Abstract
Cancer stamceller (cscs) blir betraktet som en undergruppe av bulk tumor ansvarlig for initiering og opprettholdelse av sykdommen. Flere overflatecellemarkører har nylig blitt brukt til å identifisere cscs. Blant dem er CD133, som uttrykkes ved hematopoetiske stamceller så vel som embryonale stamceller og forskjellige krefttyper. Vi har nylig isolert og kultivert CD133 positiv [CD133 (+)] celler fra ulike kreftcellelinjer ved hjelp av en NASA utviklet Hydrodynamisk Fokusering bioreaktor (HFB) (Celdyne, Houston, Texas). Til sammenligning, en annen bioreaktoren, ble det roterende cellekultursystem (RCC) fremstilt av Synthecon (Houston, TX) anvendt. Både HFB og RCC bioreaktorer simulere aspekter av hypogravity. I vår undersøkelse økte HFB CD133 (+) cellevekst fra forskjellige cellelinjer i forhold til RCC fartøyet og til normal tyngdekraft kontroll. Vi observerte en (+) 15-gangers spredning av CD133 (+) cellulær fraksjon med cancerceller som var dyrket i 7 dager ved optimaliserte betingelser. Den RCC fartøyet i stedet ga en (-) 4,8-gangers reduksjon i CD133 (+) cellulær fraksjon i forhold til den HFB etter 7-dagers dyrking. Interessant, fant vi også at hypogravity miljøet i HFB sterkt sensitivisert de CD133 (+) kreftceller, som normalt er resistente mot cellegift behandling, for å bli utsatt for ulike kjemoterapeutika, banet vei til mindre giftige og mer effektiv kjemoterapeutisk behandling i pasienter. For å kunne teste effekten av cytotoksiske midler in vitro før deres bruk i klinisk setting på kreftceller samt på kreftstamceller kan bane vei til mer effektive kjemoterapeutiske strategier hos pasienter. Dette kan være et viktig fremskritt i den terapeutiske valg av onkologiske pasienter, noe som åpner for mer målrettede og tilpassede kjemoterapiregimer samt for høyere responsrater
Citation. Kelly SE, Di Benedetto A, Greco A, Howard CM , sollars VE, Primerano DA, et al. (2010) Rapid Utvalg og spredning av CD133 (+) Celler fra Kreftcellelinjer: Kjemoterapeutiske implikasjoner. PLoS ONE 5 (4): e10035. doi: 10,1371 /journal.pone.0010035
Redaktør: Annarosa Leri, Harvard Medical School, USA
mottatt: 10 februar 2010; Godkjent: 16 mars 2010; Publisert: 08.04.2010
Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Public Domain erklæring som fastslår at en gang plassert i det offentlige rom, dette arbeidet kan fritt kopieres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål
Finansiering:. Denne forskningen ble gjennomført med midler mottatt delvis av celledifferensiering og Utviklingssenter (CDDC) på Marshall University, NIH- CA138510, NIH-CA140024, NIH-Cobre 5P20RR020180 (til PPC); West Virginia NASA Space Grant Consortium (til S.K. og J.V.V.); WV-INBRE 5P20RR016477 (til D.P.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
neoplasmer kan sees på som vev som består av en heterogen populasjon av celler som er forskjellige i biologiske egenskaper og potensial for selvfornyelse [1]. Den klonal natur av visse ondartede svulster er vel etablert [2]. Ifølge den modellen av klonal utviklingen av tumorceller, er kreft dannet gjennom akkumulering av genetiske endringer i cellene, og gradvis seleksjon av kloner [3], [4]. Derfor er svulsten anses som unormalt vev som stammer fra en enkelt celle ved kontinuerlig akkumulering av genetiske feil og diverse epigenetiske endringer. Imidlertid har flere forsøk utført i løpet av de siste tiårene har vist seg at ikke alle tumorcelle er en tumor initiere celle (T-IC), og at så mange som ti
6 murine eller humane tumorceller er nødvendig for å transplantere en ny tumor fra en eksisterende [4], [5], [6], [7]. Dette bevis antydet muligheten for at tumorceller kan eksistere i en hierarkisk tilstand hvor bare et lite antall celler som besitter tumor initiering potensial. Nyere data fra både hematologiske ondartede sykdommer og faste tumorer har antydet at det er bare mindre populasjoner av celler i hver malignitet som er i stand til startfasen som er de kreft stamceller (CSC) [4], [5], [6], [ ,,,0],7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Disse cellene synes å være i stand til asymmetrisk fordeling og selvfornyelse, og er bare en mindre brøkdel mellom hoveddelen av mer differensierte celler i tumoren [16], [17], [18].
