Abstract
Sink protoporphyrin (ZnPP) har vist seg å ha anticancer aktivitet både
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi har nylig vist at ZnPP reduserer β-catenin protein ekspresjon i kreftceller. Denne studien undersøkte de cellulære mekanismene som formidler ZnPP undertrykkelse av β-catenin uttrykk. Vi viser at ZnPP induserer en hurtig nedbrytning av β-catenin protein i kreftceller, som er ledsaget av en signifikant inhibering av proteosomet aktivitet, hvilket antyder at proteosomet degradering ikke direkte står for undertrykkelse. Muligheten for at ZnPP induserer β-catenin eksport ble avvist av den observasjon at det var ingen påviselig β-catenin protein i kondisjonerte mediet etter ZnPP behandling av kreftceller. Videre eksperimentering viste at ZnPP induserer lysosome membran permeabilization, som ble reversert ved forbehandling med et protein transport inhibitor cocktail som inneholder Brefeldin A (BFA) og Monensin. Mer vesentlig, forbehandling av kreftceller med BFA og Monensin dempes den ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin ekspresjon i en treringstrinnet og tidsavhengig måte, noe som indikerer at lysosomet proteinnedbrytingen veien er sannsynligvis involvert i den ZnPP-indusert undertrykkelse av β -catenin uttrykk. Hvorvidt det er krysstale mellom ubiquitin-proteasome system og lysosome vei som kan forklare ZnPP-indusert β-catenin protein degradering er foreløpig ukjent. Disse funnene gir en ny mekanisme for ZnPP sin anticancer handling og avdekke en eventuell ny strategi for målretting β-catenin Wnt signalveien for kreftbehandling
Citation. Wang S, Hannafon BN, Lind SE, Ding WQ (2015 ) Sink protoporphyrin undertrykker β-catenin Protein Expression i humane kreftceller: Potensialet Involvering av lysosome-mediert degradering. PLoS ONE 10 (5): e0127413. doi: 10,1371 /journal.pone.0127413
Academic Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, USA
mottatt: 17 desember 2014; Godkjent: 15 april 2015; Publisert: May 22, 2015
Copyright: © 2015 Wang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av American Cancer Society (CNE-117557) for å WQD, Susan G. Komen for Cure Foundation (KG081083) til WQD, NIH OK-INBRE program ( 3P20RR016478-09S2) til WQD og Oklahoma Senter for Advancement of Science and Technology (HR14-147) til WQD. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
sink protoporfyrin (ZnPP) tilhører en gruppe av kjemiske forbindelser hvor den sentrale ion av fri heme er erstattet med et tungmetall-ion, så som sink, tinn (SNPP) eller kobber (Cupp). På grunn av ZnPP sin strukturelle likhet med den i fri heme, en etablert substrat av antioksidant enzymet heme oksygenase-1 (HO-1), ZnPP virker som en konkurrerende inhibitor for HO-en enzymatisk aktivitet [1]. ZnPP har blitt funnet å ha anticancer aktivitet både
in vitro
og
in vivo product: [2-5], og det er generelt antatt at ZnPP største anticancer-aktivitet er tilskrevet HO-1-inhibering. Imidlertid har eksperimentelle bevis ikke er gitt for å støtte denne antakelsen. Tvert imot, har noen studier antydet at ZnPP er kreft aksjon kan være uavhengig av HO-1 [5,6]. I vår siste rapport, viste vi at verken over-uttrykk eller knockdown av HO-1 i kreft modellsystemer påvirker ZnPP er cytotoksisitet, sterkt indikerer en HO-1-uavhengig handling av ZnPP mot kreftceller. Våre mekanistiske studier videre avdekket at ZnPP er i stand til å raskt og dramatisk undertrykke β-catenin protein uttrykk og aktivitet i kreftceller [7].
