttrykket nivåene av de 52 mirnas som ble utskilt fra fem tykktarmskreftceller ved betydelig høyere nivåer enn fra FHC-celler (
P
0,05). Dataene representerer gjennomsnittsnormaliserte signal intensiteter av n = 3 uavhengige microarray eksperimenter.
