Abstract
Denne studien hadde som mål å finne ut sammenhengen mellom HIF-1α og MIR-27a uttrykk og å evaluere effekten av hemming av HIF-1α uttrykk på MIR-27a uttrykk og stoffet motstand i magekreft ( GC). I den foreliggende studien ble sanntids-PCR og Western blot utføres for å påvise ekspresjon av HIF-1α i GC vev og cellelinjer. Deretter ble OCUM-2MD3 /L-OHP celler transfektert med HIF-1α-siRNA, en Mir-27a etterligne eller pcDNA-HIF-1α, og celleoverlevelse ble bestemt via MTT analysen. Uttrykket av HIF-1α, MIR-27a, og MDR-relaterte gener ble målt via sanntid-PCR og Western blot. Chip og doble luciferase aktivitetsanalyser ble utført for å vurdere transcriptional regulering av HIF-1α og MIR-27a. Resultatene viste at transfeksjon med HIF-1α-siRNA markert reduserte nivåene av MIR-27a, noe som resulterer i dramatisk forbedret inhibering av formeringshastigheten av OCUM-2MD3 /L-OHP celler. Sammenlignet med ikke-transfekterte celler, ble overlevelsen betydelig redusert i cellene transfektert med HIF-1α-siRNA etter behandling med L-overhead. Cellen overlevelse var signifikant økt i OCUM-2MD3 /L-OHP celler transfektert med MIR-27a etterligne, mens HIF-1α overekspresjon ikke resulterte i noen klar endring i celle overlevelse. Resultatene av den dobbelte luciferase aktivitetsanalysen viste at HIF-1α forbedrer den transkripsjonelle aktivitet av miR27a promoteren i celler transfektert med et plasmid inneholdende reporter oppstrøms promoterregionen av miR27a sammen med pcDNA-HIF-1α. ChIP analyse antydet at HIF-1α bindes direkte til promoter-regionen i miR27a. Hemming av HIF-1α eller miR27a uttrykk redusert MDR1 /P-gp, LRP, og BCL-2 uttrykk i OCUM-2MD3 /L-OHP celler. Derfor fant vi ut at HIF-1α er nært forbundet med MDR i GC og at HIF-1α kan undertrykke MDR1 /P-gp, LRP og BCL-2 uttrykk ved å hemme MIR-27a uttrykk
Citation. Zhao Q, Li Y, Tan Bb, Fan LQ, Yang Pg, Tian Y (2015) HIF-1α induserer multiresistens i Gastric kreftceller ved å fremkalle MiR-27a. PLoS ONE 10 (8): e0132746. doi: 10,1371 /journal.pone.0132746
Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES
mottatt: 05.01.2015; Godkjent: 17 juni 2015; Publisert: 20 august 2015
Copyright: © 2015 Zhao et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd. den Provincial Natural Science Foundation i Hebei-provinsen (No. H2013206311 til Qun Zhao)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er blant de vanligste kreftformer, forårsaker alvorlig skade på verdensbasis [1, 2] Etter år med teknologiske fremskritt i diagnostikk og behandling av GC, har sin forekomst og dødelighet falt over hele verden, men er fortsatt høy i asiatiske land [3, 4]. For tiden, er mave reseksjon den eneste tilgjengelige metode for å kurere GC. Imidlertid er det vanskelig å oppnå en fullstendig herding til tross for kirurgisk fjerning av tumoren fordi de fleste pasienter som lider av avansert GC ved diagnose [5, 6]. Derfor spiller kjemoterapi en svært viktig rolle i den omfattende behandling av GC. Selv om kjemoterapi sterkt utviklet med hensyn til behandling av avansert GC, [7, 8] prognosen for GC fortsatt utilstrekkelig, med et 5 års overlevelse på mindre enn 30% [9]. Denne prognosen er først og fremst på grunn av multiresistens (MDR) av GC-celler. MDR i GC ofte fører til svikt av kjemoterapi [10-12]. Derfor er det et presserende behov for å utvikle nye lovende terapeutiske strategier for å effektivt redusere MDR i GC.
