Abstract
Fast, parafininnstøpte (FPE) vev er en potensielt rik ressurs for å studere rollen NOTCH1 i kreft og andre sykdommer, men tester som pålitelig oppdage aktivert NOTCH1 (NICD1) i FPE prøvene vært mangelfull. Her bro vi dette gapet ved å utvikle en immunhistokjemisk (IHC) flekken som oppdager en neoepitope skapt av proteolytisk spalting hendelsen som aktiverer NOTCH1. Etter godkjenning ved xenopodet kreft og normalt vev med kjente mønstre av NOTCH1 aktivering, søkte vi denne testen for svulster knyttet til feilregulert Notch signalering av mutasjonsstudier. Som ventet ble hyppig NICD1 farging observert i T lymfatisk leukemi /lymfom, en svulst som aktiverer
NOTCH1
mutasjoner er vanlig. Men når IHC ble brukt til å måle NOTCH1 aktivering i andre menneskelige kreft, flere uventede funn dukket opp. Blant B-celle svulster, NICD1 flekker var mye hyppigere i kronisk lymfatisk leukemi enn det som ville forutsies basert på frekvensen av
NOTCH1
mutasjoner, mens mantelcellelymfom og diffuse store B-celle lymfom viste ingen tegn på NOTCH1 aktivering. NICD1 ble også påvist i 38% av de perifere T-celle lymfomer. Av interesse, ble NICD1 flekker i kronisk lymfatisk leukemi celler og i angioimmunoblastic lymfom konsekvent mer uttalt i lymfeknuter enn i omkringliggende bløtvev, implicating faktorer i nodal mikromiljøet i NOTCH1 aktivering i disse sykdommene. Blant karsinom, ble diffus sterk NICD1 farging observert i 3,8% av tilfellene av trippel negativ brystkreft (3 av 78 svulster), men var fraværende fra 151 ikke-småcellet karsinom og 147 eggstokkene karsinomer. Hyppig farging av normal endotelium ble også observert; i tråd med denne observasjonen, ble sterk NICD1 flekker også sett hos 77% av angiosarcomas. Disse funnene utfylle innsikter fra genomisk sekvense studier og foreslå at IHC farging er en verdifull eksperimentell verktøy som kan være nyttig i valg av pasienter til kliniske studier
Citation. Kluk MJ, Ashworth T, Wang H, Knoechel B, Mason EF, Morgan EA, et al. (2013) Måle NOTCH1 Activation in Cancer Bruke Immunohistochemistry. PLoS ONE 8 (6): e67306. doi: 10,1371 /journal.pone.0067306
Redaktør: Jose Angel Martinez Climent, Universitetet i Navarra, Senter for anvendt medisinsk forskning, Spania
mottatt: 1 april 2013; Godkjent: 16 mai 2013; Publisert: 18 juni 2013
Copyright: © 2013 Kluk et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av tilskudd fra NIH og leukemi og lymfom Society (JCA) og BWH Avdeling for patologi Robbins Award (MJK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Co-forfatter Jon Aster er konsulent for Cell signale Technologies, skaperen av noen av de antistoffreagenser er beskrevet i denne artikkelen. Alexander Stoeck, Sriram Sathayanrayanan, og Brian Haines er ansatt i Merck Oncology. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Notch reseptorer delta i en fredet signalveien som regulerer mange cellulære fenotyper, inkludert cellen skjebne , celleproliferasjon og celleoverlevelse (for oversikt, se [1]). Pattedyr har fire hakk gener (
NOTCH1 Anmeldelser –
4
), hver med forskjellige mønstre av uttrykk og ulike knockout fenotyper hos mus. Kanonisk signalering gjennom alle fire reseptorer er avhengig av en rekke av ligand-avhengig proteolytiske spaltninger, den siste av disse er utført av et multisubunit protease som kalles gamma-sekretase, som spalter Notch reseptorer i den indre halvdel reseptorens transmembrane domene. Dette frigjør den Notch intracellulære domenet, NICD, som translocates til kjernen og danner en kortvarig transkripsjonen aktivering kompleks.