Fordi β-catenin er en sentral aktør i den kanoniske Wnt signalveien, som er et vel verdsatt mål-bane for kreftterapi [8], den betydelige undertrykkelse av β-catenin ekspresjon og aktivitet avslører en viktig mekanisme for ZnPP er anticancer aktivitet. En videre forståelse av hvordan ZnPP undertrykker β-catenin uttrykk i kreftceller kan ikke bare hjelpe belyse de cellulære mekanismene for ZnPP er kreft handling, men også gi nye kreft terapeutiske strategier for målretting β-catenin Wnt signalveien.
i denne studien har vi utforsket de cellulære mekanismene for ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin uttrykk i humane kreftceller. Den raske og dramatiske natur av ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin proteinekspresjon antyder sterkt at dette undertrykkelse er hovedsakelig på grunn av p-catenin proteinnedbrytingen. β-catenin proteinnivåer er godt kontrollert av den β-catenin ødeleggelse kompleks som er tett koplet til ubiquitin-proteasom-system [9]. Det er derfor sannsynlig at ubiquitin-proteasome system formidler ZnPP-indusert β-catenin protein degradering. Imidlertid kan andre proteinnedbrytningsbaner, slik som lysosomet-mediert reaksjonsvei proteindegradering [10], også være involvert i denne prosess. I tillegg, kan muligheten for at ZnPP induserer hurtig utførsel av β-catenin fra cancerceller ikke utelukkes. Denne studien undersøkte disse tre mulige mekanismer for ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin uttrykk. Til vår overraskelse, er ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin uttrykk ikke på grunn av økt proteasome aktivitet er heller ikke formidles av utførselen av β-catenin. Våre resultater støtter involvering av lysosome-mediert degradering veien i ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin uttrykk.
Materiale og metode
Material
β-catenin , fosfor-β-catenin (Ser33 /37 /Thr41) og K48 (lysin 48) -linkage spesifikke polyubiquitin antistoffer var fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA). MG132 og Brefeldin A /Monensin cocktail var fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Suc-LLVY-AMC var fra AnaSpec (Fremont, California). Z-ARR-AMC og Z-LLE-AMC var fra Millipore (Billerica, MA). Andre fluorescerende prober var fra Life Technologies (Grand Island, NY). De Corning Spin-X konsentratorer (6 ml) og monensin natrium salt var fra VWR International LLC (Radnor, PA). Den β-actin antistoff og andre kjemiske midler var analytisk klasse og hentet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Cell kultur
A2780 cellelinje (human eggstokkreft) var en slags gave fra Dr. Stephen Howell (University of California, San Diego). Den DU145 cellelinje (human prostatakreft) og MDA-MB-231-cellelinje (human brystkreft) ble anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). A2780-celler ble dyrket i RPMI 1640 medium, og DU145 og MDA-MB-231-celler ble dyrket i DMEM-medium. Både RPMI 1640 og DMEM medier ble supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler ble rutinemessig dyrket i en 75-mm kolbe ved 37 ° C i en fuktig miljø inneholdende 5% CO
2. Alle cellene ble sub-dyrket to ganger i uken og brukes på de ulike eksperimentene som beskrevet i resultatdelen.
Utarbeidelse og anvendelse av ZnPP og SNPP
ZnPP og SNPP ble kjøpt fra Frontier Scientific, Inc. (Logan, UT). Produsentens råd og en tidligere rapport [11] ble fulgt for riktig håndtering av disse forbindelsene. En arbeidsgruppe lager av ZnPP og SNPP var tilberedes for hver enkelt eksperiment. Alle rør som brukes til å fremstille stamløsningen ble dekket med aluminiumsfolie for å unngå lys reaksjon med forbindelsene. Forbindelsene ble først løst i DMSO fullstendig, og ytterligere fortynnet med 50% DMSO i 1 x PBS-buffer før tilsetning til cellekulturmediet. Den endelige DMSO-konsentrasjon i cellekulturmediet var under 0,5% i alle forsøk utført. Kjøretøy ble inkludert som kontroller. Cellene ble behandlet med forbindelsene i indirekte ved dårlige lysforhold og inkuberes i mørke i kortere eller lengre tid før enkelte analyser, i likhet med tidligere rapporter [5,11].