Nylig cscs har blitt studert i forskjellige primære tumortyper for å utvikle CSC-spesifikke terapier [6], [11], [19], [20], [21]. Interessant, visse tumorer er svært motstandsdyktig mot kjemoterapi og andre former for behandling, og selv om aggressive behandlinger ødelegger de fleste kreftceller, en liten fraksjon av cellene overlever og ofte regenerere inn i enda større masser av tumorceller [22], [23] , [24]. Effektiv behandling for kreftpasienter krever en grundig forståelse av mekanismene som fører til tumorutvikling og resistens.
Den nylige oppdagelsen av cscs har spilt en sentral rolle i å endre vårt syn på kreftutvikling og kjemoterapi. Cscs antas å være ansvarlig for dannelse og vekst av neoplastisk vev. De cscs er naturlig resistente mot de fleste aktuelle kjemoterapi på grunn av deres hvilende natur. Dette kan forklare hvorfor tradisjonelle kjemoterapi kan virke reduserende på flertallet av tumoren bulk men mislykkes i å utrydde den i sin helhet, slik at eventuell gjentagelse [1], [11], [17], [18], [22]. Cscs er mer motstandsdyktig mot behandling ikke bare sekundært til quiescence, men også på grunn av økt ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner og for legemiddelavlevering transportører. Kreft behandlinger tilgjengelig i dag for det meste utnytte proliferative og metastatiske potensialer av kreftceller; derfor er de fleste av behandlinger rettet mot hurtig delende celler og ved molekylære mål som utgjør hoveddelen av tumoren. Dette kan forklare det manglende behandlinger for å utrydde sykdom eller for å forhindre tilbakefall av kreft. I tillegg, hvis et stoff påvirker veksten av bare en mindre populasjon av celler, vil det være bare en minimal reduksjon i veksten av tumoren på kort sikt.
Teoretisk, identifisering og karakterisering av cscs kan tillate utvikling av behandlingsmetoder som er rettet mot kreftstamceller i stedet for raskt dele celler i kreft.
Langvarig eksponering av mennesker og forsøksdyr til de endrede gravitasjonsforhold romferd har negative effekter på ulike cellulære systemer. Effektene av hypogravity miljø på tumorvekst og kreftutvikling er ennå ukjent, og dette forskningsfeltet fortsatt mangler systematisk undersøkelse på hypogravity indusert genekspresjon, som er nøkkelen informasjon som er nødvendig til slutt utfolde mekanismen bak hypogravity-indusert sykdommer. For dette formål har vi studert effekten av simulert hypogravity på humane osteosarkom-celler dyrket i NASA-utviklet hydrofocusing bioreaktor (HFB) og i det roterende cellekultursystem (RCC). Ulike design av roterende vegg fartøy har blitt brukt til å skape en tredimensjonal kultur miljø med variabel skjærspenninger og hypogravity simulere at i verdensrommet [25]. Den HFB (Celdyne, Houston, Texas) utviklet av NASA på Johnson Space Center, er en væske fylt kuppel, som roterer på et angitt hastighet og har en konisk spinner å gi en unik hydrofocusing evne som vil gi rom for en ekstremt lav-skjær kultur miljø og en nylon gass overføring membran [25]. Den RCC består av en horisontalt rotert kulturbeholder oksygenert med en flat silikongummi gassoverføringsmembran [26]. NASA-designet HFB bioreaktor og RCC har blitt brukt på jorda og i verdensrommet for å muliggjøre etterforskerne å bruke modellerte eller faktiske hypogravity henholdsvis å studere rollen av tyngdekraften på dannelsen av tredimensjonale pattedyrcellevevet modeller og produksjon av bio-produkter [25], [27], [28], [29], [30], [31].
i denne studien viser vi at kreft stamceller blir stimulert til å spre seg når de dyrkes i hypogravity forhold produsert av HFB og at reduksjon av tyngdekraften simulert i HFB sensitizes cscs til kjemoterapeutika.