Utbytte produsert av Notch-signalering i normale celler variere dramatisk med cellulær kontekst, antagelig på grunn epigenetisk mønstring av genomer fører til varierte effekter NiCd på transkripsjons utganger. Genotypiske data fra mennesker og eksperimentelle resultater fra mus tyder på at
NOTCH1
også har ulike roller i kreft, fungerer som enten et onkogen eller en tumor suppressor gen avhengig av mobilnettet sammenheng. Få-av-funksjon mutasjoner av
NOTCH1
er vanlig i T lymfoblastisk leukemi /lymfom (T-LL) [2,3], og har også blitt beskrevet i undergrupper av kronisk lymfatisk leukemi (KLL) [4- 6], mantelcellelymfom (MCL) [7], diffuse store B-celle lymfom [8], perifere T-celle lymfom (PTCL) [9], brystkreft [10], og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) [ ,,,0],11]. Disse aktiverende mutasjoner omfatter ulike punkt erstatninger, slettinger og translokasjoner som produserer ligand-uavhengig NOTCH1 proteolyse og aktivisering, samt mutasjoner som fjerner en C-terminal PEST degron domene og dermed stabiliserer NICD1. I tillegg har data som kommer ut av dyp sekvensering av kreft genomer identifisert hyppig mutasjon av gener som koder for Notch sti komponenter i høy grad på eggstokkene serøs karsinom [12], selv om de funksjonelle konsekvensene av disse mutasjonene på Notch signalering er usikker. Det er også bevis for at NOTCH1 har viktige funksjonelle roller i endotelet og andre stroma-komponenter som kan bidra til den ondartede oppførsel av kreft [13,14]. Omvendt, tap-av-funksjon mutasjoner fordelt over en stor del av
NOTCH1
locus er vanlig i plateepitelkarsinom i huden [15] og hode og nakke [16,17] og også forekomme i en mindre undergruppe av plateepitelkarsinom i lungene [15,18]. Tilsvarende tap av
notch1
funksjon i vaskulærendotelet fører til angiosarkom lignende proliferations i mus [19,20].
Det er interesse i terapeutisk målretting av NOTCH1 i kreft hvor den har en onkogen rolle med antagonister som hemmende antistoffer og gamma-sekretase hemmere (GSI) [21]. Ideelt sett ville slike prøvelser fokusere på behandling av pasienter med tumorer viser tegn til pågående NOTCH1 aktivering. Gitt den store størrelsen på
NOTCH1
locus og mangfoldet av genetiske avvik som produserer ligand-uavhengig aktivering av NOTCH1 eller stabil NICD1, genetisk screening for onkogene
NOTCH1
endringer er utfordrende, spesielt når du arbeider med arkiv FPE prøver. Videre er det mistanke om at ligand-mediert NOTCH1 aktivisering bidrar også til tumorcellevekst og overlevelse, og slike svulster ville gå uoppdaget av genetisk screening.
En ideell biomarkør test ville oppdage NICD1 innen kreftceller direkte, uavhengig av den underliggende mekanisme NOTCH1 aktivering. For å oppnå dette, har vi utviklet en robust, bestemt immunhistokjemiske (IHC) farging metode som påviser NICD1 i arkiv prøver. Testen er basert på en kommersiell kanin monoklonalt antistoff, som tidligere kun brukt i Western blot-analyser, som er spesifikk for en neoepitope i NICD1 laget av gamma-secretase-formidlet proteolyse av NOTCH1, hendelsen som utløser NOTCH1 signalering. Etter optimalisering og validering av testen med kreft xenografter bærende mangfoldig
NOTCH1
avvik og normalt vev, vi skjermet en stor serie av kreft hos mennesker med ukjent
NOTCH1
mutasjonsstatus for aktivert NOTCH1. De fleste T-LLs og CLLs viste tegn til pågående NOTCH1 aktivering, som gjorde mange perifere T-celle lymfomer og en liten undergruppe trippel-negativ brystkreft. Aktivering av NOTCH1 ble også påvist i et flertall av angiosarcomas, i tråd med den observasjon at NICD1 er lett synlig i normale endotelceller i tumor stroma. Derimot, ble lite eller ingen NOTCH1 aktivering observert i mantelcelllymfom diffuse store B-celle lymfom, ikke-småcellet lungekreft, og ovarialcancer. Disse funnene tyder på at NOTCH1 aktivering blant B-celle svulster er både mer kraftig begrenset til og mer utbredt i KLL enn det som ville forutsies fra tidligere genotypiske data, reiser spørsmål om den foreslåtte svulst undertrykkende rolle for NOTCH1 i vaskulære svulster, og foreslår at IHC testing for NICD1 kan brukes til å velge pasienter til kliniske utprøvinger av Notch pathway hemmere, spesielt de som involverer pasienter med svulster som trippel-negativ brystkreft, der NOTCH1 aktivering er begrenset til en liten del av svulster.
