Abstract
Økt oksidativt stress i henhold til hyperglykemiske tilstander, gjennom samspillet av aldre med RAGE reseptorer og via aktivering av interleukin mediert transkripsjon signalering, har blitt rapportert i kreft. Proteiner modifikasjoner blir undersøkt for sin rolle i utvikling og progresjon av kreft og autoantistoffrespons mot dem er økende interesse som en probe for tidlig påvisning av sykdommen. Denne studien har analysert endringer i histone H1 ved modifikasjon av Methylglyoxal (MG) og dets implikasjoner i auto-immunpatogenese av kreft. Modifisert histone viste endringer i de aromatiske rester, endret tyrosin mikromiljø, inter kryss linking og generering av aldre. Det viste maskering av hydrofobe patcher og en hypsochromic skifte i i ANS spesifikk fluorescens. MG aggressivt oksydert histon H1 som fører til opphopning av reaktive karbonyler. Fjerne UV CD Målingene viste di-karbonyl-induserte forsterkning av alfa struktur og induksjon av beta-plate-konformasjon; og termisk denaturering (TM) studiene bekrefter den termiske stabilitet av den modifiserte histon. FTIR-analyse viste amid I bånd skift, generering av en karboksyetyl gruppe og N-Cα vibrasjoner i den endrede histon. LCMS analyse bekrefter dannelse av Nε- (karboksyetyl) lysin og elektron mikroskopiske undersøkelser viste det amorfe aggregatdannelse. Den modifiserte histone viste endrede samarbeids binding med DNA. Modifisert H1 induserte høye titre antistoffer i kaniner og IgG isolert form sera kaniner immunisert med modifisert H1 utstilt spesifikk binding med sin immunogen i Western Blot analyse. IgG isolert fra sera fra pasienter med lungekreft, prostatakreft, brystkreft og kreft i hode og halsområdet viste bedre anerkjennelse for neoepitoper på den modifiserte histon, reflekterer tilstedeværelse av sirkulerende autoantistoffer i kreft. Siden rapporter tyder på en sammenheng mellom AGE-rage aksen og kreftutvikling, glycoxidation av histon H1 og dens immunogenisitet baner måter for å forstå rollen glycoxidatively ødelagte atom proteiner i kreft
Citation. Mir AR, Uddin M, Khan F, Alam K, Ali A (2015) dikarbonyl indusert Strukturelle forstyrrelser Gjør Histone H1 svært immunogen og generere en Auto-immunrespons i Cancer. PLoS ONE 10 (8): e0136197. doi: 10,1371 /journal.pone.0136197
Redaktør: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Science Center, KINA
mottatt: 18 april 2015; Godkjent: 31 juli 2015; Publisert: 28 august 2015
Copyright: © 2015 Mir et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en av de dødeligste sykdommer som er ansvarlig for et stort antall dødsfall over hele verden og dens tidlig deteksjon opptar sentrum scene i å redusere sin samlede offentlige innvirkning [1-2]. I denne forbindelse, identifikasjon og vurdering av autoantistoffer til modifiserte proteiner i kreftpasienter har fremtredende i utvikling av biomarkører for tidlig påvisning av sykdommen. Ulike posttranslasjonelle protein modifikasjoner (PTMs) som oppstår under utviklingen av kreft antas å være av betydning for deres diagnostisk betydning [3-4].
Detaljer om PTMs, som dannelsen av avanserte glykerte endeprodukter (alder ) med rolle i utvikling og progresjon av kreft er også fremstår [5]. Det har blitt rapportert at cancerscreate et gunstig miljø for produksjon av AGE på grunn av deres høyere opptak av glukose til å oppfylle deres energibehov [6-8]. Glycation produkter som dannes har potensial til å binde makrofager gjennom makrofag-scavenger reseptor og, i raser og således bidra i kreftutvikling gjennom deres pro-inflammatoriske egenskapene og ved å utnytte kravet til aktivering av interleukin 6 (IL-6) -mediert mitokondrielle signal transdusere og aktivatorer av transkripsjon 3 (STAT3) [9-11]. Epidemiologiske bevis på molekylært heterogenitet av kreft avsløre gentoksiske effekter av akutt karbonyl stress, noe som gjør diabetespasienter utsatt for ulike former for kreft [12]. AGEs indusert gentoksisitet i tubulære celler med mulige implikasjoner i økt kreftutvikling i avanserte nyresykdommer peker også mot det samme korrelasjonen [13].
