Abstract
REV3L, den katalytiske subenheten av DNA Polymerase ζ (Polζ), spiller en betydelig rolle i DNA-skade toleranse mekanisme translesion syntese (TLS). Rollen som
REV3L
i kjemosensitivitet av livmorhalskreft må leting. I den foreliggende undersøkelse, evaluerte vi ekspresjonen av proteinet i Polζ parafininnstøpte vev ved hjelp av immunohistokjemi og funnet at ekspresjonen av Polζ i livmorhalskreft vev var høyere enn i normalt vev. Vi deretter etablert noen livmorhalskreft cellelinjer med
REV3L
undertrykkelse eller overekspresjon. Nedbryting av
REV3L
undertrykker celleproliferasjon og kolonidannelse av livmorhalskreftceller gjennom G
en arrestasjon, og
REV3L
fremmer celledeling og kolonidannelse av livmorhalskreftceller ved å fremme G
en fase til S-fasen overgangen. Undertrykkelse av
REV3L
uttrykk forbedret følsomheten av livmorhalskreftceller til cisplatin, og overekspresjon av
REV3L
dratt motstand mot cisplatin som dokumentert av endring av apoptose priser, og betydelig uttrykk nivåendringer av anti-apoptotiske proteiner B-celle lymfom 2 (Bcl-2), myeloid celle leukemi-sekvens 1 (Mcl-1) og B-celle-lymfom-ekstra stor (BCL-xl) og proapoptotiske Bcl-2-assosiert x protein (Bax ). Våre data antyder at
REV3L
spiller en viktig rolle i regulering av livmorhalskreft cellulær respons overfor cisplatin, og således målretting
REV3L
kan være en lovende måte å endre kjemosensitiviteten i livmorhalskreftpasienter.
Citation: Yang L, Shi T, Liu F, Ren C, Wang Z, Li Y, et al. (2015)
REV3L
, en lovende Target i Regulering av kjemosensitivitet av livmorhalskreftceller. PLoS ONE 10 (3): e0120334. doi: 10,1371 /journal.pone.0120334
Academic Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec i Trois-Rivieres, CANADA
mottatt: 28 juli 2014; Godkjent: 29 januar 2015; Publisert: 17 mars 2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Støtte ble gitt av Natural Science Foundation National Kina. (gi ingen 81202050, https://www.nsfc.gov.cn/.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den femte vanligste og den fjerde dødeligste kreft hos kvinner over hele verden med nesten 528 000 nye tilfeller og 266.000 dødsfall i 2012 [1]. Kjemoterapi er en av de mest nyttige strategier i systematisk behandling av livmorhalskreft. Cisplatin monoterapi eller i kombinasjon med andre kjemoterapeutiske legemidler forble den dominerende systemisk terapeutisk modalitet for lokalavansert eller metastatisk kreft i livmorhalsen i flere tiår. Imidlertid er utviklingen av resistens mot kjemoterapeutiske midler utgjør en stor hindring som bidrar til tumorresidiv, progresjon, og visse død [2].
Selv om den eksakte underliggende mekanismene ikke er fullt ut forstått, har studier vist at noen DNA skade rømming reparasjon og kan overbelaste replikering maskiner tross for eksistensen av DNA reparasjonsmekanismer. For eksempel lar translesion DNA-syntese (TLS) skadede celler for å fullføre genom replikering ved rekruttering av spesialiserte DNA polymeraser til fastlåste replikering gafler [3,4]. TLS polymeraser bidra til opprettholdelse av den genomiske integritet, og ellers avbrutte DNA-replikasjonsgafler kan kollapse inn i strukturene og føre til en DNA dobbel tråd pause (DSB), for derved å øke genomiske ustabilitet [3]. I mellomtiden er lav-fidelity DNA polymeraser involvert i spontan og DNA-skader indusert mutagenese, og dermed bidra til malign transformasjon [5,6,7]. Aktiveringen av TLS kan også bidra til den ervervede medikamentresistens i tumorceller behandlet med DNA-skadende anticancermidler, og dette er fordi Polζ som hører til den funksjonelle gruppen av TLS DNA-polymeraser spiller en viktig rolle i bypass av mange typer av DNA-skade [8,9,10,11].