Materialer og metoder
bruk av menneskelig vev
menneskelig vev prøver ble godkjent for bruk av Institutional Review Boards som følger. Alle vev involvert med lymfoide neoplasmer (lagre en) ble innhentet og brukt uten henhold Brigham and Women Hospital IRB-protokollen 2010-P002736 informert samtykke. En ikke-småcellet lungekreft microarray ble bygget med vev oppnådd fra pasienter uten samtykke etter Brigham and Women Hospital IRB-protokollen 2006-P001929. En serøs eggstokkreft microarray ble bygget med vev oppnådd fra pasienter uten samtykke etter Brigham and Women Hospital IRB-protokollen 2006-P000321. En angiosarkom microarray ble bygget med vev oppnådd fra pasienter uten informert samtykke under Universitetet i Texas M. D. Anderson Cancer Center IRB-protokollen LAB04-0890. I hvert av disse tilfellene ble studiene innvilget fritak fra samtykke på følgende baser: 1) prøver ble samlet inn retrospektivt fra patologi arkiver og resulterte fra rutine kirurgiske prosedyrer utført for diagnostiske formål; 2) pasientidentiteter ble anonymisert og helt frikoplet fra unike identifikatorer; og 3) var det ingen risiko for deltakerne (bare anonyme vev ble brukt). En T-lymfoblastisk lymfom prøven samlet inn som en del av en prøveversjon av Merck GSI MK-0752 ble brukt med skriftlig informert samtykke fra den berørte pasient under Dana Farber /Partners Cancer Center protokollen 2004-P002170. En brystkreft microarray som inneholder trippel negative tumorer (negative for østrogenreseptoren, progesteron reseptor, og
HER2
forsterkning) ble konstruert med vev oppnådd fra pasienter som gitt skriftlig informert samtykke i henhold til Dana Farber Cancer Institute IRB-protokollen 93-085.
bruk av mus i Xenotransplantat studier
REC-en og kopt-K1 celle subkutane xenograft studiene ble utført under Dana Farber Cancer Institute IACUC protokollen 04-111. HCC1599, HCC1587, og MB-157 celler subkutane xenograft studier ble utført under en protokoll godkjent av IACUC på Merck Oncology. Animal arbeidet ble gjennomført i henhold til NIH retningslinjer. Alle xenograft bærende dyr ble overvåket daglig av veterinær ansatte for unormale atferd /vilkår som kan kreve oppmerksomhet for å minimere lidelse. Dyrene ble avlivet av CO
2 kvelning per anbefalingene fra American Veterinary Medical Association. Alle dyrene ble opprettholdt i CO
2 i minst 5 minutter etter avsluttet respiratoriske bevegelser.
Cellelinjer
Cellelinjer ble hentet fra den amerikanske Tissue Culture Collection (REC-en, Maver-en, HCC1599, HCC1587, og MB-157 celler) eller Leibniz-instituttet DSMZ-tysk Innsamling av mikroorganismer og cellelinjer (kopt-K1).
test utvikling og valideringsstudier
Disse studiene støttet seg på: 1) cellelinjer med mutasjoner i
NOTCH1
som produserer enten gevinst eller tap av NOTCH1 funksjon, som ble dyrket som transplantater i mus ; 2) normalt humant squamous slimhinner og thymus, hvor de anatomiske fordelinger av celler med aktiverte NOTCH1 er kjent; og 3) en primære humane T-ALL av kjent
NOTCH1
genotype (beskrevet nedenfor). Xenopodet cellelinjer og tilhørende
NOTCH1
genotyper er vist i tabell 1. Alle xenopodet tumorer ble fiksert i en fosfat-bufret oppløsning inneholdende 10% formalin eller 4% paraformaldehyd (squamous cellekreft) og innstøpt i parafin, og ble hentet fra vevet arkiver individuelle laboratorier hvor xenograft studier ble gjennomført som en del av andre studier. Bones ble avkalkes etter formalinfiksering ved hjelp RDO Rapid avkalking Solution (Sigma, St. Louis, MO).