Påvisning av autoantistoffer som genereres mot abnorme bearbeidede proteiner i kreft som er immunogen og stimulerer celle og humoral immunrespons, har ført til en rekke forskere rettet mot påvisning av kreft autoantigenene på mønsteret av reumatoid artritt, karakterisert ved at anti-IgG-antistoffer er blitt rapportert som en diagnostisk biomarkør [14]. Blant de proteiner, post-translasjonelle modifiseringer av histoner, spesielt ha en viktig rolle i genekspresjon og følgelig i kreftutvikling og progresjon, og deres modifikasjoner er også blitt undersøkt som potensielle biomarkører for sykdomsprogresjon og prognose [15-16].
Videre, blant de glycating midler Methylglyoxal (MG), en dikarbonylforbindelse generert ved hjelp av forskjellige metabolske veier er blitt identifisert som et viktig forløper i modifisering av forskjellige proteiner, med 50000 ganger morereactivity enn den for glukose, med både intracellulære og ekstracellulære proteiner, ved fysiologisk konsentrasjon [17], så vel som ved høyere konsentrasjoner [18] og har vært forbundet med en rolle i et mangfold av sykdommer [9, 19]. Methylglyoxal mediert forstyrrelser kan forårsake strukturelle og funksjonelle endringer i atom protein histon H1 med mulige implikasjoner i immunbiologi av ulike typer kreft.
I denne studien ble histon H1 inkubert med økende konsentrasjoner av Methylglyoxal å generere aldre. MG induserte strukturelle endringer i histon H1 ble analysert ved hjelp av UV-fluorescens og CD-spektroskopi, poly- akrylamid gelelektroforese, Fourier transform infrarød spektroskopisk analyse (FTIR), karbonyl-innhold bestemmelse, overflate Hydrofobitet (H
0) estimering, Væskekromatografi masse spektroskopi (m /z analyse), scanning elektronmikroskopi, og ved å studere de endrede interaksjoner i binding med DNA. Den mulige immunogenisitet av innfødte og de modifiserte histoner ble konstatert i kaniner. Sirkulasjonsautoantistoffer tilstede hos pasienter withvarious typer kreft ble vurdert for deres binding til innfødte og MG endret histon H1 gjennom direkte bindende og kompetitiv hemming studier i ELISA og ved gelretardasjon analysen.
Materialer og Metoder
Histone H1, 2,4-dinitrofenyl-hydrazin (DNPH), 1-anilinonaphthalene-8-sulfonsyre (ANS), natriumdodecylsulfat (SDS), Methylglyoxal, aminoguanidin-hydroklorid, dietylentriamin penta-eddiksyre (DTPA), natrium azid, etidiumbromid, protein A-agarose (2,5 ml pre-pakket kolonne), agarose, natriumazid, Tween-20, dialyseslanger, anti-human og anti-kanin IgG alkalisk fosfatasekonjugat, para-nitrofenylfosfat, Freunds komplette og ufullstendige adjuvans ble kjøpt fra Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA. Akrylamid, bisakrylamid, ammoniumpersulfat (APS) og N, N, N «, N»-tetrametyletylendiamin (TEMED) var fra Bio-Rad Laboratories, USA natriumhydroksid, Etylendiamintetraeddiksyre (dinatriumsalt), metanol, iseddik, iso- propanol, ble natriumklorid, natriumkarbonat, natriumnitritt, sølvnitrat, xylen, natriumhydroksyd, formaldehyd, natriumbikarbonat, etanol, ammoniumsulfat og ammoniumpersulfat oppnådd fra Qualigens, India. Polystyren mikrotiter flat bunn ELISA-plater og moduler ble kjøpt fra NUNC, Danmark. Alle andre kjemikalier /reagenser var av høyeste analytisk kvalitet tilgjengelig.
Fastsettelse av proteinkonsentrasjonen av histon H1
Molar ekstinksjonskoeffisient av kalv thymus histon H1 (1280 M
-1cm
-1) ble anvendt for å bestemme konsentrasjonen av protein ved å måle absorbansen av proteinoppløsninger ved 280 nm. Kalv thymus histon H1 molekylvekt brukes til beregninger var 21 500 Dalton.