REV3L
genet, pattedyr ortolog av Saccharomyces cerevisiae
Rev3
genet koder for den katalytiske subenhet av Polζ [12,13], mens REV7L (også kjent som MAD2L2) samhandler med REV3L gjennom en spesifikk bindingsdomene [14,15,16,17].
REV3L
genet ser ut til å være allestedsnærværende uttrykt i både normale og maligne menneskelig vev, mens dens uttrykk nivået varierer i ulike normal og kreftceller [18,19,20]. Den unike funksjonen til
REV3L
er av uvanlig interesse på grunn av sin kritiske rolle i å forebygge cisplatin cytotoksisitet. For eksempel kylling DT40 celler som mangler
Rev3
viste høyere følsomhet for cisplatin, sammenlignet med andre DNA-reparasjon eller sjekk-punkt mutanter [21].
Rev3
uttømming øker også følsomheten og reduserer mutagenese indusert av cisplatin i mus B-cellelymfomer og lungekreftceller, humane og mus fibroblast-celler, og humane tykktarm carcinoma-celler [22,23,24,25]. Undertrykkelse av uttrykk for
REV1L
, et medlem av polymerase familien Y-type som støtter aktiviteten til DNA polymerase ζ [13,26], kan betydelig redusere frekvensen av utviklingen av resistens i menneskelig ovarialcancer celler [27]. I tillegg er en studie fant at hemming av
Rev3
uttrykk i seg selv kan indusere vedvarende DNA-skade og vekst arrest i kreftceller i flere lunge, bryst, mesothelioma, og tykktarmskreftcellelinjer [28]. Disse resultatene tyder på at
REV3L
gen signifikant påvirker cellulær motstand mot cisplatin. Derfor er det mulig å overvinne cisplatin motstanden gjennom inhibering av
REV3L
.
Vårt tidligere studie viste at Polζ ekspresjon kan brukes som prediktor for dårlig prognose, som kan være forårsaket av potensialet chemoradiation motstand i livmorhalskreftpasienter [29]. Rollene som Polζ i å regulere chemoradiation motstand og forutsi prognose forbli dårlig karakterisert ved livmorhalskreft, som fortjener videre leting. Derfor etablerte vi livmorhalskreft cellelinjer med nedregulering eller oppregulering av
REV3L Kjøpe og evaluert deres følsomhet for cytotoksisk middel cisplatin og relaterte apoptose hendelser.
Materialer og Metoder
Etikk uttalelse
All forskning som omfatter mennesker deltakere ble godkjent av etikkomiteen ved Fudan University i Shanghai Cancer Center (FUSCC). En skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle rekruttert personer, og hver klinisk undersøkelse ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen samtykke.
vevsprøver og cellelinjer
Vi har gjort microarray ved hjelp av plateepitelkarsinom prøver fra 123 sammenhengende livmorhalskreftpasienter med FIGO (International Federation of gynekologi og fødselshjelp, 2009) stadier IB, IIA eller IIB og 17 pasienter med normal cervical behandlet mellom mars 2008 og mars 2009 kl FUSCC. Vev ble histopathologically bekreftet uavhengig av to gynekologiske patologer (TXY og YG). Den detaljerte kliniske dannelse ble hentet fra pasientenes elektronisk database på FUSCC, som beskrevet tidligere [29].
De etablerte menneskelivmorhalskreft cellelinjer Siha, HeLa, ME180 og MS751 ble hentet fra American Type Culture Collection ( ATCC). Alle celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, HyClone, Thermo Scientific, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Gibco, Life Technologies, USA), 100 U /ml penicillin (BioWest, Nuaille, Frankrike), og 100 U /ml streptomycin (BioWest, Nuaille, Frankrike) og inkuberes ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 5% CO
2.