Oksygenmangel er utbredt i solide svulster og er forbundet med en rekke biologiske funksjoner. Foreløpig hypoksi-induserbar faktor (HIF) -1α anses å være nært forbundet med hypoksi. HIF-1α er sterkt uttrykt i en rekke ondartede svulster [13, 14] og fungerer som en viktig faktor for å regulere tilpasning av tumorceller til hypoksi [15]. HIF-1α er blitt foreslått å være nært forbundet med GC MDR [16, 17]. Det er imidlertid uklart hvilken vei formidler rollen som HIF-1α i GC MDR.
I de siste årene, rolle microRNAs (miRNAs) i kreft har blitt et allment undersøkt mekanisme startfasen og behandling. MIR-27a, et medlem av miRNA-familien, har vist seg å påvirke MDR av GC [18]. Videre er ekspresjon av MIR-27a økt i et hypoksisk miljø [19]. Disse funnene tyder på at HIF-1α kan regulere uttrykket av MIR-27a og påvirke GC MDR. Men de konkrete reguleringsmekanismer er ennå ikke klarlagt. Denne studien viste at ekspresjon av HIF-1α og MIR-27a var signifikant oppregulert i GC vev og cellelinjer, spesielt resistente cellelinjer.
Transfeksjon med en bestemt liten interfererende RNA for å blokkere endogen HIF -1α resulterte i en reduksjon i MIR-27a ekspresjon og lindring av MDR i GC-cellelinjer. Disse nye funnene tyder på at hemming av HIF-1α uttrykk undertrykker transkripsjon av MDR-relaterte gener MDR1 /P-gp, LRP, og BCL-2 for å dempe MDR av GC celler ved å undertrykke MIR-27a uttrykk.
Materialer og metoder
1.1 Materialer
Gastric cellelinje OCUM-2MD3 var fra professor Masakazu Yashiro i Japan Oita Medical Surgery [20]. Den stabile resistent cellelinje OCUM-2MD3 /L-OHP2 ble innhentet via dyrking og utvalg av vår forskningsgruppe. GSE-en cellelinje ble kjøpt fra Celle Resource Center på Shanghai Institutes for Biological Sciences av den kinesiske Academy of Sciences. RPMI 1640 kulturmedium og trypsin ble kjøpt fra Gibco Selskapet; Trizol reagent og Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens ble kjøpt fra Invitrogen. Omvendt transkripsjon kit og fluorescens-kvantitativ PCR-reagenser ble oppnådd fra Promega Corporation. PCR primere og små interfererende RNA ble syntetisert ved Shanghai Biological Engineering Company. Proteinet utvinning kit ble hentet fra Beyotime Company, Kina. Primære antistoffer mot HIF-1α, MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, BCL-2, TS eller GAPDH ble kjøpt fra Santa Cruz. MTT ble oppnådd fra Sigma. Vår studie ble godkjent av etisk komité av den fjerde Affiliated Hospital of Hebei Medical University.
1,2 Klinisk prøveopparbeidelse
Alle 65 pasienter med GC ble valgt etter gastrisk reseksjon og patologisk bekreftelse på fjerde Hospital of Hebei Medical University, inkludert 42 menn og 23 kvinner i alderen 60,5 ± 8,1 år som ikke hadde fått preoperativ strålebehandling eller cellegift. Kreft og para-karsinom vev (ca 1,0 cm x 0,5 cm x 0,5 cm) ble tatt fra hver pasient, og prøvene ble raskt frosset i flytende nitrogen og deretter overført til -80 ℃ bevaring. Alle deltakerne signert informert samtykke.
