Abstract
microRNAs (mirnas) har vist seg å delta i mange viktige cellulære prosesser, inkludert bestrålingssensibilisering. VEGF-familien, en viktig regulator av angiogenese, spiller også en viktig rolle i reguleringen av kreftcelle Radiosensitivity. VEGFR2 formidler de store vekst og permeabilitet handlingene til VEGF i et parakrint /autokrint måte. MiR-200C, i skjæringspunktet av epitel-mesenchymale overgang (EMT), er spådd å målrette VEGFR2. Hensikten med denne studien er å teste hypotesen om at reguleringen av VEGFR2 sti av MIR-200c kan modulere Radiosensitivity av kreftceller. Bioinformatiske analyse, luciferase reporter-analyser og biokjemiske analyser ble utført for å validere VEGFR2 som et direkte mål for MIR-200c. De radiosensitizing effektene av MIR-200c på A549 celler ble bestemt av klonogene analyser. Nedstrømsregulerende mekanisme MIR-200c ble undersøkt med Western blotting analyser, FCM, tube formasjons analyser og migrasjon analyser. Vi identifiserte VEGFR2 som en roman mål av MIR-200c. Ektopisk MIR-200c økte Radiosensitivity av A549 mens MIR-200c nedregule redusert det. Dessuten viste vi at Mir-200c radiosensitized A549 celler ved å målrette VEGF-VEGFR2 vei spesifikt, og dermed fører til hemming av nedstrøms pro-overlevelse signale transduksjon og angiogenese, og fungerer som et potensielt mål for radiosensitizition forskning.
Citation: Shi L, Zhang S, Wu H, Zhang L, Dai X, Hu J et al. (2013) MiR-200c Øker Radiosensitivity av ikke-småcellet lungekreft cellelinje A549 ved målretting VEGF-VEGFR2 Pathway. PLoS ONE 8 (10): e78344. doi: 10,1371 /journal.pone.0078344
Redaktør: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, USA
mottatt: 03.07.2013; Godkjent: 11 september 2013; Publisert: 30 oktober 2013
Copyright: © 2013 Shi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Hubei Provincial Natural Science Foundation prosjekt (No: 2009CDA061). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Pasientene led av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 85% av alle lungekreft tilfellene [1], [2]. Strålebehandling (RT) er en kraftig modalitet mye brukt i klinikken mot kreftceller. Imidlertid, mange av dem oppviser iboende eller ervervet radioresistance til romtemperatur fører til behandlingssvikt [3]. Samle bevis viser at radioresistance er ikke bare av iboende egenskaper, men et resultat av samspillet mellom kreftceller og mikromiljøet faktorer. Den parakrin /autokrin rolle av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) ved binding til sine reseptorer er en viktig komponent av tumor mikromiljøet og dens selvregulering. Undertrykkelse av VEGF genekspresjon kan forbedre den radiosensitiviteten til cancerceller [4], [5]. Og VEGFR2 er vanligvis ansett for å formidle den viktigste funksjonen tilskrives VEGF. Strålebehandling kombinert med VEGFR2 og EGFR blokkering forårsaket en signifikant forbedring av antitumor-effekter i en ortotopisk modell av lungekreft [6]. Molekylær hemming av VEGFR2 kunne forbedre svulst stråling respons gjennom molekylær målretting av tumor blodkar [7]. Så parakrint signale fra verts VEGF til kreftcelle VEGFR2 kan være en betydelig del av RT feil [8].
microRNAs (mirnas) er en gruppe av små ikke-kodende RNA som undertrykker sine mål uttrykk ved å binde seg til 3 «ikke-translatert region (3’UTR). En studie som identifiserte rotte lungespesifikke mirnas av miRNA microarray viste at Mir-200c uttrykt spesifikt i normale rotte lunge vev [9]. Og tap av MIR-200c uttrykk kan indusere en aggressiv, invasiv og kjemoresistent fenotype i ikke-småcellet lungekreft [10]. Dessuten uavhengige studier viser at restaureringen av MIR-200c kan øke følsomheten til kjemoterapi i ulike tumorer [11], [12]. Så gjør MIR-200c spille en tilsvarende rolle i strålebehandling av ikke-småcellet lungekreft?
bioinformatiske analyse viste at VEGFR2 var en god spådd mål av MIR-200c med to bindingssteder. I dette forsøket undersøkte vi om VEGFR2 kunne være regulert av MIR-200c, som fører til modulering av radiosentivitiy av A549 celler.