Resultater
Osteosarkom stilk-lignende celler sprer i Hydro-Fokusering bioreaktor ( HFB), men ikke i roterende cellekultursystem (RCC)
modellerte hypogravity er en tilstand i hvilken cellene er i konstant fritt fall, og i hvilken de er i stand til å vokse i en forankringsuavhengig måte. Siden effekten av hypogravity på svulster er ukjent, tenkte vi å undersøke effektene av modellert hypogravity i fravær av skjær stress på vekstevnen i tumorceller med ulik embryonale opprinnelse. Vi har benyttet en HFB utviklet av NASA ved Johnson Space Center, som er sammensatt av en 50 ml væske fylt kuppel som roterer med en bestemt hastighet og som har en innvendig konisk spinneren som hydro-fokuserer cellekulturen slik at for en lav-skjær- miljøet.
til vår overraskelse har vi funnet at når et kjent antall SAOS-2-celler ble sådd ut i den HFB, bare en liten brøkdel av disse cellene overlevde behandlingen, uavhengig av celletettheten podet i bioreaktoren . Figur 1A viser at antallet levedyktige SAOS-2-celler dyrket i 5 dager i HFB ble dramatisk redusert.
A) Trypan blå eksklusjon legemer av Saos-2-celler (osteosarcom-celler) og SAOS-2- celler dyrket i HFB, CD133 (+) Saos-2-celler og CD133 (+) SAOS-2-celler dyrket i HFB, og av CD133 (+) Saos-2-celler og CD133 (+) SAOS-2-celler dyrket i normal gravitasjon tilstand. Grå linjer indikerer det antall celler som er lagt inn i styre på dag-1. Svarte striper angir antall levedyktige celler gjenvunnet etter 5 dager med kultur i at dyrking tilstand. B) Lys-feltet kontrast fase bilde (20 x) av 3-D-kultur (kuler) som er dannet fra SAOS-2-celler som ble dyrket i HFB i 5 dager. Nedfelling (øverst til høyre) viser et bilde av CD133 immunfluorescens farging av Saos-2-celler dyrket i bioreaktoren i 5 dager. C) Flowcytometri diagram av CD133 immunfenotypen av Saos-2-celler. En isotype antistoff ble anvendt som en kontroll. D) Trypan blå eksklusjon legemer på en optimalisert eksperiment av HFB kulturen i SAOS-2-celler i HFB etter syv dager. CD133 (+) SAOS-2-celler dyrket i bioreaktoren ble valgt ut og proliferert 15 ganger etter syv dager. Hvit søyle viser antall Saos-2-celler seeded i HFB. Svarte bilen indikerer antall levedyktige CD133 (+) Saos-2-cellene gjenvunnet etter 7 dager med optimalisert kultur i bioreaktor. Gray bar angir antall CD133 (+) celler i foreldre SAOS-2 befolkningen. Dataene er representative for tre separate eksperimenter som ga sammenlignbare resultater.
Interessant SAOS-2-celler dyrket i bioreaktoren dannede cellekuler og syntes å være betydelig mindre enn Saos-2-celler dyrket i retter og høstet ved trypsinbehandling (data ikke vist). Figur 1B viser et 20 x lysende felt bilde av kuler dannet fra SAOS-2-celler som ble dyrket i HFB i 5 dager. Celler ble fjernet fra reaktoren HFB og bildene ble tatt umiddelbart ved hjelp av et invertert mikroskop ved bruk av kontrast fase.
På grunn av deres åpenbare forandring i morfologi og evne til å danne kuler i HFB miljøet og fordi andre har vist nærvær av CD133 (+) celler i løpet av primære bensarkomer, så vel som osteosarcom cellelinjene MG-63, OS-521, 0S-01-187, OS-99-01, og Saos-2 og den kondrosarkom cellelinje CS-828 [ ,,,0],32], [33], har vi antatt at disse HFB valgt cellene ble CD133 (+). For å teste denne hypotesen vi immunophenotyped disse cellene med et antistoff rettet mot CD133 (Miltenyi, Tyskland), og fant at HFB valgt celler var 100% positive til CD133, en typisk stamcelle markør av mesenchymale opprinnelse (figur 1B, innfelt panel og figur 1C ). Siden Saos-2-celler utvinnes fra bioreaktor var alle CD133 (+) (98,8%) (figur 1C), ønsket vi å finne ut om CD133 (+) celler ikke bare overlevd, men også proliferated i hypogravity miljø. For dette formål har vi valgt CD133 (+) cellene fra de SAOS-2 eller HOS cellelinjer ved hjelp av et MACSorting system og utfordret disse CD133 (+) celler til en 5-dagers kjøring i HFB. Interessant, SAOS-2-celler eller HOS MACSorted med et antistoff mot CD133 og dyrket i bioreaktoren i 5 dager økte i antall, ved to ganger (figur 1A). Figur 1A viser trypanblått eksklusjon legemer på CD133 (+) Saos-2-levedyktige celler gjenvunnet etter 5 dager med kultur i bioreaktor.