Cellelinje
Tumor Type
NOTCH1 Mutasjon
Effekt på NOTCH1 Signa
Reference
kopt-K1T-LLL1600P /del (P) * Gain [3] REC-1MCLdel (ECN1) /del (P) * Gainthis papir /[7] Maver-1MCLNoneN.A. [7] HCC1599Breast Carcinomadel (ECN1) Gain [10] MB-157Breast Carcinomadel (ECN1) GainUnpublished dataHCC1587Breast CarcinomaNoneN.A. [10] Tabell 1. Kreft xenograft og tilhørende gevinst-av-funksjon mutasjoner i NOTCH1. Product: * X /Y indikerer sammenkoblede mutasjoner skapt av avvik i
cis
i samme
NOTCH1
alleledel (ECN1) angir den fore av en delesjon som fjerner den kodende sekvens for det ekstracellulære domene av NOTCH1del (P) indikerer nærværet av rammeskifte eller stoppkodonet mutasjoner som fjerner den C-terminale NOTCH1 PEST degron domainT-LL, T lymfoblastisk leukemi /lymfom; MCL, mantelcellelymfom; N.A., ikke aktuelt CSV ned CSV
Person menneskelige kreftprøver
Alle FPE prøvene ble brukt etter godkjenning av institusjonelle gjennomgang styrene (se etiske utsagn). En primær T-ALL prøven kjent for å bære aktive mutasjoner i
NOTCH1
ble samlet inn som en del av en klinisk studie av gamma-sekretase inhibitor MK-0754 hos pasienter med residiverende /refraktær T-ALL [22]. Arkiv «forkastet» T-LL, CLL, MCL, angiosarkom, og normale vevsprøver ble valgt ut fra de parafininnstøpte vev arkiver Brigham and Women Hospital basert utelukkende på tilgjengeligheten av vev fiksert i 10% formalin eller i B +, en bufret fiksativ som inneholder 3,7% formaldehyd og sinkklorid som er mye brukt for vev involvert ved lymfoide neoplasmer. FPE ikke-småcellet lungekreft [23], diffuse store B-celle lymfom [24], angiosarkom [25], og eggstokkreft [26] prøvene ble undersøkt ved farging tidligere beskrevet microarray. Et nytt vev microarray som inneholder et sett med 78 triple negative brystkreft ble satt sammen som følger. Archival formalinfikserte, parafininnstøpte brystkreft ble samlet og beste blokkene og beste områdene for kjerneboring ble identifisert og valgt ut av en bryst patolog (DD). Resultater av immunhistokjemiske studier for østrogen (ER) og progesteron reseptor (PR) og HER2 og fisk analyseresultatene for HER2 ble hentet fra patologirapporter. Sytti-åtte trippel negative (ER /PR /HER2 negative) invasive brystkrefttilfeller ble identifisert med tilstrekkelig svulstvev for tissue microarray (TMA) konstruksjon, som ble gjennomført i Dana Farber /Harvard Cancer Center Tissue microarray Kjerne Facility. Tre 0,6 mm kjerner ble tatt fra merkede områder og plasseres i en mottaker blokk ved hjelp av en manuell arrayer (Beecher Instruments).
Immunohistochemistry
Standard 4-mikron parafin innebygd vev seksjonene ble farget med Ventana Benchmark XT plattform (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ.) med utvidet varme-indusert epitop gjenfinning (CC1 Buffer). Platene ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med anti-kanin-NICD1 monoklonalt antistoff (klon D3B8, katalog # 4147, Cell Signaling Technology, Beverly, MA; sluttkonsentrasjon, 8.5microgram /ml). Signaler ble så forsterket (Ventana Amplification Kit, # 760-080) og visualisert (Ventana Ultra Universal DAB deteksjon kit, # 760-500) per produsentens instruksjoner. Alle flekker går inkluderte to positive kontrollprøver (REC-en celle xenograft og tonsillar slimhinnen). Skåring ble utført av to patologer (MJK, JCA). Farging resultater ble også gjennomgått med patologer med subspecialty kompetanse i hematopathology (MJK, JCA, GP, DD, EAM, EFM), lunge patologi (LC), gynekologisk patologi (MH), bryst patologi (DD), og patologi bløtvev (JH , AL), som alle bidro også til sak utvalg.