Endring av H1 histone av Methylglyoxal
Prosedyren gitt av Roberts
et al
. [20] ble fulgt. Histon H1 modifikasjon ble utført i fosfatbuffer-saltvann (10 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4 inneholdende 150 mM NaCl). Histon H1 (42 uM) prøver ble modifisert ved inkubasjon med varierende konsentrasjoner av Methylglyoxal (2,5, 5, 7,5 og 10 mM) i 24 timer ved 37 ° C. Alle prøvene ble ekstensivt dialysert etter inkubasjon.
Absorbance spek
Absorpsjonen profilen av innfødte og Methylglyoxal-modifisert H1 histoner ble spilt inn på Shimadzu spektrofotometer (UV 1700 modell) i bølgelengdeområdet 250 -500 nm ved anvendelse av kvartskuvette av 1 cm veilengde ved konstant temperatur.
Fluorescens studier
Fluorescens-spektrene ble tatt opp på et Shimadzu (RF-5301-PC) spectrofluorophotometer ved 25 ± 0,1 ° C i en 1 cm banelengde celle på 3 nm spaltebredde.
Vi målte iboende fluorescens av spennende proteinprøvene på 275 nm og registrering av emisjonsspekter i 300-400 nm rekkevidde.
Tap fluorescensintensiteten (FI) ble beregnet ved anvendelse av følgende ligning:
natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese
Methylglyoxal-medierte endringer i histon H1 ble analysert ved hjelp av ikke denatureringsmiddel ikke-reduserende vertikal natriumdodecylsulfat -polyacrylamidgel elektroforese (PAGE) som beskrevet av
Laemilli
, med små modifikasjoner [21]. 25 ug av naturlige og modifiserte histon prøver ble blandet med en fjerdedel volum av prøvebuffer (50% glycerol og 0,002% bromfenolblått i 1 M tris-HCl, pH 6,8) og tilført til brønnene på 10% SDS-polyakrylamidgel. Gelen ble kjørt ved 80 volt i 4 timer ved romtemperatur og deretter farget med sølvnitrat, og fotografert ved Molecular Imager Gel Doc XR system.
Videre studier ble utført på histon H1 modifisert med 7,5 mM Methylglyoxal med innfødt histon H1 fungerer som kontroll
AGE analysen
AGE-spesifikk fluorescens ble målt ved 440 nm etter eksitasjon ved 370 nm og økningen i fluorescens intensitet (FI) ble beregnet ved hjelp av følgende ligning.:
Fastsettelse av Surface hydrofobitet (H
0)
overflaten hydrofobisitet ble bestemt med fluorescerende probe 1-anilinonapthalene- 8-sulfonsyre (ANS) ved fluorescens spektroskopi som per en etablert protokollen [22]. Det molare forhold mellom H1 histon og ANS ble tatt som 01:10 og emisjonsspektrene ble tatt mellom 400-600 nm. Prosentvis endring i fluorescens-intensitet (FI) ble beregnet ved den følgende ligning:
Bestemmelse av reaktiv karbonyl-innhold
kritisk vurdering av protein karbonyl-innhold tjener som biomarkører protein oksidativ skade. Vi analyserte karbonyl innhold av innfødte og Methylglyoxal endret histon H1 (MG-H1) som per den publiserte protokoll med små modifikasjoner [23]. Native og Methylglyoxal (7,5 mm) modifisert histon H1 prøver ble tilsatt med like mengder 10 mM DNPH i 2,5 M HCl. Prøvene ble virvlet med jevne mellomrom og inkubert i mørke i 15 minutter ved romtemperatur. Disse ble inkubert med 10% TCA i 15 minutter ved -20 ° C og sentrifugert ved 4 ° C i 15 minutter ved 9000 g. Proteinpelletene ble vasket tre ganger med iskald etanol /etylacetat (1: 1) etter kassering av supernatanten og sentrifugert i 2 min ved 9000 g mellom alle vaskinger. Etter den siste vask, ble pelleten suspendert i 1 ml av 6 M guanidin-HCl og blandes på riktig måte. Proteinprøver ble deretter fullstendig oppløst ved å la ved 37 ° C i 15-30 min. Når proteinpelletene ble fullstendig oppløst, ble konsentrasjonen av DNPH bestemt ved absorbans måling ved 360 nm mot guanidinhydroklorid (som blank) ved hjelp av den molare ekstinksjonskoeffisient på 22 000 M
-1cm
-1. Absorbansen av prøvene ble tatt ved 276 nm og protein karbonyl-innhold ble uttrykt som nmol mg
-1 protein.