Etter noen forsøk med cellekultur optimalisering, var vi i stand til å oppnå en 15-gangers økning i proliferasjon av CD133 (+) cancer stilk-liknende celler fra de parentale Saos-2-celler i løpet av en syv dagers periode ved å stanse reaktoren hver 24 timer og forsiktig blanding av kulturen 10 ganger på en ortogonal måte over en periode på ett minutt, som er tillatt for omfordeling av media i kuppelen og blanding av næringsstoffet med prolifererende celler (figur 1D). Figur 1D viser at etter en optimal protokoll for cellekultur i HFB, er det mulig å velge og til å spre en bestemt populasjon som inneholdes i SAOS-2 opphavelige cellelinje. Lignende resultater ble oppnådd ved hjelp av ulike andre kreftcellelinjer av ulik vev opprinnelse og som uttrykker en variabel mengde av CD133 markør (HOS, U2OS, T98G, U87MG, Du145, LNCaP, WI38, H23, Hep3b, Hela, Mewo, HO-1 celler, HN12 og HN30), se tabell 1, og data ikke vist.
en annen bioreaktor som simulerer hypogravity, 50 ml roterende cellekultur system (RCC) [26] produsert av Synthecon (Houston, TX), ble brukt til å sammenligne resultatene som genereres ved hjelp av HFB. I et parallelt forsøk hvor vi sås et likt antall av Saos-2-celler i den samme vevskulturinkubator med identiske betingelser for rotorhastighet, CO2, temperatur, og beholdervolum (50 ml), økte HFB CD133 (+) cellevekst fra SAOS-2-celler i forhold til RCC fartøyet og til jord tyngdekraft kontroll. 5 x 10∧6 SAOS-2-celler ble sådd ut i HFB eller RCC bioreaktorer av hvilken 350000 (7%) ble CD133 (+) og 4.650.000 CD133 (-) (tabell 2). Kulturmedier, oksygenering, hastighet, temperatur og CO
2 ble holdt gående konstant for de to kultursystemer og i den samme inkubator for en 7-dagers løp. Etter en 7-dagers kjøring, ble fartøyene høstet og cellene ble omsatt med et antistoff mot fluoresceinated CD133 (Miltenyi, Tyskland) og tellet ved bruk av en BD Facs Aria strømningscytometer. En isotype antistoff ble anvendt som kontroll. Fra sammenligning av de to reaktor kulturene viste vi at en (+) 15-ganger økning i CD133 (+) celler nummer (5,370,960 CD133 + celler) ble oppnådd ved anvendelse av HFB på en 7-dagers kjøring. Ingen spredning av CD133 (+) celler ble observert i kulturen avledet fra RCC kulturen fartøyet. Den RCC dyrkings-beholderen viste i stedet en drastisk reduksjon i CD133 (+) cellepopulasjonen [(-) 4,8 gangers nedgang] fra antallet CD133 (+) celler utsådd i bioreaktorer på dag-0 (tabell 2). Faktisk er antallet Saos-2-CD133 (+) celler ble redusert fra 350 000 til 72 800 i en 7-dagers kjøring i RCC, mens den HFB dyrket SAOS-2 CD133 (+) celler øket fra 350.000 til 5.370.960 i løpet av en tilsvarende periode av tid.