Western blot analyse
Protein-ekspresjon ble analysert ved hjelp av Western blot som vi tidligere beskrevet [12,13]. Celler ble sådd ut på 100 mm kulturskåler og nådde 80% konfluens før behandlingen med ZnPP eller SNPP ved indikerte konsentrasjoner og varigheter. For hel cellelysat ble cellene lysert og sonikert på is i 3 slag (10 sekunder hver gang med 10 sekunder intervall i mellom). Uløselige materialer ble fjernet ved sentrifugering ved 15.000 x g i 15 min. Supernatantene ble oppsamlet for bestemmelse av proteinkonsentrasjonen. For ekstracellulært protein isolasjon, ble cellene behandlet i Hanks «balanserte saltløsning (HBSS) i 1,5 timer. Etter behandling, ble HBSS oppsamlet og konsentrert med Corning Spin-X konsentratorer. Mellom 25 til 40 ug protein ble fylt på hver brønn i en 10% SDS-PAGE-gel, overført til en PVDF-membran, og blottet med antistoffer mot spesifikke β-catenin, fosforylert β-catenin, polyubiquitinated proteiner og β-aktin.
Co-immunutfelling
Co-immunoutfelling (ko-IP) ved hjelp av β-catenin antistoff ble utført som beskrevet tidligere [13]. Kort sagt ble cellene vokser i 100 mm skåler ble vasket med PBS og innhøstet ved å tilsette 150 ul av IP-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF og 1% Triton X -100). Cellene ble ultralydbehandlet i 1 minutt på is, og uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering. Supernatanter ble oppsamlet, og proteinkonsentrasjonen bestemmes. Supernatanter ble pre-klarert av agarose-koblet protein A, og de agarosekuler ble fjernet ved sentrifugering. β-catenin antistoffer ble tilsatt til supernatantene (1: 100 forhold), og reaksjonen ble inkubert ved 4 ° C over natten med forsiktig rotasjon. 50 ul av agarose-koblet protein A ble tilsatt for å fange opp antistoff-proteinkomplekser ved å rotere i 2 timer ved 4 ° C. Kulene (IPS) ble deretter oppsamlet ved sentrifugering ved 2000 x g i 5 minutter. IP-adressene ble solubilisert med 50 ul av 2 x SDS-PAGE-buffer ved blanding og inkubering i 1 time ved romtemperatur. Supernatanten ble samlet opp ved sentrifugering ved 2000 x g i 5 minutter. En parallell immunoutfelling med kanin-IgG ble utført som en kontroll. Både IP-adresser og inngangene ble kokt i 5 minutter og western blot ble utført ved anvendelse av antistoffer mot K-48 linkage spesifikke polyubiquitinated proteiner og β-catenin. β-aktin uttrykk i inngangene ble ble også bestemt.
fluorescens mikroskopisk påvisning av intracellulære ZnPP og lysosome permeabilitet
lysosome permeabilitet ble analysert ved fluorescens mikroskopi via Content Operetta Høy Imaging System fra PerkinElmer ( Waltham, MA). A2780 celler ble sådd ut i Cell Carrier-96 platen fra PerkinElmer (Waltham, MA) ved en tetthet på 10.000 celler per brønn. Førti-åtte timer etter plating ble cellene behandlet med ZnPP eller SNPP eller forbehandlet med Brefeldin A /Monensin (21,1 uM /uM 4) cocktail i 4 timer, etterfulgt av behandling med ZnPP. Mediet ble deretter erstattet med friskt medium inneholdende 2,5 uM akridinoransje (AO, Invitrogen, Carlsbad, CA). Etter 30 minutters inkubering ble cellene vasket tre ganger med HBSS og på under Operetta. Lysosomet permeabiliteten ble målt ved bruk av AO fargings [14]. AO ble oppdaget av eksitasjon ved 500 nm, emisjon på 526 nm for rød, og eksitasjon ved 460 nm, emisjon ved 650 nm for grønt.