1.3 Cellekultur og transfeksjon
OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L-transparenter og GSE-1 cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin. Spesielt, mediet for de OCUM-2MD3 /L-OHP-celler ble behandlet med L-OHP ved en konsentrasjon på 75μg /ml for å opprettholde sin medikamentresistens fenotype, en uke før kirurgi for å stoppe behandlingen. Cellene ble inkubert i en fuktet 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C
Tre HIF-1α-siRNA sekvenser ble utformet ved hjelp BLOCK-iT RNAi Designer (sekvens. 1: GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt; sekvens 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt; sekvens 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), som hver ble hybridisert med sin komplementære sekvens, og transfektert inn i de respektive OCUM-2 MD3 /L-OHP GC-celler. En ikke-spesifikk siRNA-sekvens (NS-siRNA: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) ble anvendt som en negativ kontroll. Den miR27a mimetiske sekvens var 5′-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 «. Humant full-lengde HIF-1α coden sekvensen ble subklonet inn i vektor pcDNA3.1. pGL3-miR27a-luc, pcDNA-HIF-1α, pGL3-Basic og PRL-TK plasmider ble konstruert og bevart i vårt laboratorium.
GC celler ble sådd i 6-brønners plater i 24 timer før transfeksjon på en densitet på 4 x 10
5 celler /ml. Plasmid vektorer, siRNA eller miR27a ligner ble transfektert inn i GC celler eller resistente celler ved hjelp av transfeksjon reagens Lipofectamine følge produsentens instruksjoner. Deretter ble cellene vasket med serumfritt RPMI 1640 mangler antibiotika. Transfeksjonseffektiviteten ble målt 24 timer senere, etterfulgt av etterfølgende eksperimenter.
1,4 MTT-analysen
GC vev og normale para-karsinom vev ble homogenisert for å fremstille en enkelt cellesuspensjon ved filtrering gjennom en 300 -mesh kobber rutenett. GC cellene fordøyes ved hjelp av 0,02% EDTA-0,25% trypsin ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
4 celler /ml i 96-brønners plater. Når cellene nådde ca 60% samløpet, ble HIF-1α-siRNA transfekterte eller et kjemoterapeutisk stoff (150μg /ml L-OHP) ble brukt. Hver gruppe besto av seks brønner. Deretter, 20 ul av 5 mg /ml MTT ble tilsatt til 4 timer før slutten av forsøket. Cellene ble dyrket i 4 timer, og deretter, kulturmediet ble kastet. Deretter 150 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn, og OD-verdiene ble målt ved 490 nm ved anvendelse av en mikroplateavleser etter risting platen i 15 minutter ved romtemperatur. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
1,5 RNA isolering og kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert ved bruk av Trizol ett-trinns metode, og 2 ug RNA ble brukt for revers transkripsjon for å generere templat cDNA. De relative mRNA-nivåer ble bestemt ved kvantitativ PCR, GAPDH tjente som en intern referanse-genet. PCR-parametrene var som følger: 95 ° C i 5 minutter etterfulgt av 45 sykluser med denaturering ved 94 ° C i 30 s og annealing ved 60 ° C i 30 sek. Primersekvensene ble utformet ved hjelp Primer 5,0 og ble søkt etter spesifisitet. Primersekvensene er som følger: HIF-1α (93 bp): (F) 5′-GACAGCCTCACCAAACAGAG-3 «og (R) 5′-CTCAAAGCGACAGATAACACG-3′; MDR1 (126 bp): (F) 5»-GAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3 «og (R) 5′-ACAATCTCTTCCTGTGACACC-3′; GST-π (151 bp): (F) 5»-ATACCATCCTGCGTCACCTG-3 «og (R) 5′-TCCTTGCCCGCCTCATAGTT-3′; Bcl-2 (98 bp): (F) 5»-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 «og (R) 5′-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3′; LRP (129 bp): (F) 5»-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 «og (R) 5′-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3′; TS (129 bp): (F) 5»-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 «og (R) 5′-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3′; og GAPDH (138bp): (F) 5»-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3 «og (R) 5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3». De kvantitative PCR resultater ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode
1,6 Western blot
vev og celleprøver ble lysert ved hjelp av RIPA lysebuffer. 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,0, 0,2 mM Na3VO4, 0,2 mM fenylmetylsulfonylfluorid og 0,5% NP-40. Like mengder av de proteinprøvene ble separert på 10% polyakrylamid-SDS-geler (SDS-PAGE), og ble elektrooverført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Amersham Pharmacia Biotech). Membranene ble blokkert med 5% BSA i 2 timer og inkubert med det primære antistoff over natten ved 4 ° C. Membranene ble inkubert i 2 timer i et pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff. Mål-båndene ble påvist ved anvendelse av et forbedret kjemiluminescens (ECL) deteksjonssett (Santa Cruz, USA). β-aktin ble benyttet som et endogent gen kontroll. Eksperimentet ble kopiert tre ganger.