på grunn av dette dramatisk forskjell i veksten av Saos-2 CD133 (+) celler i to bioreaktorer genererer hypogravity (HFB og RCC), ønsket vi å verifisere om pH kan være en variable forårsaker effekter på cellevekst observert. Derfor har vi målt pH i mediet av HFB og RCC bioreaktorer holdt i den samme inkubator med et CO
2 nivået satt til 5% og en konstant temperatur på 37 ° C før og etter en kjøring av 7-dager. Vi sammenlignet pH i media fra HFB og RCC fartøy med kondisjonert medium av kontrollceller dyrket i en petriskål i jorden gravitasjon tilstand versus unspent D-MEM medium. Ingen statistisk signifikant forskjell ble funnet mellom de forskjellige cellekulturbetingelser ved å gjenta forsøkene tre ganger. Faktisk, ubrukt medium viste en pH-verdi på 7,82 ± 0,04. Medium fra kontroll Saos-2-celler dyrket i en petriskål i normale gravitasjonsbetingelser viste en pH-verdi på 7,96 ± 0,23; medium fra Saos-2-celler dyrket i HFB hadde en pH på 7,71 ± 0,23; og medium fra Saos-2-celler dyrket i RCC bioreaktoren viste en pH-verdi på 7,9 ± 0,11, noe som viser at de forskjellige veksten av CD133 (+) Saos-2-celler som ble observert mellom RCC og HFB fartøyer var ikke på grunn av endringer i pH i dyrking media.
osteosarkom cellene dør ved apoptose i Hydro-Fokusering bioreaktor (HFB)
Siden bare en liten brøkdel av osteosarkom SAOS-2 samt HOS-celler plassert i HFB cellen kultursystemet ble gjenvunnet etter 3 eller 5 dagers dyrking, testet vi om disse cellene ble fjernet fra den opprinnelige populasjonen ved å få dem til å gjennomgå apoptose. Derfor har vi sammenlignet priser av apoptose av Saos-2 celler dyrket i HFB for 3 og 5 dager til MACSorted CD133 (+) celler dyrket i HFB for 3 og 5 dager.
For å oppnå dette har vi analysert SAOS-2-celler dyrket i 3 dager eller 5 dager i bioreaktoren og fant at SAOS-2-celler dyrket i HFB i 3 eller 5 dager dø ved apoptose som vist ved en strømningscytometrisk analyse av Annexin-V og propidium jodid flekker av prøvene (figur 2 B og D). 24% av cellene ble funnet i apoptose etter 3-dagers dyrking i HFB. Interessant, fraksjonen av celler dør ved apoptose økte til 62% etter 5 dagers dyrking i HFB, noe som bekrefter den første observasjon (figur 1). Viktigst, prøver av CD133 (+) MACSorted celler dyrket i HFB i 5 dager ikke viser en slik økning i apoptose av Annexin V-farging sammenlignet med kontrollprøven (figur 2E og F). Under de samme dyrkningsforholdene i den HFB, den CD133 (+) celler prolifererer, mens CD133 (-). Cellene dør istedenfor ved apoptose
A) Annexin V-farging av SAOS-2-celler dyrket i 1-G i 3 dager. Analysen gjør det mulig å skille i diagrammet mellom levende celler (nedre venstre kvadrant), tidlig apoptotiske celler (nedre høyre kvadrant), apoptotiske celler (øvre høyre kvadrant) og nekrotiske celler (øvre venstre kvadrant). B) Annexin V-farging av Saos-2-celler dyrket i HFB i 3 dager. C) Annexin V-farging av Saos-2-celler dyrket i 1-G i 5 dager. D) Annexin V-farging av Saos-2-celler dyrket i HFB i 5 dager. E) Annexin V-farging av CD133 (+) MACSorted SAOS-2-celler som ble dyrket i 1-G i 5 dager. F) Annexin V-farging av CD133 (+) MACSorted SAOS-2-celler som var dyrket i HFB i 5 dager. G) Relativ caspase-3-aktivitet av Saos-2-celler (befolkningen) dyrket i 5 dager i HFB i forhold til Saos-2-celler (befolkningen) dyrket i statisk 1G tilstand.
Vi har også undersøkt dette fenomen ved å måle aktiviteten av caspaser ved hjelp av en kolorimetrisk caspaser sett som måler aktiviteten av caspaser-3 i prøvene. I henhold til de data som presenteres har vi funnet at SAOS-2-celler (total populasjon) dyrket i HFB i 5 dager, viste en økning på 1,6 ganger i det caspaser-3-aktivitet påvist (figur 2 G), som er et mål på den apoptotiske indeksen i disse cellene.