Immunohistochemistry analysen
immunhistokjemi (IHC) analyser var utført som beskrevet tidligere [29]. Den 10 × 12 tissue microarray (TMA) ble gjort av FUSCC Tissue Bank, som beskrevet tidligere [30]. IHC ble utført på 5-mikrometer tykke TMA seksjoner ved hjelp av antistoff mot Polζ (sc-48814, kanin polyklonale antistoff, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, 1: 100 fortynning) og ChemMate
TM EnVision
TM /HRP (pepperrot peroksidase),
Kanin /mus
, deteksjon kit (DAKO, Glostrup, Danmark). En kjent sak positiv prøve ble inkludert som en positiv kontroll, og det primære antistoff ble erstattet med ikke-immune mus /kaninserum for negativ kontroll. IHC farging ble scoret uavhengig av to gynekologiske patologer (TXY og YG) som ble blindet til pasient kliniske utfall, ved hjelp av et poengsystem basert på både andelen positive tumorceller og fargeintensitet, som beskrevet tidligere [31]. Til slutt ble vurderingen av protein uttrykk definert som negative (≤2 +) og positive ( 2 + til 6+), og for score som var uninterpretable grunn av vev tap eller mangel på kreftceller, en score på ikke aktuelt (N /A) ble tildelt.
Plasmid Bygg og Cell Transfeksjon
Alle de primere som brukes i studien ble utformet ved hjelp Primer Premier 5-programvaren. For å teste for eventuelle repeterende sekvenser, ble primere linje med genbanken databasen ved hjelp av BLAST nettbasert verktøy. AutoDimer programvare ble brukt i påvisning av potensielle hårnålstrukturer og mulige primer-dimer kombinasjoner. Alle primere ble syntetisert ved Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kina). Tre kort hårnål interfering RNA (shRNA) målretting
REV3L
ble utformet og kjemisk syntetisert og satt inn i pBABE /U6 /Puro vektor i henhold til tidligere rapportert metode [32,33]. Vi valgte en shRNA med høyest hemming effektivitet ved hjelp av cellelinjer med høy uttrykk for
REV3L plakater (Forward primer: 5′-GGAGAATAGAACTATGG TGCAAGCCTACGTAGCGTCTGCACCATAGTTCTATTCT CCCTTTTTG-3 «; Revers primer: 5»-AATTCAAA AAGGGAGAATAGAACTATGGTG CAGACGCTACGTAGGCTTGCACCATAG TTCTATTCTCC-3 «). Den pBABE /U6 /Puro vektor som inneholder negativ kontroll (NC) shRNA (shGFP) ble likeledes konstruert ved direkte innsetting oligo nukleotider som koder liten hårnål RNA mot grønn fluorescens protein mRNA (shGFP) inn pBabe /U6 /puromycin [32,34]. Retrovirus uttrykker
REV3L
shRNA eller GFP shRNA ble produsert ved transfeksjon av pBabe /U6 /sh
REV3L
eller pBabe /U6 /shGFP inn phoenix amfotrofiske celler og brukes til å infisere målceller ved hjelp av en metode beskrevet tidligere [32]. Kort sagt ble celler infisert med virus supernatanter, og etter en 24-timers utvinning ble cellene valgt med puromycin (200 ng /ml) i 10-14 dager for å etablere stabile cellelinjer som uttrykker shREV3L eller shGFP. De resulterende cellene ble dyrket i medium uten puromycin og brukt for videre eksperimenter. Cellelinjer med lav uttrykk for
REV3L
ble transfektert med pcDNA3.1 /neo-REV3L plasmid (gitt av Dr. Yoshiki Murakumo, Nagoya universitet Graduate School of Medicine, Nagoya, Japan) eller pcDNA3.1 /neo negativ kontroll plasmid hjelp Lipofectamine 2000 per produsentens instruksjoner. Etter 48 timer og innen 120 timer med transfeksjon ble cellene brukes til videre analyse.