sirkulærdikroisme Bestemmelse
sirkulærdikroisme evaluerer endringer i protein sekundær struktur, bretting og deres bindende egenskaper. Vi gjennomførte Far-UV CD spektralanalyse av innfødte histon H1 og dens MG endret motstykke ved hjelp av J-815 JASCO spectropolarimeter. Instrumentet var festet til en mikrodatamaskin med et termostatstyrt kyvetteholder festet til Neslab s RTE 110 vannbad med en temperatur nøyaktighet på ± 0,1 ° C. Skanninger ble tatt ved intervaller på en bølgelengde nm ved 25 ° C. Alle skanninger ble registrert på bølgelengde intervaller på 1 nm. Spectra var samlet på 50 nm min
-1 skanning hastigheter, 0,1 nm data banen og en responstid på 2s. Spektrene ble registrert i langt UV-område mellom bølgelengdene 190 og 250 nm og proteinkonsentrasjonen var 0,2 mg /ml. Resultatene ble oppnådd i molar elliptisitet rest (θ) (° C /cm
2 /dmol) ved en bølgelengde λ, basert på ligningen gitt nedenfor [24] .Hvor θ
OBS er den observerte elliptisitet i grader
C
p er den molare fraksjon og
l
er lengden av lysbanen i cm. Den α-heliks innhold av ulike histon H1 prøvene ble beregnet ut fra q-verdier på 222 nm (MRE
222) med følgende ligning.
Thermal Denaturering Studies (Tm) av Far-UV CD
termostabilitet av den sekundære struktur av histon H1 og dens mg tabletter med modifisert form ble analysert ved hjelp av langbølget UV-CD-spektroskopi ved 222 nm fra 20 ° C til 90 ° C ved anvendelse av en temperatur helning på 1 ° C /min.
Fourier Transform Infrared spektroskopi-dempes total refleksjon (FTIR-ATR)
Fourier transform infrarød (FTIR) spektroskopi ble utført for å analysere den sekundære strukturen av histon H1 og MG endret histon hjelp Perkin Elmer FT-IR spektrofotometer. Infrarøde spektrale målingene ble registrert mellom 1000 cm
-1 til 4000 cm
1. FTIR-studier ble utført ved 10 mg /ml proteinkonsentrasjon.
Væskekromatografi massespektroskopi (m /z analyse)
HPLC-systemet ble forbundet til en time-of-flight massespektrometer (LCMS-IT-TOF, Shimadzu) er utstyrt med et elektrospray grensesnitt drives i en positiv ion-modus med spenning innstilt på 4,5 kV. Temperaturen av turbo ion gassen var 250 ° C. Fullstendig skanning MS-analyse ble utført i området fra 0-240 m /z-forhold. MS resultatene oppnådd for histonproteinene ble sammenlignet med CEL standard [25].
Scanning elektronmikroskopi (SEM) studier
Mikro-arkitektoniske detaljer om innfødte og MG modifiserte histoner ble observert ved hjelp av scanning elektron. Air tørkede prøver ble adsorbert cellulose ultrafiltreringsmembran. Prøvene ble belagt med gull og montert på et karbonbånd belagt rustfrie stålnett opererer på en akselererende spenning på 15 kV og i svakt vakuum tilstand. Bildene ble tatt med et JSM-6510LV (JEOL JAPAN) scanning elektronmikroskop kjører [26]
Endringer i interaksjon med DNA. Sirkulærdikroismeanalyse (CD) analyse
Samspill mellom innfødte og MG modifisert histon H1 med DNA ble analysert ved hjelp av CD-spektroskopi. 50 ug /ml DNA ble inkubert i 1 time med 0,2 mg /ml av nativt H1 og H1 MG modifisert henholdsvis i 0,05 M tris-buffer, pH 7,4. Prøvene ble underkastet sentrifugering ved 14 000 rpm i 8 minutter, og CD-spektra ble registrert for supernatanten. Native DNA av samme konsentrasjon ble tatt som kontroll. For å unngå forstyrrelser fra protein, ble alle målingene tatt på lengre bølgelengder mellom 220 cm
-1 til 330 cm
1.