Resultater
VEGFR2 er et direkte mål av MIR-200c
bioinformatiske analyse viste at VEGFR2 (vaskulær endotelial vekstfaktor reseptor-2) er en forutsagt mål for MIR-200c som kan direkte inhibere dens genekspresjon (fig. 1A). A549 celler ble transfektert med MIR-200C etterligner (50 nm) eller MIR-200C-hemmere (100 nm) for å øke eller redusere MIR-200c uttrykk. Mimic kontroller (50 nm) eller hemmere kontroller (100 Nm) ble transfektert inn i A549 celler som henholdsvis negative kontroller. Realtime PCR viste at Mir-200C etterligner og MIR-200C-hemmere kan øke eller redusere MIR-200c uttrykk for A549 (data ikke vist). For ytterligere å bekrefte om MIR-200c kan direkte binde seg til 3’UTR av VEGFR2, gjennomførte vi to luciferasereportergenet analysen bruker pLuc-VEGFR2-3’UTR plasmid i A549 celler. Transient transfeksjon av A549-celler med pLuc-VEGFR2-3’UTR plasmid og MIR-200C etterligner førte til en signifikant nedgang i luciferase-aktivitet sammenlignet med kontrollene (fig. 1B). For å undersøke om MIR-200c kan påvirke VEGFR2 protein uttrykk i A549 celler, gjennomførte vi vestlige bolt analyser og funnet ut at Mir-200C ligner redusert protein uttrykk for A549 betydelig i forhold til kontrollene (Fig. 1C).
(A) MIR-200C target språk rester på 3′-UTR av genet VEGFR2 inspisert av bioinformatikk. (B) Den pLuc-VEGFR2-3’UTR konstrukt inneholder en vill-type-sekvensen til 3’UTR av VEGFR2. Den pLuc-VEGFR2-3’UTR konstruksjonen ble ko-transfektert med MIR-200C etterligner i A549 celler. Luciferase-aktivitet ble detektert i 48 timer etter transfeksjon. Og forholdet mellom normaliserte verdi luciferase er vist. (C) VEGFR2 protein ekspresjon i A549-celler ble målt ved hjelp av western blot 48 timer etter transfeksjon. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger. Standardfeil av middelverdien er vist ved feilfelt. * Indikerer p. 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
MiR-200C Ligner Økt Radiosensitivity til A549-celler mens MIR-200C hemmere Redusert Det
For å undersøke om MIR-200c påvirket celle Radiosensitivity, A549 celler ble transfektert med MIR-200C etterligner eller hemmere. Colony overlevelsesanalyser, en gullstandard for Radiosensitivity estimering, ble vurdert ved 0-8 Gy stråling. Transfeksjon av A549 celler med MIR-200C etterligner (50 Nm) betydelig redusert celle overlevelse etter stråling (SER
0,5 1,47, Fig. 2A). Motsatt, transfeksjon av A549 celler med MIR-200C-hemmere (100 Nm) forårsaket en betydelig økning av celle overlevelse etter 0-8 Gy stråling sammenlignet med kontrollene (SER
0,5 0,79, Fig. 2B).
Overuttrykte MIR-200c (A) forbedret Radiosensitivity av A549 celler til IR behandling, mens MIR-200c hemming (B) viste motsatt effekt. Si-VEGFR2 konstruere inhiberte VEGFR2 protein ekspresjon 48 timer etter transfeksjon (C) resulterer i bestrålingssensibilisering av A549-celler (D). Ligner kontroll, inhibitorer kontroll og siRNA kontroll ble transfektert inn i A549-celler som henholdsvis negativ kontroll. Den klonogene overlevelsesanalyser ble gjentatt tre ganger med lignende resultater. Standardfeil av middelverdien blir vist av feilfelt.
VEGFR2 knockdown ble gjort av RNA interferens hjelp lipo2000 transfeksjon reagens. Colony overlevelse analyse viste knockdown av VEGFR2 protein expression nivåer (Fig. 2C) resulterte i en økning i Radiosensitivity av A549 (SER
0,5 1,34) (fig. 2D).