Proteasome aktivitetsanalyse
Proteasome aktiviteter ble målt som tidligere rapportert [15]. I korte trekk ble A2780 celler behandlet med ZnPP, SNPP eller MG132 ved forskjellige konsentrasjoner og varigheter. Etter behandling ble cellene vasket med PBS og samlet i PBS. Cellepelletene ble lysert med 250 ul lyseringsbuffer (50 mM HEPES, pH 7,5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl og 1% Triton X-100) per 5 x 10
6-celler etter inkubering ved romtemperatur i 30 minutter og vortex hvert 10. minutt. Lysatene ble deretter sentrifugert og supernatanten ble oppsamlet. Totalt 10 pg av protein for hver prøve ble inkubert med 20 pM fluorogent substrat (Suc-LLVY-AMC, Z-ARR-AMC eller Z-LLE-AMC) i 100 ul analysebuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5 ) ved 37 ° C i 2 timer. Etter inkubering ble fluorescens lese ved 380 nm eksitasjon og 460 nm emisjon ved hjelp Molecular Devices Fmax fluorescerende mikroplateleser (Sunnyvale, California)
Resultater
ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin uttrykket er ledsaget av en hemming av proteasomet aktivitet. Vi har tidligere rapportert at ZnPP undertrykker β-catenin protein ekspresjon i humane kreftceller [7]. Dette ble også bekreftet i foreliggende undersøkelse (figur 1). Behandling med 5 uM ZnPP i 30 minutter til 1 time drastisk undertrykket β-catenin protein ekspresjon i A2780-celler, hvilket indikerer at proteindegradering er involvert. β-catenin proteinnivåer er tett regulert av ubiquitin-proteasom-system. I fravær av wnt ligander, kan den β-catenin protein bli fosforylert av CK1 ved Ser 45, etterfulgt av en sekundær fosforylering ved Ser 33, Ser 37, og Thr 41 av GSK-3β. Fosforylert β-catenin vil da bli poly-ubiquitinmolekyler og målrettet for nedbrytning av proteasomet [9]. For å bestemme hvorvidt aktivering av proteosomet aktivitet er den primære mekanismen for ZnPP-indusert β-catenin degradering, målte vi nivået av fosforylert β-catenin etter ZnPP behandling i A2780 celler. Figur 2A viser at nivået av fosforylert β-catenin (Ser 33, Ser 37 og Thr 41) ble redusert etter behandling med 5 uM ZnPP i 15, 30 eller 60 minutter, noe som indikerer at ZnPP ikke forsterke fosforyleringen av β-catenin av GSK -3β. Co-immunoutfelling med et antistoff mot β-catenin (kanin-IgG anvendt som kontroll for utfelling) viste videre at mens nivået av hel β-catenin ble undertrykt, K48 binding spesifikk poly-ubiquitinmolekyler β-catenin akkumulert i β-catenin utfelt prøvene etter ZnPP behandling i 30 minutter og 4 timer (figur 2B). Vi målte nivåene av K48 (lysin 48) -linkage spesifikke poly-ubiquitinmolekyler å kunne fastslå effekten av ZnPP på poly-ubiquitinmolekyler. Den K48 bundne poly-ubikvitin kjeden er kjent for å målrette proteiner for proteasomal degradering [16]. Som vist i figur 2C, behandling med 10 uM ZnPP i 4 eller 21 timer induserte akkumuleringen av K48 spesifikke poly-ubiquitinmolekyler, noe som indikerer at i stedet for å aktivere proteosomet aktivitet, ZnPP faktisk undertrykker proteasomet aktivitet i vår modell system. Legg merke til at sinkbindende forbindelser er tidligere blitt beskrevet for å hemme proteasom-aktivitet [17,18].
A2780-celler ble behandlet med 5 uM ZnPP til 0,5 eller 1 time. Cellelysater ble utarbeidet og western blot ble utført ved hjelp av antistoffer mot β-catenin og β-aktin.