1,7 Chromatin immunoutfelling (chip) assay
brikke analyser ble utført i henhold til metoden fra Wang et al. [21]. Celler med forskjellig behandling ble fiksert med 1% formaldehyd i 15 minutter ved værelsestemperatur, og avsluttet ved en sluttkonsentrasjon på 0,125 M glycin. Da celler ble lysert ved bruk av 300 ul lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,5% deoksykolat og proteaseinhibitorer). Cellelysatene ble sonikert i isvannbad under dannelse av kromatin fragmenter på 600 bp, som vurdert ved agarose gelelektroforese. Etter sentrifugering ved 13 000 rpm i 10 minutter, ble supernatantene tatt og pre-erte i 15 minutter ved 4 ° C gjennom inkubering med 30 ul av protein A-Sepharose-kuler og skjærbehandlet laksesperma-DNA. Etter sentrifugering ved 13 000 rpm i 5 minutter, ble supernatantene delt i tre like deler: en for inndata, de to andre for immunopresipitering med eller uten HIF-1α antistoff. Den neste dag, immunkompleksene ble utfelt med protein A-Sepharose-kuler og skjærbehandlet laksesperm-DNA, da kulene ble samlet opp etter å ha vasket to ganger med vaskebuffer I (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 og 2 mM EDTA), fulgt av vaskebuffer II (20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 og 2 mM EDTA) , og vaskebuffer III (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, 0,25 M LiCI, 1% Nonidet P-40, 1% deoksykolat, og 1 mM EDTA), og den endelige vaskebuffer IV (10 mM Tris-HCl, pH 8,1, og 1 mM EDTA). Immunopresipitatene ble eluert med 200 ul elueringsbuffer (1% SDS og 0,1 M NaHCO
3), etterfulgt av inkubasjon ved 65 ° C over natten. Den neste dag, DNA av hver prøve ble isolert, og PCR ble utført for å amplifisere promotor segmenter inneholdende en HIF-1α bindingssted.
1,8 luciferase-analyser
Celler dyrket til 70% konfluens og deretter ble transfektert i tre eksemplarer med pGL3-MIR-27a-luc, pcDNA-HIF-1α eller pGL3-Basic, sammen med PRL-TK. Etter 48 timer med transfeksjon, ble cellene samlet og luciferase-aktiviteten ble målt ved anvendelse av dobbel-luciferase reporter Assay System (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens protokoll. Luciferase aktiviteter PRL-TK ble servert som intern kontroll.
1.9 Statistisk analyse
Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. ANOVA og Dunnetts test ble utført ved hjelp av SPSS 11.5 programvare.
Resultater
1 HIF-1α og miR27a er uttrykt forskjellig mellom mage para-karsinom vev og GC vev
ekspresjon av HIF-1α i GC vev sammenlignet med gastrisk karsinom para-vev ble bestemt ved hjelp QRT-PCR og Western blot, og følsomheten av L-OHP-celler ble bestemt ved hjelp av MTT-analysen. HIF-1α (fig 1A, 1B og 1C, qPCR og Western blot) og miR27a (figur 1D, qPCR resultater) var oppregulert i GC vev sammenlignet med gastric para-karsinom vev. Den MTT analysen viste at celleoverlevelsesraten var større i GC vev enn i mage para-karsinom vev når L-OHP ble lagt til de encellede vev suspensjoner (Fig 1E, histogram resultater).