Stamcelle markør uttrykk øker etter kultur i Hydro-Fokusering bioreaktor
Kanskje den mest spennende evne gitt av den roterende, lav skjær bioreaktor systemet er muligheten til å studere , under kontrollerte betingelser, interaksjonen av celler av en gitt type eller vekselvirkningen av en celletype med en annen når celler i suspensjon er fri til å danne sine egne assosiasjoner. Vi ønsket å analysere uttrykket nivåer av forskjellige markører knyttet til utvikling av stamceller fra mesenchymale opprinnelse. Ekspresjonen av CD133, CD34, CD38, Osteocalcin, Sparc, Sox-9, RunX-2, Stro-1, CD117 /c-Kit, Oct3 /4, Endoglin, og Inte-SS1 ble undersøkt ved strømningscytometri. Figur 3A viser prosent fluorescerende celler til de forskjellige markørene undersøkt i SAOS-2-celler dyrket i statisk tilstand og etter kultur i HFB i 5 dager. Uttrykket nivåer og antall av celler som uttrykker de undersøkte markører økes etter 5 dagers dyrking i HFB fartøyet i forhold til de celler dyrket i normale gravitasjonsbetingelser. Interessant, SAOS-2-celler dyrket i HFB fartøyet viste den høyeste relative økningen i antall celler positive for Sox-9, CD133, Osteocalcin, Inte-SS1, Sparc, RunX-2, og Endoglin (94,7%, 89,3% , 82%, 81,8%, 81,3%, 79% og 76%, respektivt), sammenlignet med SAOS-2-celler dyrket under en normal gravitasjonsbetingelser. Oct3 /4, CD117, Stro-1, og CD34 viste også en økning i antallet av celletallet positivitet (75,9%, 67,5%, 47,6%, 22,36%, henholdsvis) som sammenligner 1G-vekst i forhold til Saos-2-celler dyrket i simulert hypogravity for 5 dager. Vi fant ingen endring i antall CD38-positive celler i samme forhold. Forsøket ble gjentatt 5 ganger med sammenlignbare resultater og standardavvik ble beregnet og er angitt på diagrammet som feilfelt. Figur 3B viser et eksempel på immunfluorescens farging og positivitet i SAOS-2-celler til CD133, Sox-9, Sparc, og CD117 /c-Kit etter vekst i HFB fartøyet i 5 dager.
A) Diagram av uttrykket nivåer av ulike biomarkører. Lavendel linjer indikerer prosentdelen av celler som uttrykker basalnivåer for de forskjellige markørene i parentale Saos-2-celler dyrket i normal 1-G tyngdekraft tilstand (kontroll). Lilla linjer indikerer prosentdelen av celler som uttrykker de forskjellige markører i CD133 (+) MACSorted SAOS-2-celler som ble isolert fra parentale Saos-2-celler dyrket i normal 1-G tyngdekraft tilstand. Gule linjene viser prosentandelen av celler som uttrykker de ulike markører i CD133 (+) MACSorted Saos-2-celler som ble dyrket i hypogravity tilstand. Lyseblå linjene viser prosentandelen av celler som uttrykker de ulike markører i foreldre Saos-2-celler som ble dyrket i hypogravity betingelse for 5 dager, noe som resulterer i en populasjon av utvalgte og proliferated CD133 (+) Saos-2-celler. B) immunfluorescens farging (40 ×) og positivitet av Saos-2 celler til CD133, Sox-9, SPARC, og CD117 /c-Kit følgende vekst i bioreaktor for 5 dager.
CD133 (+) celler vokse tredimensjonalt i Hydro-Fokusering bioreaktor og danne kuler
SAOS-2 CD133 (+) beriket osteosarkom celler sprer og montere tredimensjonalt som sarcospheres etter 3 dager kultur i bioreaktor , noe som er enda en annen karakteristikk av stamcellevekst. Figurene 4 A og B-show på 10 og 40 × forstørrelse makt, henholdsvis de sarcospheres dyrket i bioreaktor etter 3 dager med kultur i simulert hypogravity. Interessant, CD133 (+) Saos-2-celler som ble dyrket i simulert hypogravity var i stand til å re-etablere den parentale cellelinje (som utgjøres av omtrent 10% ± 6,8 CD133 (+) celler og 90% ± 6,8 CD133 (-) -celler ) etter en periode på en uke når sådd ut på kulturskåler som behandles, noe som gjør det mulig for adherente celler til å feste seg til plast miljø. Figur 4 C og D (henholdsvis 10 × og 40 ×,) viser Saos-2 CD133 (+) celler proliferated og valgt med HFB som senere ble dyrket i å feste vev kultur retter. I den rekonstituerte cellekultur noen ikke-man følger cellene var merkbar; disse kan være stilk-lignende celler, også kjent som kreft stamceller.