A
. A2780-celler ble behandlet med 5 uM ZnPP for 15, 30 eller 60 minutter. Cellelysater ble utarbeidet og western blot ble utført ved hjelp av antistoffer mot fosforylert β-catenin (Ser 33, Ser 37 og Thr 41) og β-aktin.
B
. A2780-celler ble behandlet med 5 uM ZnPP til 0,5 og 4 timer. Cellelysater ble utarbeidet og co-IP ble utført ved hjelp av β-catenin antistoff etterfulgt av western blot analyse av K48 koblings spesifikke proteiner, β-catenin (IP-adresser) eller β-aktin (innganger). Vist er representative bilder av tre individuelle eksperimenter.
C
. A2780-celler ble behandlet med 10 uM ZnPP til 4 og 21 timer, eller 10 uM MG132 i 21 timer. Cellelysater ble fremstilt og western blot ble utført ved anvendelse av antistoffer mot K48-linkage spesifikke polyubiquitinated proteiner og β-aktin.
ZnPP hemming av proteasom-aktivitet ble ytterligere bekreftet ved direkte måling av 20S-proteosomet chymotryptisk aktivitet, som ble analysert ved hjelp av fluoroforen bundet peptid Suc-LLVY-AMC [19]. Den eukaryote 20S-proteosomet er kjent for å ha aktivitet tilskrives den forskjellige proteinunderenheter som er referert til som kaspase-lignende aktivitet (spaltes etter glutamin og asparaginsyre-rester), trypsin-lignende aktivitet (spalter etter de grunnleggende aminosyrer lysin og arginin) og chymotrypsin-lignende aktivitet (spaltes etter hydrofobe aminosyrer) [20]. Som vist i figur 3, behandling av A2780 (figur 3A og 3C) og MDA-MB-231 (figur 3B og 3C) celler med ZnPP eller MG132, men ikke SNPP, undertrykkes chymotryptisk aktivitet i en tids- og konsentrasjonsavhengig måte. IC
50 for ZnPP «s hemning av proteasom-aktivitet ble bestemt til å være 6,2 uM i A2780-celler og 4,2 uM i MDA-MB-231-celler (figur 3D). ZnPP, men ikke SNPP, også undertrykt den tryptiske og caspase-lignende proteasome aktivitet i A2780 celler som analyseres ved hjelp av fluoroforen knyttet peptider Z-ARR-AMC eller Z-LLE-AMC henholdsvis [19] (figur 4). Legg merke til at MG132 var mer effektiv i å undertrykke den chymotryptisk aktivitet snarere enn caspase-lignende aktivitet og ikke påvirke den tryptiske aktiviteten, resultater som er i overensstemmelse med tidligere rapporter [21,22].
A2780
(A)
eller MDA-MB-231
(B)
celler ble behandlet med 10 mm ZnPP, SNPP eller MG132 for 4 eller 21 timer. Helcellelysater ble fremstilt og inkubert med Suc-LLVY-AMC i 2 timer ved 37 ° C og fluorescens ble registrert ved 380 nm eksitasjon og 460 nm emisjon.
C
,
D
. A2780 og MDA-MB-231-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av ZnPP som indikert i 21 timer. Helcellelysater ble fremstilt og inkubert med Suc-LLVY-AMC i 2 timer ved 37 ° C og fluorescens ble registrert ved 380 nm eksitasjon og 460 nm emisjon. IC
50 ble beregnet med en ikke-lineær regresjonskurve (sigmoidal dose-respons-ligning). Data (gjennomsnitt ± SE, n = 3) blir uttrykt som prosentandeler av ubehandlet kontroll. **
P
0,01, sammenlignet med ubehandlede kontrollceller ved hjelp av enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni analyse.