RT-PCR og Real-Time PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Life-teknologi , USA) etter produsentens protokoll, og omvendt transkribert til cDNA ved hjelp PrimeScript
TM RT reagent Kit (Takara Biotechnology, Shiga, Japan). PCR-produkter ble amplifisert med Takara Taq TM med reaksjoner av 30 sykluser av (94 ° C, 30 sekunder; 58 ° C, 30 s, og 72 ° C, 1 minutt) ved hjelp av Mastercycler® eprealplex (Eppendorf AG, Hamburg, Tyskland) . Fem mikroliter av PCR-produktene ble analysert ved elektroforese på 1,5% agarosegel inneholdende etidiumbromid, og visualisert under UV-belysning. Real-time PCR ble utført i Applied Biosystems Prism 7900 system (Applied Biosystems, Life-teknologi, USA) ved hjelp ExScipt Syber grønn QPCR kit (Takara Biotechnology, Shiga, Japan) i følgende forhold: en innledende denaturering av 95 ° C for 30 s, en syklus; 95 ° C i 5 s; 55 ° C i 30 s; og 72 ° C i 30 s, 40 sykluser; etterfulgt av en smeltekurve analyse for å kontrollere spesifisiteten av forsterkning. Hver prøve ble testet i triplikat, og primere for glyseraldehyd 3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) ble anvendt i parallelle reaksjoner som intern kontroll. Tre uavhengige forsøk ble gjort for endelige analyser ved hjelp av to
-ΔΔCT relativ kvantifisering metode. Primerene av
REV3L
brukt var 5′-CGCGTCAGTTGGGACTTAAG-3 «(forover primer) og 5′-ACTATCGCCAACCTCAATGC-3» (revers primer). Primerene av
GAPDH
var 5′-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3 «(forover primer) og 5′-CAAGGGGTCTACATGGCAAC-3» (revers primer). Primerene av
REV7L
var 5′-CTGGAGAAGAATGATGTGGAG-3 «(forover primer) og 5′-GTGGAGGCTGGGTGATCTCA-3» (revers primer).
Cell Proliferation Assay og celleviabilitet Assay
For å evaluere celleproliferasjon sats, belagt vi 1×10
3 celler per brønn i 96-brønners plater med 100 ul vedlikehold medium. Celletelling leder-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) ble brukt for å overvåke celleveksten ved 0-7 dag og antallet levedyktige celler ble bestemt ved måling av absorbansen ved 450 nm med en mikroplateleser (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Indeksen spredning ble beregnet som eksperimentell OD verdi /kontroll OD verdi. Cellelevedyktigheten ble også evaluert av CCK-8. Vi belagt 5×10
3 livmorhalskreft celler per brønn i 96-brønners plater. Den neste dag ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av legemidler mot kreft. Cellelevedyktigheten ble deretter målt som beskrevet ovenfor. Tre uavhengige eksperimenter ble utført i kvadruplikat-brønner.
Colony Forming Assay
Celler ble sådd ut i en lav tetthet på 500 i en seks-brønns plate i tre eksemplarer. Cellene ble tillatt å vokse i 2 uker før de ble fiksert med iskald metanol og farget med krystallfiolett. Forsøkene ble utført minst tre ganger for avsluttende analyser.
Western Blotting
Cellene ble lysert i lyseringsbuffer inneholdende proteaseinhibitorer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 M EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% SDS og 0,005 x protease-inhibitor cocktail). Cellelysatene ble løst i 10% -15% SDS-PAGE-elektroforese og overført til PVDF-membraner (Millipore Merck, Darmstadt, Tyskland). Membranen ble blokkert med 5% fettfri melk i PBS-Tween 20 i 1 time ved romtemperatur og inkubert med primært antistoff valgt med β-actin anvendt som en intern kontroll. Immunreaktiviteten ble påvist etter inkubering med en pepperrot peroksidase-konjugert sekundært antistoff (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., PA, USA, 1: 2000 fortynning) ved hjelp av den forbedrede kjemiluminescens-metoden (Thermo Scientific, USA). Antistoffer mot Bcl-2, B-celle lymfom-ekstra stor (BCL-xl), myeloid celle leukemi-1 (Mcl-1), Bcl-2-assosiert x protein (Bax), cytokrom c, β-aktin (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, 1: 1000 fortynning) og spaltet caspase 3-p17-spesifikke antistoff (Proteintech, IL, USA, 1: 1000 fortynning ble) som benyttes for Western blotting-analyse. Western blot bandet tetthet ble analysert ved hjelp av Image J programvare i henhold til produsentens anvisninger, og bandet tetthet forholdet mellom hvert protein til p-aktin ble beregnet deretter. Tre uavhengige forsøk ble gjort for endelige analysene.