A) HFB dyrket SAOS-2-celler osteosarkomceller (CD133 +) er i stand til å formere seg og montere det tredimensjonalt som sarcosheres etter 3-dagers dyrking i bioreaktoren (10 x forstørrelse). B) HFB dyrket SAOS-to osteosarkom celler (CD133 +) er i stand til å spre seg og montere tredimensjonalt som sarcosheres etter 3-dagers dyrking i bioreaktor (40 × forstørrelse). C) HFB dyrket SAOS-2 osteosarcom-celler (CD133 +) podet inn i et bestrålt plast kulturskål, rekonstituere normal vedlagte fenotypen av de parentale Saos-2-celler etter en uke av kultur (10 x forstørrelse). Piler peker på CD133 (+) Saos-2-celler som viser en avrundet og svakt feste fenotype. D) HFB dyrket SAOS-2 osteosarcom-celler (CD133 +) podet inn i et bestrålt plast kulturskål, rekonstituere normal vedlagte fenotypen av de parentale Saos-2-celler etter en uke av kultur (40 x forstørrelse). Pilen peker på CD133 (+) Saos-2-celler som viser en avrundet og svakt feste fenotype.
Det er kjent at stilk-lignende celler vil danne celle kuler når de ble dyrket i ultra lav-feste retter. Vi testet derfor evnen til CD133 (+) SAOS-to MAC-sortert celler til å danne cellegrupper hvis de plasseres i ultra lav-feste retter. Deres evne til å danne klaser var mindre effektiv når sammenlignet med de celler som er blitt dyrket i hydrofocusing bioreaktor, men de fortsatt var i stand til å danne kuler. Figur 5 A og B viser sfærer dannet av SAOS-2 CD133 (+) celler i ultra lav-feste retter. Vi testet også evnen til SAOS-2 CD133 (+) MACSorted og anrikede celler til å feste til vev kulturskåler og for å rekonstituere den parentale Saos-2-cellelinjen. Som forventet, MACSorted CD133 (+) beriket celler plassert i feste vev kultur retter etter å ha vært dyrket i ultra lav-feste retter for to uker, rekonstituert foreldre SAOS-2 cellelinje etter en uke med kultur ved å feste til parabolen, manifestere en utflatet og differensierte fenotype over tid. Figur 5C og D viser adherente Saos-2-celler avledet fra CD133 (+) MACSorted celler dyrket i adherente vevskulturskåler. Figur 5 E viser Saos-2-cellelinje rekonstruert etter 10-dagers inokulering av CD133 (+) beriket celler i følge vev kultur retter.
A) MACSorted CD133 (+) Saos-2-celler montere tre- dimensjonalt som sarcosheres etter 2 uker med kultur i ultra lav-feste retter (20 × forstørrelse). B) Et annet eksempel på MACSorted CD133 (+) Saos-2-celler som danner Sarco-kuler etter 2 uker med kultur i ultra lav-feste retter (10 × forstørrelse). C) SAOS-to osteosarkom celler som stammer fra tredimensjonale kulturer dyrket i ultra lav-feste retter seeded inn knytter retter viser en tilhenger en differensiert fenotype etter 3 dager. D) SAOS-to osteosarkom celler som stammer fra tredimensjonale kulturer dyrket i ultra lav-feste retter seeded inn knytter retter viser en tilhenger en differensiert fenotype etter 5 dager. E) Saos-2 osteosarkom celler som stammer fra tredimensjonale kulturer dyrket i ultra lav-feste retter seeded inn feste retter viser en tilhenger og differensiert fenotype etter 10 dager.