Immunologiske studier og Western blotting
Tilfeldig avlet kvinnelige New Zealand hvite kaniner som veier 1-1,5 kg ble valgt for immunizationas per den etablerte protokollen av vårt laboratorium [27]. Serum immunoglobulin G (IgG) fra de eksperimentelle dyrene ble isolert ved affinitetskromatografi på protein A-agarose-kolonne [28] og Western blotting ble utført i henhold til protokollen som er gitt i den tekniske heftet til ECL Plus Western blotting system (Amersham, UK) i etablere spesifisiteten av antistoffer dannet mot innfødte og modifiserte histoner H1 i kaninene [29].
Innsamling av blodprøver til kliniske studier
for å undersøke tilstedeværelse av autoantistoffer mot mors og MG endret histon H1, ble sera hentet fra kreftpasienter (n = 83) av ulike aldersgrupper som deltar på JN Medical College Hospital, Aligarh, India, etter informert samtykke. Prøvene ble oppnådd etter grundig klinisk undersøkelse av pasienter med påvist histopatologisk diagnose. Populasjonen inkluderte lungekreftpasienter (n = 27), prostata (n = 19), bryst (n = 22) og pasienter med kreft i hode- og nakkeregionen (n = 15) .Det var 49 kvinner med en gjennomsnittsalder på 38,5 ± 22,9 år og 34 menn i 36 ± 18,3 år gjennomsnittsalder. Alderen på alle pasientene falt mellom 15 til 63 år. Prøver fra friske individer (n = 40, 20 hanner og amp; 20 kvinner med en gjennomsnittsalder på 36 ± 18,6 år) fungerte som kontroll. Serumprøvene ble oppvarmet ved 56 ° C i 30 min for å inaktivere komplement-proteiner og lagret ved -20 ° C med 0,2% natriumazid. Serum antistoff binding ble evaluert av ELISA.
Etikk erklæringen
Denne studien ble behørig godkjent av Institutional Etisk Komité (1617 /FM /22-01-2013) og Animal Etisk Komité (8289 /Oah /21-02-2013), behørig registrert under komité for hensikten med kontroll og tilsyn med dyreforsøk (CPCSEA) India (Registrering nr. 401 /RO /C /2001 /CPCSEA), IDen JN Medical College, fakultet medisin, AMU.
Blodprøver prøver~~POS=HEADCOMP ble samlet inn fra pasienter og friske personer etter informert muntlig samtykke. Modusen av samtykke ble behørig godkjent av etisk komité. En skikkelig registrering av alle pasienter og friske personer har blitt opprettholdt.
Isolering av IgG ved affinitetskromatografi
Serum immunglobulin G (IgG) ble isolert ved affinitetskromatografi på protein A-agarose kolonne [ ,,,0],28]. Serum (0,5 ml) ble fortynnet med like stort volum av PBS (pH 7,4) ble påført på toppen av kolonne pre-ekvilibrert med samme buffer. Vaskingen ble resirkulert gjennom 2-3 ganger og ubundet materiale ble fjernet ved omfattende vasking med PBS. Det bundne IgG ble eluert med 0,58% eddiksyre i 0,85% natriumklorid, og samles opp i et rør inneholdende 1,0 ml av 1,0 M Tris-HCl (pH 8,5). 3 ml fraksjoner ble samlet og avlest ved 280 nm. IgG-konsentrasjonen ble bestemt med tanke på 1,4 OD280 = 1,0 mg IgG /ml. Det isolerte IgG ble dialysert mot PBS og lagret ved -20 ° C med 0,1% natriumazid.
Direkte-bindende ELISA-
ELISA ble utført på flatbunnede polystyrenblokken plater som tidligere beskrevet [27] . Polystyrenblokken PolySorp mikrotiterbrønner ble henholdsvis belagt med 100 ul av naturlige eller Methylglyoxal modifiserte proteiner (10 ug /ml). Absorbans (A) av hver brønn ble målt ved 410 nm med en automatisk mikroplateleser. Hver prøve ble kjørt i duplikat, og resultatene ble uttrykt som gjennomsnittet av to målinger.