NOTCH1
sekvense
DNA ble fremstilt fra friske frosne prøver å bruke QiaAmp DNA Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). Sanger-sekvensering av
NOTCH1
mutasjons hotspots i et tilfelle av T-lymfoblastisk lymfom ble utført som beskrevet [3]; sekvense spor med analysert med Mutation Surveyor programvare (Softgenetics, State College, PA). Deep sekvensering av
NOTCH1
mutasjons hotspots ble utført som følger. Primere ble utviklet og validert av Fluidigm (Fluidigm Corporation, San Francisco, California) for eksoner 25-28 og 34
NOTCH1
per anbefalte retningslinjer for Roche Titanium sekvensering (Roche, Mannheim, Tyskland). Totalt 2304 amplikonene representerer 48 uavhengige utvalg, forsterket med 48 mål spesifikke primerpar ble generert i hvert sekvense løp. Hver primer inkludert prøvespesifikke Fluidigm 454 strekkode primer og adapter sekvenser. Reaksjoner inneholdt 50 ng genomisk DNA, forover og bakover merket amplifiseirngsprimere (1microM), forover og bakover strekkode primere (400nm), 1x Tilgang Array Laster Reagens, 1x Faststart High Fidelity Reaction Buffer, 4.5mm MgCl
2, 5% DMSO , 0.05U Faststart High Fidelity Enzyme Blend og PCR-grade nucleotide blanding (200microM, Roche). Termisk sykling ble utført på Fluidigm FC1 sykler per produsentens retningslinjer. De resulterende bibliotek ble høstet og oppsamlet på en mikrotiterplate, hvor de ble kvantifisert ved hjelp av Qubit® dsDNA BR analysesett på en Qubit® 2,0 fluorometer (Invitrogen, UK). Biblioteker var normalisert og samles før rensing ved hjelp Agencourt AMPure XP system (Beckman, UK) per produsentens protokoll. Bibliotek komponenter ble clonally forsterket ved hjelp av GS Junior emPCR Lib-A Kit (Roche) ved å legge inn en molekyl bibliotek DNA per innfangingskulen. Pyrosekvensering ble utført ved hjelp av GS Junior system (Roche /454 Life Sciences).
For å selektivt detektere kodon 2514 del (CT) mutasjon i
NOTCH1
, en pyrosekvensering analysen ble utviklet. I korthet
NOTCH1
exon 34 target-sekvensen ble amplifisert i en PCR inneholdende 30ng av genomisk DNA, et biotinylert forover primer (5′-CTCCTCGCCTGTGGACAA) og en revers primer (5′-GGGACGAGCTGGACCACT) ved hjelp av følgende Syklusparametrene: 94 ° C x 2 minutter, etterfulgt 94 ° C x 30 sekunder 62 ° C x 30 sekunder 72 ° C x 30 sekunder i 45 sykluser, etterfulgt av en endelig forlengelse ved 72 ° C i 10 minutter. PCR-amplifisering Produktet ble tatt opp med streptavidin sepharosekuler, denaturerte, overført til en pyrosekvensering plate, hybridisert til en revers-sekvense primer (5 «CACTGGTCAGGGGACT 3»), og sekvensert henhold til en standard protokoll (PyroMark Q96 MD, Qiagen, Germantown, MD) . Avgjørelsen om å bruke en omvendt sekvenseringsprimeren var basert på tilfeldig tilstedeværelse av en kjøring av 3 G-residuer umiddelbart 3 «fra den ΔG antisense-kodonet 2514 mutasjon, som virker til å øke sensitiviteten til analysen omtrent 3 ganger. I tråd med denne forutsigelse, kontrollstudier ved bruk av cellelinjen kopt-K1, en T-LL-cellelinjen med et heterozygot del (CT) kodon 2514-mutasjonen [3], viste pålitelig deteksjon av denne sekvens varianten når fortynnet ned til et nivå av 2,5% muterte alleler med DNA inneholder villtype
NOTCH1
alleler.