En annen indikasjon på at to forskjellige populasjoner er identifiserbare i SAOS-2-cellelinjen er det bevis for at CD133 (+) MACSorted SAOS-2-celler har forbedret evne til å vokse i bløt agar i forhold til de parentale celler. Cellene ble sådd ut i 6-brønns plater som utfører 6 replikater av hver forsøkspunkt. Samme antall SAOS-2-celler og av CD133 (+) SAOS-2-celler (5 x 10
3 celler /brønn) ble sådd ut i 6 kopier inn i en seks-brønners skål. Effektiviteten av CD133 (+) SAOS-2-celler til å vokse i myk agar og å montere i tredimensjonale strukturer er mye høyere enn den til parentale Saos-2-celler. Seks hundre og førti ± 240 kolonier ble talt fra soft-agar seks-brønns retter seeded med CD133 (+) SAOS-2 beriket celler sammenlignet med bare 20 ± 12 kolonier regnet fra den myke-agar retter seeded med CD133 (- ) SAOS-2-celler. Interessant nok var 120 ± 80 kolonier telles fra de myke-agarskåler podet med den parentale Saos-2-celler, noe som tyder på at evnen til å danne kolonier i myk-agar kan være på grunn av tilstedeværelsen av en fraksjon (gående, omtrent 10% ± 6.8) av stilk-lignende celler i SAOS-2-cellelinjen vi har i vårt laboratorium (tabell 3). Figur 6 viser et eksempel på en myk-agar assay utført med den parentumorcellelinje (figur 6A) eller med CD133 (+) anriket fraksjon av Saos-2-celler (Figur 6B). De parentale Saos-2-celler som dannes kuler, men med meget lav effektivitet når sammenlignet med den anrikede CD133 (+) celler.
A) Kontrastfasemikroskopi av et myk-agar assay av parentale Saos-2-celler. B) Kontrastfasemikroskopi av et myk-agar assay av HFB CD133 (+) proliferert SAOS-2-celler. C) propidiumjodid flowcytometri analyse av Saos-2-celler dyrket i en kultur-G sorteres etter sin CD133 status som viser to distinkte populasjoner: den CD133 (+) og CD133 (-) celler med en annen cellesyklus-profil. D) Immunfenotype av Saos-2-celler dyrket i 1-G versus HFB kultur som viser at SAOS-2-celler dyrket i 5 dager i simulert hypogravity inneholde flertallet av celler farget for Ki-67 og derfor i S-fasen av cellecyklus
Ytterligere bevis på at det er to distinkte populasjoner i SAOS-2-cellelinjen, noe som ser ut til å være sammensatt av CD133 (+) og. (-) celler, er at disse to forskjellige populasjoner har en tydelig cellesyklus profil. Vi utførte en flowcytometri analyse av Saos-2-celler dyrket i 1G kultur og fant at SAOS-2 CD133 (+) celler, som ble sortert ved sin CD133 status og farget med propidiumjodid, hadde en annen cellesyklus-profil med hensyn til CD133 (+) befolkning. Figur 6C viser en representativ strømningscytometrisk analyse av Saos-2-celler som viser at den CD133 (-) SAOS-2-populasjonen var 13,8% av celler i G2 /M-fasen av cellesyklusen, mens CD133 (+) celler, viste en økt fraksjon (49%) av celler i G2 /M-fasen av cellesyklusen. Sammenlignbare resultater ble oppnådd i parallelle og gjentatte forsøk.
Interessant, Saos-2-celler dyrket i bioreaktoren i 5 dager og farget med et anti-CD133 (Miltenyi, Tyskland) og formeringen markeringen anti-Ki-67 vist økte proliferasjonen av cellene i forhold til de SAOS-2-celler dyrket i 1G kulturer. Figur 6D viser et representativt flowcytometri analyse av SAOS-2-celler som viser at cellene dyrket i HFB spre seg ved en annen hastighet enn den totale SAOS-2 cellepopulasjon. Faktisk er den fraksjon av Saos-2-CD133 (+) celler, som også er positiv i Ki-67, økes fra 14,27% til 53,98% sammenligner-celler dyrket i 1G-vekst i forhold til disse celler dyrket i 5 dager i HFB simuleres hypogravity betingelse hhv. Sammenlignbare resultater ble oppnådd i parallelle og gjentatte forsøk.
simulert hypogravity øker apoptose og sensitizes kreft stamceller til kjemoterapi
cscs antas å være ansvarlig for å initiere og opprettholde sykdommen. Noen typer tumorer er svært motstandsdyktig mot kjemoterapi og andre former for behandling.