Cell Cycle Analysis ved flowcytometri
Flowcytometri cellesyklusanalyse ble utført ved hjelp av PI enkelt fargemetoden. Celler ble suspendert i 1 ml fosfat-bufret oppløsning (PBS) og fiksert i sentrifugerør i 3 ml absolutt etanol. Cellene ble holdt i etanol over natten ved -20 ° C. Deretter ble etanol suspenderte cellene sentrifugert i 5 minutter ved 2000 rpm. Cellepelleten ble resuspendert i 5 ml PBS i ca. 30 s og sentrifugert ved 2000 rpm i 5 min. Cellepelleten ble resuspendert i 500 pl PI farging solutionand holdt i mørke ved 37 ° C i 10 min. Prøven ble analysert ved bruk av en FACScan flowcytometri (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
Apoptose Analyse ved strømningscytometri
Adherente celler ble samlet og underkastet de følgende apoptose analyser. Celler ble merket med FITC-konjugert Annexin V og PI ved hjelp av en Annexin V-FITC (fluoresceinisotiocyanat) apoptose deteksjon kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner, og deretter analysert ved FACScan flowcytometri.
Immunofluorescens-analyse
Celler ble sådd ut i en tetthet på 2000 i 24-brønners kammerobjektglass og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cisplatin i 24 timer. Cellene ble fiksert med MeOH og permeabilisert med Triton X-100. Da celler ble blokkert med 1% BSA i PBS i 2 timer, og inkubert med primært antistoff mot γ-H
2AX (Biolegend, San Diego, CA, USA, 1: 200 fortynning) over natten. Til slutt ble cellene inkubert med AlexaFluor-488 geite-anti-muse-sekundært antistoff (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., PA, USA, 1: 200 fortynning) og montert med DAPI. y-H
2AX foci ble vurdert med grønn fluroscence. Minst tre uavhengige eksperimenter ble utført.
Cisplatin behandling
Cisplatin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Stock konsentrasjon av cisplatin ble 5 mg /ml. Forskjellige konsentrasjoner av cisplatin ble brukt til å behandle livmorhalskreft linjer for cellenes levedyktighet assay for forskjellig tid. Og i apoptose analyse, ble cisplatin brukt av den 30%, 50% inhibitorisk konsentrasjon beregnet fra cellenes levedyktighet analysen.
Statistical Analysis
Alle verdier ble uttrykt som middel ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Statistisk analyse ble utført av Student
t
-test. En
P
verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS versjon 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
Polζ er betydelig høyt uttrykt i livmorhalskreft vev
Å undersøke forskjellen i uttrykket av
REV3L
mellom menneske livmorhalskreft og normal cervix, vevet microarray av 123 plateepitelkarsinom livmorhalskreftpasienter og 17 pasienter med normal livmorhalsen ble innhentet og Polζ uttrykk ble analysert ved hjelp av IHC analyse (fig. 1A). Pasientenes egenskaper og status for Polζ ekspresjon er vist i fig. 1B. Blant de 123 livmorhalskreftpasienter, ble syv (6%) vev scoret N /A for IHC farging. Generelt ble Polζ positivt uttrykk påvist i 21,7% (25/115) i livmorhalskreft vev og 5,9% (1/17) i normal cervical vev. Også gjennomsnitts Polζ uttrykk var høyere i livmorhalskreft vev enn i normale cervical vev (IHC farging minutter ble 1,72 og 0,82, henholdsvis;
P
= 0,034) (Fig. 1A, B).
(A) Polζ-positive (øvre, venstre panel) og Polζ-negative (øvre, høyre panel) uttrykk i livmorhalskreft prøver, Polζ-positive (nedre, venstre panel) og Polζ-negative (lavere, høyre panel) uttrykk i normale cervical vev. (B) De kliniske egenskaper og status for Polζ uttrykk for livmorhalskreftpasienter og pasienter med utstyrsleverandørene livmorhalsen. Gjennomsnittlig Polζ uttrykk var høyere i livmorhalskreft vev enn i normale cervical vev. (C) Real time PCR-analyse for
REV3L
mRNA uttrykk i fire livmorhalskreft cellelinjer.