Konkurranse-ELISA
Den antigene spesifisitet av antistoffene ble bestemt ved konkurranse ELISA [27] .Varying mengder av inhibitorer (0-20 ug /ml) ble blandet med en konstant mengde av affinitetsrenset IgG, og blandingen ble inkubert ved romtemperatur i 2 timer og over natten ved 4 ° C. Den således dannede immunkompleks ble belagt i brønnene i stedet for IgG. De resterende trinnene var samme som i direkte bindende ELISA. Prosent hemming ble beregnet ved hjelp av formelen:
Band skift analysen
For den visuelle påvisning av antigen-antistoff-binding og immunkompleksdannelse, gelretardasjon Analysen ble utført [30]. Immunkompleksene ble fremstilt ved inkubering av konstant mengde innfødte og MG-modifiserte histoner med varierende mengder av affinitetsrenset immun IgG fra sera fra cancerpasienter i TBS i 2 timer ved 37 ° C og over natten ved 4 ° C. En fjerdedel av prøven fargestoff ble tilsatt til blandingen og underkastet elektroforese på 10% SDS-PAGE i 4 timer ved 80 V. Gelene ble visualisert ved anvendelse av sølvnitratfarging [21].
Statistisk analyse av resultater
Alle målinger ble gjort i duplikater. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. En to tailed
p
verdi lavere enn 0,05 ble tatt for å være betydelig.
Resultater
Absorbance spek
UV absorpsjon spekteret av innfødte histon H1 viste en karakteristisk topp for proteiner på 277 nm. Den histon H1 modifisert med 2,5, 5, 7,5 og 10 mM Methylglyoxal utviste 67,87%, 90,16%, 94,54% og 96,64% hyperchromicities i de spektrale topper hhv. En hump som topp ble fremtredende ved 340 nm i de modifiserte proteiner ved høyere konsentrasjoner av MG. Resultatene er vist i figur 1.
Intrinsic Fluorescence
fluorescens maksima for native histon H1 ble oppnådd ved 305 nm-et karakteristisk trekk ved tyrosin utslipp. Den inkubasjon av histon H1 med økende konsentrasjoner av Methylglyoxal ført til en betydelig reduksjon i fluorescens intensitet. 2,5, 5, 7,5 og 10 mM Methylglyoxal modifisert H1 histon oppviste en reduksjon på 31,31%, 49,68%, 81,78% og 95,31% i indre fluorescens intensitet sammenlignet med nativ H1 histon. Den økende konsentrasjon av Methylglyoxal i proteinprøvene førte til en rød forskyvning av 3, 6, 8 og 10 nm emisjonsbølgelengde. Videre ble det observert ekstra hump som topper i den modifiserte protein på 440 nm. Resultatene er vist i figur 2.
Elektro Analyse
HOVED Resultatene viste en økt elektromobilitet i de modifiserte proteinprøvene i forhold til den opprinnelige histone. De modifiserte proteiner presenterte en økt bandet strekker seg så mot de innfødte histone. En ekstra bånd også dukket opp i de modifiserte proteiner ved en molekylvekt som er høyere enn den for naturlig histon H1. Resultatene er presentert i figur 3.
PAGE-analyse av native og MG modifisert histon H1: 25 ug av hver av nativt histon H1 og 2,5, 5, 7,5 og 10 mM Methylglyoxal modifisert motstykker lastet inn i brønnene i 10 % polyakrylamid gel under ikke denaturerende betingelser (kolonne 1-5), spor 6 viser molekylvekt markør.
AGE analysen
Under identiske forhold, innfødt histon H1 ga ingen merkbar AGE fluorescens. De observerte fluorescensstyrkene for innfødte og modifisert histon H1 var 7,886 ved 430 nm og 39,21 på 446 nm hhv. MG-H1 viste 79,88% økning i AGE fluorescens intensitet. Resultatene er vist i figur 4.
Overflate hydrofobisitet (H
0)
En betydelig reduksjon i den ANS fluorescensintensiteten i MG modifisert H1 i forhold til opprinnelig var histon observert. Native og MG modifisert H1 viste fluorescensstyrkene 26,12 ved 279 nm og 5,21 ved 276 nm, som tilsvarer en reduksjon i ANS fluorescens-intensitet med 79,97% i tilfelle av den modifiserte histon. Et blått skift av 3 nm ble også sett i tilfelle av modifisert protein. Resultatene er vist i figur 5.