Klinisk mage vevsprøver, så vel som normale kontroll vev ble oppnådd og underkastet RT-qPCR (A) og Western blotting (B og C) for å bestemme ekspresjon av HIF1α, ble MIR-27a bestemmes av qPCR (D). For RT-qPCR og Western blotting analyser, ble β-aktin brukes til en endogen referanse til standardisere mRNA og protein uttrykk nivåer. Enkeltcellesuspensjon ble fremstilt i kreftvev og de kreft tilstøtende normale vev og dyrket i MTT-analyse. Cellene ble behandlet med kjemoterapeutika (L-OHP, 150μg /ml) når de nådde 80% konfluens og anvendt for MTT-analyse (E). 6 duplikater for hver behandling ble utført. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3). * P. 0,01 sammenlignet med kreft-tilstøtende normalt vev gruppe
2 HIF-1α og miR27a er uttrykt forskjellig mellom en mageslimhinnen epiteliale cellelinje og en GC cellelinje
uttrykk for HIF-1α var den høyeste i OCUM-2MD3 /L-transparenter og OCUM-2MD3 celler, sekvensielt, og var den laveste i GES-1 celler (figur 2A, 2B og 2C, qPCR og Western blot). Videre vises det uttrykk for miR27a den samme trenden, der OCUM-2MD3 /L-OHP celler vises det høyeste uttrykk, etterfulgt av OCUM-2MD3 celler, og GSE-1 celler viste den laveste uttrykk for MIR-27a (fig 2D, qPCR resultater). MTT-analysen viste at når L-OHP ble tilsatt til de tre cellelinjer, OCUM-2MD3 /L-OHP celler utviste den høyeste celleoverlevelsesgrad, etterfulgt av OCUM-2MD3 celler, og at GSE-1-celler oppviste den laveste celleoverlevelse rate (fig 2E, histogram blir resultatet).
Normal kontroll human mageslimhinne epitelcellelinje GES-en samt mage kreft cellelinjer OCUM-2MD3 og OCUM-2MD3 /L-OHP ble utsatt for RT-QPCR (A) og Western blotting (B og C) for å sammenligne ekspresjon av HIF1α in vitro. MIR-27a ble bestemt ved QPCR (D) .For RT-QPCR og Western blotting analyser, ble β-actin brukes som en endogen kontroll for å standardisere mRNA og protein uttrykk nivåer. MTT analysen ble brukt for å bestemme overlevelsen av magekreft cellelinjer etter behandling med L-OHP i cellene i OCUM-2MD3 /L-OHP, OCUM-2MD3 og GSE-1 (E). Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3). * P 0,05 sammenlignet med kreft-tilstøtende normale vev eller GES-1 celler. Bildene som vises er representanter for minst tre uavhengige eksperimenter.
3 HIF-1α-siRNA undertrykker uttrykk for miR27a og narkotika motstand av OCUM-2MD3 /L-OHP celler
Western blot-analyse viste at mRNA og proteinnivåene av HIF-1α redusert i varierende grad i OCUM-2MD3 /L-OHP-celler transfektert med tre par HIF-1α-siRNA, mens HIF-1α ekspresjon ikke ble endret i cellene transfektert med kontroll-siRNA. HIF-1α uttrykk syntes å avta mest bratt, med ca 90%, ved hjelp av HIF-1α-siRNA-2 (fig 3A). Som vist i figur 3B, redusert HIF-1α ekspresjon i disse cellene på en doseavhengig måte, hvor HIF-1α ekspresjon ble redusert med mer enn 95% i celler transfektert med 80 nM HIF-1α-siRNA-2, når HIF- 1α-siRNA-2 ble transfektert ytterligere ved en dose på 20 nM, 40 nM og 80 nM. I tillegg ble den maksimale hemmende virkning påvises 48 timer etter transfeksjon (figur 3C).