REV3L
uttrykk var høyere i HeLa og Siha celler enn i MS751 og ME180 celler. (D) Revers transkripsjon PCR-analyse for
REV3L
mRNA uttrykk i kort hårnål RNA transfekterte negative kontrollceller (shGFP), shREV3L celler,
REV3L
-overexpressing celler, og vektorkontrollceller.
REV3L
uttrykk ble betydelig redusert i shREV3L celler og ble økt i
REV3L
-overexpressing celler sammenlignet med kontrollceller.
Etablering av livmorhalskreft cellelinjer med
REV3L
knockdown eller overekspresjon
for å studere funksjonen til
REV3L
i menneskelige livmorhalskreftceller, vi har oppdaget at
REV3L
mRNA uttrykk i flere livmorhalskreft cellelinjer. Og så setter vi opp cellelinje modeller genetisk manipulerte for
REV3L
uttrykk. Som vist på fig. 1C,
REV3L
uttrykk var høyere i livmorhalskreft cellelinjer HeLa og Siha enn ME180 og MS751. Dermed undertrykt vi
REV3L
uttrykk i HeLa og Siha cellelinjer med stabile shREV3L transfeksjon (Fig. 1 D). I kontrast,
REV3L
uttrykk ble overuttrykt i livmorhalskreft cellelinjer ME180 og MS751 sammenlignet med vektorkontrollcellene (Fig. 1D). Dermed forbedret vi uttrykk for
REV3L
i ME180 og MS751 celler. Regulering av
REV3L
genuttrykk i etablerte cellelinjer ikke har en signifikant effekt på REV7L mRNA uttrykk nivåer (S1 Fig).
REV3L
styrer celledeling og cellesyklus
Vi først oppdaget effekten av
REV3L
på celleproliferasjon og cellesyklus og fant at
REV3L
uttømming trykkes cellevekst som undersøkes av CCK8 analysen (fig. 2A) og kolonidannelse analyse sammenlignet med kontrollceller (fig. 2E). Fraksjonen av HeLa-celler i G
1 fase økt til 63% etter hemming av
REV3L
uttrykk sammenlignet med 54% i kontrollceller (Fig. 2C). Dermed hemming av
REV3L
induserer en G
1 arrest i livmorhalskreftceller. Overekspresjon av
REV3L
fremmet celleproliferasjon (Fig. 2B) og kolonidannelse av livmorhalskreftceller (Fig. 2F). Cellesyklusanalyse viste at en betydelig reduksjon i den fraksjon av G
1 fase ble observert i ME180-celler etter
REV3L
overekspresjon (80%) sammenlignet med kontrollceller (66%) (fig. 2D) . Dermed overekspresjon av
REV3L
fremmer G
1 fase til S fase overgang i livmorhalskreftceller.
(A) Nedbryting av
REV3L
trykkes celleproliferasjon av HeLa shREV3L celler og Siha shREV3L celler. (B) Forbedring av
REV3L
fremmet celle spredning av MS751
REV3L Hotell og ME180
REV3L
celler. (C) Nedbryting av
REV3L
indusert G
1 arrest i HeLa shREV3L celler. (D) Forbedring av
REV3L
fremmet G
1 fase til S fase overgang i ME180
REV3L
celler. (E) Nedbryting av
REV3L
trykkes koloni dannelsen av HeLa shREV3L og Siha shREV3L celler. (F) Forbedring av
REV3L
fremmet koloni dannelsen av MS751
REV3L Hotell og ME180
REV3L
celler. Data er gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter ± SEM. *
P
0,05.
REV3L-
uttømming sensitizes livmorhalskreft cellelinjer til cisplatin
REV3L
RNAi ble brukt til å undertrykke uttrykk for
REV3L
å se om hemming av
REV3L
uttrykket kan forbedre kjemosensitivitet av menneskelige livmorhalskreftceller til cisplatin. Resultatene fra CCK8 analyser viste at etter undertrykkelse av
REV3L
, livmorhalskreft cellene mer følsomme for den cytotoksiske effekt av cisplatin (fig. 3A). Celle apoptose ble analysert ved hjelp av Annexin V-FITC farging. Dataene viste at tidlig apoptotiske priser i shREV3L HeLa og Siha celler var betydelig høyere enn i shGFP HeLa og shGFP Siha celler som respons på ulike doser av cisplatin i 24 timer (fig. 3B, C). 30%, 50%, 70% hemmende konsentrasjoner av cisplatin i HeLa, Siha
REV3L
undertrykkelse celler og kontrollceller er vist i tabell 1.