VEGF Nøytralisering Avskaffet bestrålingssensibilisering effekt av MIR-200c
Vi har undersøkt variasjonen av VEGF secreation i det ekstracellulære medium etter ektopisk MIR-200c uttrykk, ved hjelp av VEGF ELISA-analysen. Og ingen vesentlige endringer av VEGF secreation følgende MIR-200c intervensjon har vist seg etter dupliserte tester (Fig. 3A). Bevacizumab (Bev, 1 mg /ml), en VEGF-spesifikk blokkerende monoclony antistoff, ble deretter tilsatt til kulturmediet til A549-celler for å redusere ekstracellulært VEGF-konsentrasjonen 1 time før transfeksjon. Colony overlevelsesanalyser ble utført for å undersøke bestrålingssensibilisering effekten av MIR-200c med eller uten VEGF nøytralisering. Resultatene viste at MIR-200c ikke kunne redusere post-stråling overlevelsesfraksjon uten VEGF-indusert aktivering (fig. 3B).
(A) Elisa-analysen ble anvendt for å detektere endringer VEGF-sekresjon etter transfeksjon av speil 200C etterligner i A549 celler. Bevacizumab (B) og su1498 (C) ble anvendt for å blokkere VEGF-VEGFR2 pathway. Deretter klonogene analyser ble utført for å undersøke effekten av bestrålingssensibilisering MIR-200c etter VEGF-VEGFR2 blokkering. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger. Standardfeil av middelverdien blir vist av feilfelt.
VEGFR2 Blokkering Avskaffet bestrålingssensibilisering Effekt av MIR-200c
VEGFR2 ble blokkert av su1498, en tyrosinkinasehemmer av vaskulær endotelial vekst faktor-reseptor 2 (VEGFR2). Su1498 ble tilsatt til vekstmediet av A549-celler i et endelig concerntration av 5 uM en time før transfeksjon. Klonogene analyser ble utført for å få tilgang til overlevelse av A549-celler etter forskjellige doser av stråling. Resultatene viste at rdiosensitization av VEGFR2 inhibering ble betydelig blokkert ved å hemme VEGFR2 pathway (fig. 3C). Så MIR-200c økte Radiosensitivity av A549 hovedsakelig ved å målrette VEGFR2 sti.
MiR-200c hemmet Aktivering av ERK1 /2 og Akt
For ytterligere å undersøke om nedstrøms signaltransduksjonsveiene av VEGFR2 var involvert i bestrålingssensibilisering av A549, undersøkte vi MAPK og AKT trasé som var de viktigste nedstrøms pro-overlevelse veier av VEGFR2. A549 celler ble transfektert med MIR-200C etterligner eller hemmere. Deretter undersøkte vi ekspresjonsnivået og aktivering av ERK1 /2 og Akt som er de effecter molekyler av MAPK og AKT-reaksjonsveien. Sammenlignet med celler behandlet med etterligner kontroller, aktivering av ERK1 /2 og Akt angitt ved p-ERK1 /2 og p-Akt ble signifikant nedregulert i A549-celler behandlet med MIR-200C etterligner (Fig. 4). Tvert imot, MIR-200C-inhibitorer økt aktivering av ERK1 /2 og Akt sammenlignet med inhibitor kontroller. Disse data antyder at aktivering av ERK1 /2 og Akt modulerer bestrålingssensibilisering effekten av MIR-200c (fig. 4).
ektopisk ekspresjon av MIR-200c hemmet fosforylering av Akt og ERK1 /2, inhibering av speil 200c økt aktivering av Akt og ERK1 /2 veien. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger.
MiR-200c hemmet Angiogenese og migrasjon av HUVEC Cells
Vi undersøkt videre at om MIR-200c, en direkte regulator av VEGFR2 kunne regulere angiogenese av endotelceller. 48 timer etter transfeksjon, ble HUVEC-cellene sultet over natten og sådd ut i 96-brønners plater som var pre-belagt med Matrigel. Etter inkubasjon i 16 timer, MIR-200c-transfekterte celler viste en betydelig svekkelse av røret formasjon evne. Dessuten, nedregulering av VEGFR2 av Si-VEGFR2 kan også hemme angiogenese av HUVEC-celler. Siden migrasjon er et viktig skritt for angiogenese, vi også oppdaget virkningen av MIR-200c om migrasjon av HUVEC celler. Som vist i figur 5, ektopisk ekspresjon av MIR-200c inhiberte signifikant angiogenese og migrering av HUVEC-celler. På den andre siden, undertrykkelse av MIR-200c økt tube dannelse og migrasjon med ca 30% for HUVEC celler.