OCUM-2MD3 /L-OHP-celler ble transfektert med enten HIF1α-siRNA eller NS-siRNA (A), eller transfektert med 20, 40 eller 80 nM av HIF1α-siRNA-2 (B), eller transfektert med 80 nM HIF1α-siRNA-2 til 24, 48 eller 72 timer (C), og deretter ble cellene oppsamlet for Western blotting analyser for å beregne knockdown effektivitet . MIR-27a nivåer ble bestemt ved qPCR (D). Overlevelsesraten av OCUM-2MD3 /L-OHP ble estimert ved MTT-analyse. (E) Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (N = 3). * P 0,01 sammenlignet med NS-siRNA gruppe
miR27a uttrykk ble betydelig redusert etter transfeksjon av OCUM-2 MD3 /L-OHP celler med HIF-1α-siRNA-2 (Fig 3D). . Den MTT analysen indikerte at celleoverlevelsesraten ble betydelig redusert etter behandling av HIF-1α-siRNA-to-transfektert OCUM-2 MD3 /L-OHP celler med L-OHP sammenlignet med ikke-transfekterte celler (figur 3E).
4 Effekter av miR27a på MDR av OCUM-2MD3 /L-OHP celler
uttrykk for miR27a ble oppregulert i OCUM-2MD3 /L-OHP celler når miR27a ligne var co- transfektert inn i disse medikamentresistente GC-celler som var blitt transfektert med HIF-1α-siRNA (figur 4A). Imidlertid ble ingen signifikant forskjell i uttrykket av HIF-1α påvist i OCUM-2MD3 /L-OHP celler etter transfeksjon (figur 4B og 4C, qPCR og Western blot).
OCUM-2MD3 /L-OHP -celler ble transfektert med miR27a analoger til 48 h (A), og deretter ble cellene oppsamlet, miR27a og HIF1α-nivåer ble påvist ved RT-qPCR og Western blot-analyser (A, B og C). Overlevelsesraten av OCUM-2MD3 /L-OHP ble beregnet ved MTT-analyse (D). Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3). * P. 0,01 sammenlignet med kontrollgruppen
MTT-analysen viste at overlevelsen av OCUM-2MD3 /L-OHP celler ble klart økt etter transfeksjon med miR27a ligne (figur 4D, histogram blir resultatet ).
5 HIF-1α induserer transkripsjon av miR27a i OCUM-2MD3 celler
uttrykk for HIF-1α ble betydelig økt i OCUM-2MD3 celler transfektert med eukaryote ekspresjonsplasmidet pcDNA- HIF-1α i 48 timer (figur 5A). Videre miR27a uttrykk var tydelig oppregulert (Fig 5B). Dermed disse resultatene antydet at HIF-1α er en kritisk faktor som påvirker transkripsjonen av miR27a. Derfor etablerte vi et luciferase reporter-gen plasmid som bærer et 2 kb sekvens oppstrøms for den promoter-regionen i miR27a, som ble ko-transfektert med pcDNA-HIF-1α inn i cellene. DLA data viste at HIF-1α forbedret arrangøren aktiviteten miR27a følgende kotransfeksjonen (Fig 5C). ChIP analyse bekreftet videre at HIF-1α direkte bundet til promoter-regionen i miR27a (figur 5D). Resultatene indikerte at HIF-1α kan fremme transkripsjonen av miR27a i OCUM-2MD3 celler ved direkte binding til promoter-regionen i miR27a.