(A) Undertrykkelse av
REV3L
confered livmorhalskreftcellene mer følsomme for den cytotoksiske effekten av cisplatin. (B) Undertrykkelse av
REV3L
viste overfølsomhet for cisplatin. Celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av cisplatin i 24 timer, etterfulgt av farging med Annexin V-fluorescein-isotiocyanat (FITC) og propidiumiodide (PI) for tidlige apoptotiske celler (Annexin V + PI-). Tidlig apoptotiske priser av
REV3L
-suppression celler var betydelig høyere enn for de vektorkontrollceller under samme tilstand. (C) Prosentandelen av apoptotiske celler indusert av cisplatin. Data er gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter ± SEM. *
P
0,05, **
P
0.01.
REV3L
overekspresjon gir resistens mot cisplatin i livmorhalskreftcellelinjer
For ytterligere å validere effekten av
REV3L
på kjemosensitivitet av menneskelige livmorhalskreftceller til cellegifter, undersøkte vi følsomheten til
REV3L
overekspresjon celler til cisplatin. Resultatene viste at overekspresjon av
REV3L
gjengitt cellene resistente overfor forskjellige doser av cisplatin (Fig. 4A).
REV3L
-overexpressing ME180 og MS751 celler viste en nedgang i cisplatin-indusert tidlig apoptose (Fig. 4B, C). 30%, 50%, 70% hemmende konsentrasjon av cisplatin i MS751, ME180
REV3L
overekspresjon celler og kontrollceller er vist i tabell 2.
(A) Overuttrykte
REV3L
gjengis livmorhalskreftceller resistente mot cisplatin. (B) Påvisning av apoptotiske celler ved flow cytometri. Overekspresjon av
REV3L
hemmet apoptose indusert av cisplatin. (C) Prosentandelen av apoptotiske celler indusert av cisplatin. Data er gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter ± SEM. *
P
0,05.
REV3L
indusert chemoresistance er formidlet gjennom mitokondriene assosierte apoptotiske sti
Som mitokondriene assosierte apoptotiske sti deltar i cellulær respons i svulster mange kreft narkotika, for å se om det er involvert i
REV3L
indusert endring i følsomhet for cisplatin, utførte vi en analyse av proapoptotiske proteiner (Bax, cytokrom c) og antiapoptotic proteiner (BCL-2, Bcl- xl, og Mcl-1) i vektorkontrollceller og
REV3L
-overexpressing eller undertrykkelse celler med cisplatin behandling (fig. 5A, D). Etter behandling med cisplatin for 24 timer, BCL-2, BCL-xl og Mcl-1-nivå markert redusert, og Bax og cytokrom c nivåene økte i shREV3L HeLa og Siha celler, sammenlignet med shGFP HeLa og Siha celler. Konsekvent, etter behandling med cisplatin,
REV3L
-overexpressing MS751 og ME180 celler viste høyere nivåer av BCL-2, Mcl-en og BCL-XL og lavere nivåer av Bax og cytokrom c, sammenlignet med vektorkontrollcellene . Videre, etter eksponering for cisplatin (1 umol /l) i 72 timer, en tidsavhengig økning i mengden av spaltet caspase-3, ble ikke observert i HeLa shREV3L celler, og en reduksjon i mengden av spaltet caspase-3 ble observert i MS751
REV3L
celler etter en enkelt dose behandling av 10 umol /L av cisplatin (fig. 5C, D). Dermed disse resultatene tyder på at
REV3L
overfører chemoresistance til cisplatin gjennom mitochondria- forbundet apoptotiske sti.
(A) Uttrykket nivåer av BCL-2, BCL-XL og Mcl-en var nedre og nivåer av Bax og cytokrom c var høyere i shREV3L celler sammenlignet med shGFP celler i respons til den samme dose av cisplatin.