Reaktivt karbonyl-innhold
spektrofotometrisk kvantifisering av reaktive proteinbundne karbonyler etter reaksjon med 2,4-dinitrofenylhydrazin (DNPH) viste absorbansverdier av 0,055 og 0,624 for innfødte og modifisert histon H1 henholdsvis 370 nm. Den karbonyl-innhold var 2,47 nmol /mg av protein i native histon H1 og 28,36 nmol /mg av protein i tilfelle av Methylglyoxal modifisert histon H1 viser en 11.48 ganger økning i reaktive karbonyler. Resultatene er vist i figur 6.
sirkulærdikroismeanalyse spektra
CD spektralanalyse viste synlig forskjell i mold elliptisitet av innfødte og modifisert histon på tre bølgelengder nemlig., 190 nm, 201 nm og 222 nm. Det ble observert en økning i positiv elliptisitet ved 190 nm, en nedgang i negativ elliptisitet ved 200 nm og en økning i den negative elliptisitet ved 222 nm. Den observerte ellipticity ved 190 nm for native histon og Methylglyoxal endret H1 var henholdsvis 0.909 mdeg og 1,249 mdeg. Den negative ellipticity ble oppnådd ved 200 nm og 222 nm. 200 nm CD (θ) verdier for innfødte histon og Methylglyoxal endret H1 var – 33,615 mdeg og – 33,132 mdeg og 222 nm var verdiene henholdsvis -8,39 og -10,2. Resultatene er vist i figur 7.
Thermal Denaturering Studies (Tm) av Far-UV CD
Endringene i de sekundære strukturelle egenskaper som oppnås gjennom smeltetemperatur studier ved å følge utfoldelsen mønstre av proteinene gjennom tap i elliptisitet ved 222 nm, viste tidlig helix åpning i det native histon sammenlignet med den modifiserte MG histon. Midtpunktet smeltetemperaturen (Tm) av innfødte og MG endret histon H1 kom ut til å være henholdsvis 53 ° C og 64 ° C. Resultatene er gitt i figur 8.
FTIR-ATR-spektroskopisk analyse
FTIR resultatene av opprinnelig histon H1 viste vibrasjonsstrekking av C = O, en karakteristisk amid I-bånd ved 1635 cm
1. Men etter modifisering, amid jeg bandet fikk forskjøvet til 1640 cm
1. Selv om det dukket opp noen dype bånd i amid II-regionen, men forskjellen prosent transmisjon i denne regionen var synlig. Vi registrerte mindre transmisjon for native histone i forhold til sin modifisert form. Videre observerte vi en ytterligere gruppe i det modifiserte protein som viste en strekk-bånd ved 1731 cm
-1. Dette strekker ble ikke observert i den opprinnelige form. Den modifiserte histon oppviste også et ytterligere bånd ved 1066 cm
-1, som var fraværende i det native form i denne regionen. Store band ble observert i regionen med bølgetall mellom 3000 cm
-1 til 3500 cm
1. Denne regionen var bredere for modifiserte histoner enn for de innfødte protein. Resultatene er vist i figur 9.
Væske-kromatografi-massespektrometri
Massespektra av standard CEL ble tatt for å undersøke tilstedeværelsen av CEL og dens kollisjon-indusert spaltes danner i det native og modifisert histoner. Den basistopp og to produkt-ion massespektra av standard CEL ble observert ved m /z 219.0145 verdier, 84,1024 og 130,1032 henholdsvis (figur 10A). Ingen av disse topper som observeres i standard CEL ble funnet i tilfellet av nativt histon H1 (figur 10B); den modifiserte histon H1 ga den mest fremtredende ion produktet på m /z av 84,1086. De mindre intense topper ble observert ved m /z for 130.1208 og 219.1432 (Fig 10C).
Scanning elektronmikroskopi (SEM)
Scanning elektronmikroskopi har vært mye brukt for å avsløre høy -Oppløsning strukturelle detaljer om proteiner. Som observert i SEM-bilder, er aggregatdannelse klart på grunn av ombygging av histon H1 av MG (fig 11A). Native histone vises ganske forskjellig fra sin modifisert form (figur 11B).