OCUM-2MD3-celler ble transfektert med pcDNA-HIF-1α, nivået HIF-1α og miR27a ble bestemt ved Western blot og RT-qPCR (A og B) etter 48 timer for transfeksjon. Dual luciferase reporter-analysen ble utført ved kotransfeksjon av reporter plasmid som inneholder den miR27a promoter og pcDNA-HIF-1αin OCUM-2MD3-celler (C), og chip Analysen ble utført for å teste bindingen av HIF-1α til promotoren av miR27a i OCUM -2MD3 celler. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3). * P. 0,01 sammenlignet med pcDNA tom vektorkontroll gruppe
6 Inhibering av HIF-1α ved hjelp siRNA undertrykker ekspresjon av medikament-resistens-relaterte gener
Som vist i figur 6, inhiberingen av HIF-1α dramatisk undertrykket ekspresjon av MDR1 /P-gp, LRP og Bcl-2 i OCUM-2MD3 /L-OHP-celler, men ikke vesentlig endre ekspresjonen av GST-π eller TS. (Fig 6).
OCUM-2MD3 /L-OHP-celler ble transfektert med 80 nM av HIF1α-siRNA eller ikke-målrettede siRNA eller bare behandlet med Lipofectamine 2000 i 48 timer, deretter ble underkastet RT-qPCR (A) og Western blotting (B, C) for å oppdage uttrykket nivåer av MDR1 /P-gp, LRP, Bcl-, GST-π og TS. β-aktin ble benyttet for en endogen referanse til standardisere protein ekspresjonsnivåer. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3). * P. 0,01 sammenlignet med ikke-målrettede siRNA gruppe
7 Hemming av miR27a reduserer av resistens relaterte genuttrykk i OCUM-2MD3 /L-OHP celler
miR27a var trykt i multiresistent GC OCUM-2MD3 /L-OHP celler transfektert med anti-miR27a sekvens (fig 7A). Videre, etter denne transfeksjon, ekspresjonen av MDR1 /P-gp, LRP og Bcl-2 ble signifikant redusert, mens ingen signifikant forskjell ble funnet i ekspresjonen av GST-π eller TS (figur 7B, 7C og 7D, qPCR og Western blot). (Fig 7)
OCUM-2MD3 /L-OHP celler ble transfektert med Anti-miR27a (A), uttrykket nivåer av MDR1 /P-gp, LRP, Bcl-, GST-π og TS ble oppdaget ved RT-qPCR (B) og Western blotting (C, D). β-aktin ble benyttet for en endogen referanse til standardisere protein ekspresjonsnivåer. Resultatene ble presentert som gjennomsnitt ± S.D. (N = 3). * P. 0,01 sammenlignet med ikke-målrettede siRNA gruppe
Diskusjoner
Selv om den verdensomspennende forekomsten av GC ser ut til å ha gått ned de siste årene, en høy forekomst av GC vedvarer, alvorlig fare for helsen til folk i Asia [22]. MDR av GC-celler som bidrar til dårlig prognose av GC, hvor oksygenmangel spiller en avgjørende rolle. I denne studien har vi etablert stallen OCUM-2MD3 /L-OHP cellelinje som er motstandsdyktig mot L-OHP. Våre data antyder at det GC vev og cellelinjer som oppviser sterkere medikamentresistens enn normale gastriske epiteliale vev og cellelinjer. Vi fant også at resistente celler utvikle mye sterkere MDR. Våre resultater viste økt ekspresjon av HIF-1α i GC vev og cellelinjer, og det høyeste uttrykk for HIF-1α ble påvist i en multiresistent cellelinje. Derfor foreslår vi at HIF-1α bidrar til utviklingen av MDR i GC-celler.