molekylær karakterisering av en Intragenic NOTCH1 sletting i REC-1 celler
5 « rask amplifikasjon av cDNA-ender (RACE) ble utført på RNA fremstilt fra REC-1-celler og kontroll DND-41 T-ALL-celler som beskrevet [27]. Genomisk DNA ble isolert fra REC-1-celler ved hjelp av QIAamp genomisk DNA isolasjonskit (Qiagen, Valencia, CA). Exon1 forstand (5′-CCTGCTCTGCCTGGCGCTG) og ekson 28 (5»-CCACGAAGAACAGAAGCACA) antisensprimere ble brukt til å forsterke intragenic Notch1 sletting fra 100 ng av genomisk DNA bruk av Expand Long Template PCR system (Roche, Branford, CT). PCR-forsterknings betingelsene var 94 ° C x 2 minutter, etterfulgt av 94 ° C x 15 sekunder 60 ° C x 30 sekunder og 68 ° C x 45 sekunder i 30 sykluser, etterfulgt av en 68 ° C utvidelse i 7 minutter. Det resulterende PCR-produkt ble renset, klonet inn i pCR2.1-TOPO plasmid (Invitrogen, Carlsbad, California), og Sanger sekvensert.
Western Blot analyse
Hele celle detergentlysater av cellelinjer fremstilt som beskrevet [27] ble farget for NICD1 (katalog # 4147), total NOTCH1 (katalog # 4380), eller actin (katalog # 4970) ved anvendelse av antistoffer oppnådd fra cellesignalisering Technologies (Beverly, MA).
Xenotransplantat studier
REC-1 celler og Maver-1 celler ble inokulert subkutant i 6-ukers gamle SCID /beige mus (Charles River Laboratory, Wilmington, MA) (1×10
7 celler per mus) i 30% Matrigel basalmembran matrix (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Tumorvolumet ble bestemt ved kalibermålinger. Når tumorer nådde et volum på 100-200 mm
3, ble musene behandlet med gamma-sekretase inhibitor diaminobenzidin (DBZ) ved 10microM /kg ved intraperitoneal injeksjon eller med vehikkel (DMSO) i 3 dager. Vevene ble høstet 2 timer etter den siste legemiddeldose. Kopt-K1 celler transduced med et lentivirus som uttrykker ildflue luciferase ble injisert ved halevenen til NOD /SCID /gamma-kjeden (NSG) mus avlet på Lurie Family Imaging Center (Dana Farber Cancer Institute). Musene ble overvåket for utvikling av leukemi ved bioluminescens og deretter behandlet med DBZ eller DMSO som ovenfor. HCC1587 og HCC1599 menneskelige brystkreftcellelinje xenografter ble utviklet i CB17 mus som beskrevet [10], mens MB157 cellelinje xenografter ble utviklet i sveitsisk nu /nu (naken) mus, alle på Merck Oncology. Dyrestudier ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health.
Resultater
Utvikling av en Immunhistokjemisk Stain for Aktivert NOTCH1
Selv om kanonisk Notch signalering er avhengig av kjernefysisk translokasjon av sitt intracellulære domenet (NiCd), påvisning av atom NICD
in situ
i menneskelig vev har vært vanskelig. Polyklonale antistoffer som gjenkjenner den neoepitope opprettet på den amino-terminale ende av NICD1 ved spalting av NOTCH1 ved konservert område innenfor sitt transmembrane domene har blitt mye brukt for å identifisere NICD1 i cellelysater, men har ikke gitt pålitelige tester IHC. Siste utviklingen av en kanin monoklonalt antistoff mot NICD1 neoepitope oppmuntret oss til å se muligheten for å bruke IHC å oppdage NICD1 i FPE vev. For å begrense run-to-run flekker variasjon og for å aktivere mulig klinisk oversettelse, evaluert vi flekker på to mest brukte automatiserte farging plattformer, Ventana Discovery XT og Leica Bond. Både utført på samme måte, men vi bemerket at farging tolkes som spesifikke (som vist nedenfor) dukket sterkere på Ventana plattformen (data ikke vist), som ble brukt for alle de rapporterte her studiene.