HUVECs ble transfektert med MIR-200C etterligner, MIR-200C-hemmere eller si-VEGFR2. (A) HUVECs ble dyrket på Matrigel 48 timer etter transfeksjon. Representative bilder av kapillær-lignende strukturer dannet, og (b) lengden av kapillær struktur ble kvantifisert. (C) De transfekterte HUVECs ble også sådd ut på det øvre kammer av 8,0 mm porestørrelse 24-brønners plater for å undersøke Transwell cellemigrering evne. (D) De trekkende celler ble talt opp og statistisk analysert. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger. Standardfeil av middelverdien er vist ved feilfelt. * Indikerer p 0,05 sammenlignet med kontrollgruppen
Diskusjoner
Tidligere arbeid fra vår gruppe og andre har foreslått at VEGF modulerer svulst overlevelse gjennom en rekke måter, inkludert bestrålingssensibilisering [13]. – [15]. VEGF induserer biologiske effekter i en parakrin /autokrin måte ved å binde til dets reseptorer, særlig VEGFR2 (KDR, FLK-1). Noen prekliniske studier har vist at terapeutiske fordelene med strålebehandling kan styrkes når den kombineres med hemmere av VEGFR2 [16]. Målretting VEGFR2 reaksjonsvei gir en ny måte å overvinne radioresistance i strålebehandling av forskjellige kreftformer. Nylig ble noen mirnas vist å modulere strålebehandling av kreftceller. MiR-200C er nøkkelen regulator av epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) som er forbundet med embryogenese, progresjon av kreft og metastase. Og MIR-200c er uttrykt spesifikt i normale rotte lunge vev [9] mens tap av MIR-200c uttrykk indusert en aggressiv, invasiv og kjemoresistent fenotype i ikke-småcellet lungekreft [10]. VEGFR2 er en anslått mål av MIR-200c av bioinformatiske analyse (https://www.targetscan.org). Så det er viktig å finne ut om MIR-200c kan modulere Radiosensitivity av kreftceller ved å målrette VEGFR2 sti.
Etter dual luciferasereportergenet analyser og western blot analyse, viste vi VEGFR2 som et direkte mål for MIR-200c . Deretter testet vi virkningene av ektopisk ekspresjon av MIR-200c på den radiosensitiviteten til A549-celler. Vi fant at oppregulering av MIR-200c med MIR-200C etterligner betydelig redusert VEGFR2 proteinekspresjon og økt radiosensitiviteten til A549-celler etter forskjellige doser av stråling. Men nedregulering av MIR-200c uttrykk med MIR-200C-hemmere økt celle overlevelse og redusert Radiosensitivity. Vi konstruerte ytterligere Si-VEGFR2 å inhibere VEGFR2 protein av A549-celler. Resultatene viste at reduksjon VEGFR2 ekspresjon ved hjelp av si-VEGFR2 kunne forbedre Radiosensitivity i A549-celler, som var forenlig med virkningene av VEGFR2 ned-regulering i andre tumorcellelinjer [17], [18]. Så MIR-200c kan forbedre Radiosensitivity av A549 ved å hemme VEGFR2 uttrykk.
Men en enkelt miRNA kan regulere hundrevis av målgener. Så gjør MIR-200C radiosensibilisere A549 cellene hovedsakelig gjennom målretting VEGFR2 vei? Su1498 er en tyrosinkinaseinhibitor spesifikk for VEGFR2. Vi fant ut at Mir-200c ikke kunne radiosensibilisere A549 mens VEGFR2 ble hemmet av su1498. Siden VEGF er den viktigste ligand av VEGFR2 fungerte i en parakrint /autokrint måte, må vi først undersøkt variant av VEGF-sekresjon etter MIR-200c transfeksjon og fant at Mir-200C etterligner ikke kan påvirke VEGF utskillelsen av A549. Deretter nøytraliseres vi utskilt VEGF utenfor A549 celler med bevacizumab før transfeksjon av MIR-200c, og fikk et negativt resultat, akkurat som VEGFR2 hemming. Så dette tyder på at Mir-200c kan radiosensibilisere A549 celler ved å målrette VEGF-VEGFR2 veien.
Så vi videre undersøkt nedstrøms mekanismer MIR-200c bestrålingssensibilisering. MAPK og PI3K /AKT signaloverføringsveier er to viktige nedstrøms signalveier av VEGFR2 [19]. Direkte målretting og inhibering av disse to reaksjonsveier kan øke Radiosensitivity av kreftceller. Fosforylering av P44 /42-MAPK (Thr202 /Tyr204) og Akt (Ser473), som er viktige molekyler av MAPK og PI3K /AKT signalveier, øker vanligvis overlevelse av kreftceller etter stråling. I vår studie, ble vestlige blot analyser tatt for å undersøke fosforylering nivåendringer av Akt og ERK1 /2 (P44 /42-MAPK) etter tansfection av MIR-200C etterligner eller hemmere i A549 celler. Vi fant at mens økt uttrykk av MIR-200c førte til en hemming av Akt og ERK1 /2 fosforylering, redusert uttrykk av MIR-200c forbedret Akt og ERK1 /2 fosforylering i A549.