CD resultatene av DNA-protein interaksjoner
Den sirkulære dichroic analyse av interaksjoner mellom histon H1 og DNA viste markerte variasjoner i spektrale egenskapene til innfødte histon, sin modifisert form og den innfødte DNA. Native DNA viste en positiv bånd ved 277 nm (θ = 8,542) og en negativ band på 243nm (θ = 5,851). Vekselvirkningen mellom histon H1 med DNA fører til reduksjon i positiv topp ved 276 (θ = 4,9123) og en økning i den negative topp på 245 (θ = 5,092). Resultatene av MG modifisert histon og DNA var forskjellig fra DNA og H1-DNA som ga det mellomliggende topp ved 277 (θ = 5,882) og en økning i den negative topp på 243 (θ = 4,394) respektivt. Resultatene er vist i figur 12.
Western blotting-studier
25 ug av nativt og MG-H1 vist som klare bånd på polyakrylamidgel etter sølvfarging. Det modifiserte proteinbånd viste strekking, dannelsen av høyere molekylvekt enhet og en øket lyshet i forhold til den native motparten. I imunoblot analyse, antistoffer indusert mot MG-H1 viste spesifikk binding for immunogen med liten anerkjennelse for epitoper på umodifiserte histon H1. Dette gjentar våre Elsia resultater. Resultatet er gitt i figur 13.
henholdsvis
A1 og A2 representSDS PAGE av innfødte og MG-H1. B1 og B2 er immunoblotter viser binding av anti-MG-H1 antistoffer mot innfødte H1 og MG-H1 hhv.
Binding av serum autoantistoffer hos kreftpasienter til mors H1 og MG modifisert histon H1
Betydelig høyere prosentandel av serum-autoantistoffer fra alle krefttyper viste forbedret binding med Methylglyoxal modifisert H1 i forhold til den native form i de direkte bindende ELISA-eksperimenter. Ut av de totale 83 serumprøver, 54 prøver (65,06%) viste klart høyere binding til MG-H1as mot sin opprinnelige motstykke, og viser dermed bedre anerkjennelse for den modifiserte histon H1. Disse inkluderer 19 prøver av lungekreft, 12 prøver av prostatakreft, 15 prøver av brystkreft og 8 prøver ofhead og halskreft. Resultatene er presentert i fig 14A-14D.
(A) Binding av serum-autoantistoffer i lungekreftpasienter (sera nr. 1-27) for å native (□) og MG modifisert histon H1 (■). Normalt humant serum (NHS) tjente som negativ kontroll. Histogrammet viser bety absorbans verdier. (B) Binding av serum autoantistoffer i prostatakreftpasienter (sera nr. 28-46) til morsmålsopplæring (□) og MG modifisert histon H1 (■). Normalt humant serum (NHS) tjente som negativ kontroll. Histogrammet viser bety absorbansverdier. (C) Binding av serum-autoantistoffer i brystkreftpasienter (sera nr. 47-68) til native (□) og MG modifisert histon H1 (■). Normalt humant serum (NHS) tjente som negativ kontroll. Histogrammet viser bety absorbans verdier. (D) Binding av serum autoantistoffer i hode og nakke kreft pasient (sera nr. 69-83) til morsmålsopplæring (□) og MG modifisert histon H1 (■). Normalt humant serum (NHS) tjente som negativ kontroll. Histogrammet viser bety absorbans verdier.
Binding av IgG fra kreftpasienter til mors H1 og MG endret histon H1
For å ytterligere evaluere den fine spesifisiteten av autoantistoffer i kreftpasienter, IgG ble isolert fra serumprøver som viser økt binding til MG modifisert histon H1 og evaluert ved inhibering ELISA. IgG ble blandet med forskjellige mengder nativt og MG-H1 (0-20 ug /ml) og inkubert i 2 timer ved 37 ° C og over natten ved 4 ° C. Den observerte antistoff hemming fornative H1 og MG-H1 histoner var i størrelsesorden 19,4% -36,2% og 49,2% -76,5% indolene bety prosent hemming av innfødte H1 i bindingen av autoantistoffer fra lunge, prostata, bryst og hode