Å utvikle en pålitelig fargemetode for NICD1, har vi gjort bruk av kontroll FPE vev fra mus xenopodet med humane tumorcellelinjer som bærer onkogen
NOTCH1
mutasjoner som resulterer i ligand-uavhengig generering av NICD1 (tabell 1). Svulster studert med gain-of-funksjon
NOTCH1
mutasjoner inkluderte en T-LL cellelinje, kopt-K1, som har en aktive punkt substitusjon i NOTCH1 negative regulatoriske region justert i
cis
med et kodon 2514 del (CT) mutasjon som resulterer i sletting av den C-terminale NOTCH1 PEST degron domene [3]; MCL cellelinje REC-1, som bærer en
NOTCH1
allele med en tidligere uncharacterized aktiverende delesjon fjerner det meste av den kodende sekvensen for NOTCH1 ectodomain innrettet i
cis
med en nonsense-mutasjon i kodonet 2428 (beskrevet nedenfor) som også resulterer i sletting av den C-terminale PEST degron domene; og to brystcancercellelinjer, HCC1599 og MB-157, som bærer
NOTCH1
alleler med delesjoner som fjerner det meste av NOTCH1 ectodomain kodende sekvenser ([10], og data ikke vist). Formalin FPE deler av alle fire xenografter bærende aktivere
NOTCH1
mutasjoner viste sterk diffuse atom reaktivitet når farget med NICD1 spesifikke antistoff (Figur 1A-D). Spesielt, NICD1 farging i kopt-K1 og REC-1-xenografter ble merkbart redusert ved behandling av dyr med GSI DBZ (figur 1E, F), som blokkerer genereringen av NICD1 ([3]). I tillegg ble ingen NICD1 farging sett i seksjoner av MCL cellelinje Maver-1 (figur 1G), som har villtype
NOTCH1
alleler og er blottet for NICD1 [7], eller i brystkreftcelle linjen HCC1587 (figur 1 H), som har villtype
NOTCH1
alleler og stedet har en aktive sletting involverer
NOTCH2 product: [10].
Seksjoner ble farget for NICD1 ved hjelp av en IHC metode som gir en brun atom flekken og kontra med hematoksylin. A) kopt-K1 T-ALL-celler. B) REC-en mantelen celle lymfom celler. C) HCC1599 bryst carcinoma celler. D) MB-157 brystkreft celler. E, F) kopt-K1 og REC-1 cellefarging, henholdsvis i vev høstet fra dyr behandlet med GSI DBZ. G) Maver-en mantelcellelymfom celler. H) HCC1587 brystkreftceller. Genotyper av disse cellelinjene er gitt i Tabell 1.
For ytterligere sensitivitetsberegninger for metoden og stabiliteten i NICD1 neoepitope i arkiv vev, utførte vi IHC for NICD1 på snitt preparert fra en T -ll prøven innhentet i 2004 fra en pasient innrullert i en prøveversjon av Merck GSI MK-0754 [22]. Sanger-sekvensering av DNA isolert fra denne prøven viste en heterozygot punktmutasjon som resulterer i en substitusjons L1574P, samt to ytterligere subclonal punktmutasjoner på linje i
cis
med L1574P substitusjon som skaper L1600P og F1592S substitusjoner (figur 2A ). Alle disse mutasjonene falle i exon 26 av
NOTCH1
og samsvarer med tidligere karakteriserte gain-of-funksjon mutasjoner i NOTCH1 negative regulatoriske område [28], til et parti av NOTCH1 ectodomain som må være intakt holde -reseptoren i off-tilstand i fravær av ligand [29]. Tandem mutasjoner innrettet i
cis
i NOTCH1 ectodomain har vært rapportert tidligere [3], og er trolig en manifestasjon av fort utvalg for økt NOTCH1 signale under T-ALL progresjon. IHC-farging av denne T-ALL produsert sterk diffus atom positivitet, noe som tyder på at den NICD1 epitopen detektert av kanin-monoklonalt antistoff er stabil i en periode på flere år i rutinemessig lagrede FPE prøver (figur 2B).
A) Identifisering av aktive mutasjoner som involverer ekson 26 av
NOTCH1
. Av 24 individuelle klonede PCR-produkter, 13 ga villtype sekvenser, 9 viste en mutasjon produsere en L til P substitusjon i rest 1574, en viste L1574P mutasjon i
cis
med en mutasjon produsere en F til S substitusjon i rest 1592, og en viste L1574P mutasjon i
cis
med en variant som produserer en L til P substitusjon i rest 1600. B) IHC farging for NICD1 i samme svulst, en formalinfiksert parafin-embedded biopsi av en mediastinale masse. Det er forelsket gjenstand, men sterke kjernefarging sett i intakte celler.