I HIF-1α-genet koder for et protein som består av 826 aminosyrer med en molekylvekt på 120 kDa [23]. Mange studier har bekreftet at økt ekspresjon av HIF-1α er sterkt assosiert med forekomst og utvikling av svulster [24-28]. Andre studier har antydet at over-ekspresjon av HIF-1α forbedrer de legemiddelresistente egenskaper av en rekke tumorceller [29-32]. I tillegg vår studie viste at GC vev og cellelinjer stille sterkere motstand mot cellegifter enn mage para-karsinom vev og mageslimhinnen cellelinjer. Vi har også oppdaget at de mest potente medikament-resistens i GC-celler. Men de mekanismer som HIF-1α regulerer MDR har ennå ikke klart identifisert i GC-celler. Derfor vi videre undersøkt effekten av HIF-1α på MDR egenskapene til GC celler via gen forstyrrelser og kloningsteknikker. RNA interferens (RNAi) har vist fordeler når det gjelder spesifisitet, effektivitet og holdbarhet for regulering av target-genekspresjon [33]. Våre data indikerer at inhibering av HIF-1α betydelig redusert legemiddelresistens i OCUM-2MD3 /L-OHP celler. Videre demonstrerte vi at legemiddelresistens ble dramatisk øket når pcDNA-HIF-1α, som ble brukt til å overuttrykke HIF-1α, ble transfektert inn i ikke-medikament-resistente cellelinjer GC. Våre resultater indikerer at HIF-1α spiller en viktig rolle i utviklingen av MDR i GC.
Nyere studier har indikert at MDR er nært beslektet med mirnas i tumorer [34-36]. Hu har rapportert at inaktivere MIR-27a kan reversere MDR egenskapene til GC-celler [18]. Videre har det blitt rapportert at MIR-21, MIR-27a, MIR-210 og MIR-181b ble oppregulert via HIF bane i hypoksisk miljø basert på en gen-chip-analyse [19]. I samsvar med våre resultater, ble HIF-1α positivt assosiert med uttrykk for MIR-27a i GC vev og cellelinjer, og hemming av HIF-1α redusert MIR-27a. I motsetning til overuttrykk av HIF-1α indusert ekspresjon av MIR-27a. Disse resultatene indikerte at HIF-1α regulerer ekspresjonen av MIR-27a. Videre vår studie viste at Mir-27a ligner reddet de resistens egenskaper HIF-1a-knockdown celler. Viktigst, HIF-1α binder direkte til og fremmer miR27a transkripsjon, noe som indikerer at HIF-1α regulerer MDR av GC via MIR-27a.
Vi preget uttrykket av gener som er nært forbundet med MDR, inkludert MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2 og TS, før og etter modulasjon av HIF-1α ekspresjon i GC-celler for å belyse mekanismen ved hjelp av hvilken HIF-1α-MIR-27a pathway regulerer MDR av GC . Vi har vist at inhibering av HIF-1α uttrykk redusert ekspresjon av MDR1 /P-gp, LRP og Bcl-2. Uttrykket nivåer av disse genene ble signifikant øket når cellene ble transfektert med MIR-27a ligner, mens uttrykket nivåer av GST-π og TS ikke ble signifikant endret. I henhold til dette funnet, over-ekspresjon av HIF-1 a potent oppregulert ekspresjonen av MDR1 /P-gp, LRP og Bcl-2 i GC OCUM-2MD3 cellelinje. Derfor våre data viser at HIF-1α-MIR-27a veien formidler MDR eiendommer i GC ved å fremkalle MDR1 /P-gp, LRP og BCL-2 uttrykk.
Våre studier viser at HIF-1α og MIR -27a blir oppregulert i GC vev og cellelinjer. HIF-1α fungerer som et oppstrøms regulator av MIR-27a. HIF-1α-MIR-27a signale forbedrer egenskapene til MDR ved å fremkalle uttrykket av MDR1 /P-gp, LRP og BCL-2 i GC. Disse resultatene tyder på at HIF-1α-MIR-27a pathway spiller en avgjørende rolle i initiering av MDR i menneskelig GC, som kan tjene som en roman terapeutisk mål for MDR i GC.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 fil. Data over MTT og Western
doi:. 10,1371 /journal.pone.0132746.s001 product: (ZIP)