REV3L
-overexpressing MS751 og ME180 celler viste høyere nivåer av BCL-2, Mcl-1 og BCL-xl og lavere nivåer av Bax og cytokrom c i forhold til vektorkontrollceller. (B) γ-H
2AX og p-p53 (pS15) proteiner ble økt i Siha shREV3L celler og redusert i ME180 REV3L celler, sammenlignet med kontrollceller etter cisplatin behandling. (C) Tidsavhengig ekspresjon av spaltet caspase-3 etter eksponering mot en enkelt dose av cisplatin (1 umol /l) i MS751 celler og en enkelt dose av cisplatin (10 umol /l) i HeLa-celler. Ekspresjonsnivåene av spaltede caspase-3 var lavere i MS751
REV3L
celler og høyere i HeLa shREV3L celler sammenlignet med kontrollceller som respons på den samme dose av cisplatin i en tidsavhengig måte. (D) Normalisert fold ekspresjon av hvert protein mot intern kontroll protein. Data er gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter ± SEM. * P 0,05.
REV3L
begrenser DNA skade respons etter behandling med cisplatin
For å bestemme intensiteten av DNA skade respons etter cisplatin behandling i
REV3L
overekspresjon eller undertrykkelse livmorhalskreft cellelinjer, vi har oppdaget γ-H
2AX (pS139) foci formasjon ved hjelp av immunfluorescens. HeLa og Siha celler som mangler
REV3L
uttrykk utstilt intens γ-H
2AX flekker i sammenligning med shGFP kontrollceller etter eksponering for cisplatin (Fig. 6A). Tvert imot, MS751 og ME180 celler med
REV3L
overekspresjon viste svakere γ-H
2AX farging sammenlignet med (Fig. 6B) kontrollceller. Analyse av proteiner, viste at γ-H
2AX, og p-p53 (pS15) proteiner ble økt i Siha shREV3L celler og redusert i ME180
REV3L
overekspresjon-celler, sammenlignet med kontroll-celler etter behandling med cisplatin (Fig . 5B, D).
(A) HeLa og Siha celler ble dyrket i nærvær av i en enkelt dose av cisplatin (3 umol /l og 25 pmol /L, henholdsvis) i 24 timer. HeLa og Siha celler som mangler
REV3L
uttrykk utstilt intenser γ-H
2AX flekker i sammenligning med shGFP kontrollceller etter eksponering for cisplatin. (B) MS751 og ME180-celler ble dyrket i nærvær av i en enkelt dose av cisplatin (30 umol /l og 5 umol /l, henholdsvis) i 24 timer. MS751 og ME180 celler med
REV3L
overekspresjon viste svakere γ-H
2AX flekker enn kontrollceller. Kvantifisering av γ-H
2AX foci ble utført og analysert per celle. Over 50 celler ble talt i hver cellelinje.
Diskusjoner
Polζ er en utsatt for feil DNA polymerase involvert i TLS som er preget av sin evne til å forlenge feilaktige primer-mal termini . På den ene side kan Polζ opprettholde genomet stabilitet og er til nytte for å overleve når cellene blir utsatt for DNA-skade [35,36,37,38,39]. På den annen side, ved å fremkalle spontan og DNA-lesjoner-utløst mutasjoner ved å forårsake feil nukleotider i DNA, Polζ bidrar til akkumulering av genetisk skade, og kan således spille en rolle i karsinogenese og tumorprogresjon [40,41,42]. Expression nivåer av
REV3L
genet, som koder for den katalytiske subenhet av Polζ, varierer i ulike typer kreft. Noen studier har funnet at
REV3L
ble overuttrykt i menneskelige glioma vev resected før behandlingen sammenlignet med normale hjernen vev [19], mismatch reparasjon-defekt, p53 – /- kolorektal adenokarsinomer sammenlignet med kontroll vev [43].
REV3L
polymorfismer ble også rapportert å være signifikant assosiert med risiko for lungekreft og brystkreft [44,45]. Mens andre studier har funnet at
REV3L
uttrykk ble nedregulert i tykktarm karsinomer uavhengig av svulst klasse [46], magekreft [47], og lungekreft [47].