hypoksisk mikro extrinsic til kreftceller bidrar vesentlig til radioresistance av strålebehandling [7]. Undertrykkelse av angiogenese betydelig forbedret radiosensitiviteten til cancerceller. Og VEGFR2, en viktig formidler av angiogenese, kan påvirke svulsten microenviroment (TME) som modulerer kreftcelle Radiosensitivity. Våre data tyder på at ektopisk uttrykk for MIR-200c trykt angiogenese av HUVEC celler.
Dessuten har vi også undersøkt andre mekanismer MIR-200c-VEGFR2 interaksjon. Med FCM eller MTT analyser, fant vi ingen signifikante effekter av MIR-200c på cellesyklus, apoptose eller spredning av A549 celler (data ikke vist).
Til sammen våre resultater tyder på at Mir-200c-mediert hemming av VEGF-VEGFR2 signalkaskade kan radiosensibilisere humane NSCLC-cellelinje A549-celler for stråling, hvilket er et terapeutisk mål for bestrålingssensibilisering.
Konklusjoner
Våre data antyder at MIR-200c kan signifikant radiosensibilisere A549 celler ved å målrette VEGF-VEGFR2 veien.
Materialer og metoder
Cell Culture
A549 celler, hentet fra Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), ble dyrket i RPMI 1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære. HUVEC-celler fra American Type Culture Collection (ATCC) ble dyrket i endotelial cellemedium (ECM, Sciencell, USA). Dyrkningsmediet ble fornyet hver 2-3 dager. Og cellene ble passert på 1:6 hver 4 dager etter trypsinering med 0,05% trypsin-EDTA.
Transient Transfeksjon og Cell behandlinger
MiR-200C etterligner, MIR-200C-hemmere, Si- VEGFR2, etterligner kontroller, hemmere kontroller, og siRNA kontroller ble syntetisert ved Ribobio (Guangzhou, Kina). Celler ble sådd ut ved 4 x 10
5 per celle inn i 6-brønners plater én dag før transfeksjon. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) transfeksjon reagens ble ansatt for å transfektere celler med MIR-200C etterligner (50 nm), MIR-200C-hemmere (100 Nm) eller VEGFR2 lite forstyrrende (si) RNA (100 nM). Ingen målretting ligner kontroller (50 nm) hemmere kontroller (100 Nm) eller siRNA kontroller (100 Nm) ble transfektert inn i celler som negative kontroller, henholdsvis. 6 timer etter transfeksjon, ble cellevekstmediet fjernet og inkubert i medium inneholdende 5% FBS i ytterligere 24-72 timer. Ytterligere eksperimenter ble utført med transfekterte celler eller cellelyse. Su1498 (Santa Cruz Biotechnology) eller Bevacizumab (Roche) ble administrert 60 minutter før transfeksjon.
Identifikasjon av MIR-200C Targets
Ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ble A549 celler transfektert med luciferase reporter konstrukter som inneholder 3’UTR av VEGFR2 eller negative kontroll vektorer (Promega). Transfeksjonsagensene blandinger inneholdt 100 ng av fireflyluciferase reporter plasmid og 50 nM av syntetisk Mir-200c duplex. A549-celler ble samlet 48 timer etter transfeksjon, og luciferaseaktiviteten ble målt ved anvendelse av den doble luciferase reporter Assay System (Promega).
klonogene Assay
sensitiviteten til A549-celler til bestråling ble bestemt ved klonogene assay etter de variable doser av stråling (0Gy, 2Gy, 4Gy, 6Gy, 8Gy) ved hjelp av en lineær akselerator (Primus K, Siemens, München, Bayern, Tyskland). Etter inkubering i 10-14 dager ble kolonier dannet fiksert med metanol og farget med 1% krystallfiolett. Bare kolonier bestående av mer enn 50 celler ble tellet. Dataene ble montert lineær-kvadratiske modellen ved hjelp av Sigmaplot programvare, hvor overlevelseskurver ble generert og Radiosensitivity parametre ble beregnet. Forsøkene ble gjentatt tre ganger
Måling av VEGF nivå
Nivået av VEGF secreation av A549-celler ble evaluert ved human VEGF-ELISA-sett (R 0,05 ble betraktet som signifikant
.