Vi har også bemerket i deler av xenopodet svulster som murine endotelceller og spredte stromale celler viste atom reaktivitet med NICD1 antistoff (best sett på figur 1G og H). Disse observasjonene er i tråd med data indikerer roller for notch1 i vaskulærendotelet [30] og perifere T-celler [31], og foreslo at våre IHC metoden kan påvise fysiologiske nivåer av NICD1. For å vurdere dette, farget vi normale deler av menneskelig plateepitel slimhinner, hud, og thymus (figur 3). Tidligere arbeid har vist at notch1 er forbigående aktiveres i suprabasilar celler i skjellepitel [32], i hvilket fremmer cellesyklus utgang og differensiering [33], en aktivitet som kan bidra til NOTCH1 største tumorundertrykkende roller i squamous celle-karsinomer i huden og hode og nakke. Som ventet ble NICD1 flekker i skjellepitel begrenset til suprabasilar celler (figur 3A, B). I thymocytter, stiger notch1 aktivering til et maksimum i CD4 /CD8 dobbelt-negative celler som gjennomgår beta-utvalg [34], som er plassert inne i thymisk cortex like dypt ned til thymisk kapselen [35]. I tidligere arbeid, bemerket vi at cellene i denne regionen av thymus har det høyeste nivået av immunoreaktivitet overfor antistoffer som gjenkjenner total notch1, uten hensyn til dens aktiveringsstatusen [36]. Som forutsagt fra den rapporterte mønster av NOTCH1 aktivering i tymocytter, NICD1 farging i human thymus var mest fremtredende i kortikale thymocytter som ligger umiddelbart under kapselen (figur 3C, D). Disse resultater viser at vår IHC metoden er følsom nok til å detektere fysiologiske nivåer av aktivert NOTCH1 i det minste noen normale vev. For ytterligere å utforske NOTCH1 aktivering i normale lymfoide vev, farging av mandel ble også utført. Vi merket oss at germinalsentre som inneholder reaktive B-celler var blottet for immunoreaktivitets, mens omkringliggende mantelen soner viste svak farging for NICD1 (data ikke vist).
A) Orofaryngeal squamous mucosa. B) Skin. C, D) Thymus.
Påvisning av NOTCH1 Activation i Archival Cancer Prøver
Ved å bygge på disse valideringsstudier, vi neste brukte IHC å screene en serie FPE kreft hos mennesker for bevis for NOTCH1 aktivisering, med fokus på krefttyper som
NOTCH1
gain-of-funksjon mutasjoner er beskrevet. Vi har også studert angiosarkom, basert på observasjon at normale endotelceller ofte farget positivt for NICD1 og tidligere studier som tyder på at
notch1
har en svulst undertrykkende funksjon i murine vaskulærendotelet [19,20]; dermed var vi nysgjerrige på å se om NOTCH1 aktivering kan ha gått tapt i menneskelige angiosarcomas. Vi brukte NICD1 farging av normale endotelceller som en intern kontroll for å bedømme bevaring av immunreaktiviteten i vev som ble studert. I utforskende studier, bemerket vi at arkiv prøver løst i Zenker løsning, et kvikksølv fiksativ brukt ved vår institusjon å avkalke benmarg biopsi, opphevet NICD1 immunoreaktivitets i endotelet. Tap av immunoreaktivitets var ikke forårsaket av avkalking
per se
, siden benmarg involvert ved xenopodet kopt-K1 celler som ble løst i formalin og deretter raskt decalcified med en sterk syre beholdt immunoreaktivitets (figur 1A). På grunn av denne begrensning, vi begrenset våre studier for å tumorer som involverer mykt vev hvor det FPE prøvene var tilgjengelige. Noen lymfeknuter involvert ved KLL Prøvene ble løst i B +, et bindemiddel som inneholder formaldehyd og sinkklorid. Prøver som er løst i B + beholdt NICD1 farging i normale endotelceller og således ble inkludert i analysen.