A2780 celler ble behandlet med 10 mm ZnPP, SNPP eller MG132 for 4 eller 21 timer. Helcellelysater ble utarbeidet og inkubert med Z-ARR-AMC (tryptiske aktivitet)
(A)
eller Z-LLE-AMC (chymotryptisk aktivitet)
(B)
i 2 timer ved 37 ° C og fluorescens ble registrert ved 380 nm eksitasjon og 460 nm emisjon. Data (gjennomsnitt ± SE, n = 3) blir uttrykt som prosentandeler av ubehandlet kontroll. *,
P
0,05, **,
P
0,01, sammenlignet med ubehandlede kontroller ved bruk av enveis ANOVA etterfulgt av Bonferroni-analyse.
Disse resultater indikerer at ZnPP-indusert β-catenin proteinnedbrytingen er ledsaget av en betydelig undertrykkelse av ubiquitin-proteasom-aktivitet, noe som tyder at proteasomhemmingen degradering ikke direkte står for ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin uttrykk.
ZnPP ikke fremme β-catenin protein eksport. En fersk rapport vist at β-catenin proteinet blir utskilt i exosomes fra HEK293-celler, noe som fører til en betydelig undertrykkelse av den kanoniske Wnt signalveien [23]. For å bestemme hvorvidt ZnPP-induserer β-catenin protein sekresjon, A2780-celler ble dyrket i HBSS og behandlet med 5 uM eller 10 uM av ZnPP i 1,5 timer. Helcellelysater og konsentrerte ekstracellulære proteiner ble forberedt. Omtrent 20-30 ug av total cellelysat og ekstracellulære proteiner ble påsatt på en SDS-polyakrylamidgel. Western blot-analyse (figur 5 øvre) viser at β-catenin proteinekspresjon ble undertrykket ved ZnPP i cellelysatet og ikke påvises i det ekstracellulære proteinfraksjon, noe som indikerer at ZnPP ikke induserer β-catenin protein sekresjon. Noen lav molekyl bånd ble bare påvist i ekstracellulære proteiner, ikke i helcellelysater, noe som tyder på at disse er ikke-spesifikk. Denne konklusjonen ble videre understøttet av Coomassie blue gel-farging (figur 5 lavere) som viser at ZnPP behandling ikke forandre de ekstracellulære proteinprofiler. Vi behandlet også A2780 celler med fem mikrometer ZnPP i 72 timer og isolerte exosomes fra mediet. β-catenin var ikke påvises i de exosome proteiner ekstraktene (data ikke vist), videre å utelukke muligheten for at β-catenin proteinet blir utskilt i exosomes ved ZnPP behandling.
A2780-celler ble dyrket i HBSS og behandlet med ZnPP ved de angitte konsentrasjoner i 1,5 timer. Det kondisjonerte HBSS ble oppsamlet og proteinene ble konsentrert. Western blot ble utført ved hjelp av antistoffer mot β-catenin
(Til toppen)
. Cellelysater og konsentrerte proteinprøver ble også skilt ved SDS-PAGE og farget med Coomassie blåfarging
(Bottom)
. Vist er representative bilder av tre individuelle eksperimenter.
lysosome veien er sannsynligvis involvert i ZnPP-indusert β-catenin protein degradering. Vi har tidligere vist at lysosomale enzymer kan bli frigitt ved forbedret lysosomet membranpermeabilitet, som fører til spaltning av cellulære proteiner [14]. For å avgjøre om lysosome protein degradering veien er involvert i ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin protein uttrykk, undersøkte vi lysosome membran permeabilitet etter ZnPP behandling. AO ble benyttet for å studere lysosomet membranpermeabilitet [14,24]. AO fortrinnsvis akkumuleres i lysosomene og vil avgi rød fluorescens når eksitert under sure betingelser. Når lysosomet er permeabilisert, vil AO flytte til cytosolen hvor den avgir en grønn fluorescens ved eksitasjon. Skiftet fra rød til grønn fluorescens indikerer en økning i lysosome membran permeabilitet [25]. Som vist i figur 6A, behandling med 5 uM ZnPP i 1, 4 eller 21 timer induserte en tidsavhengig endring i AO flekker fra rød til grønn, noe som indikerer at ZnPP forbedrer lysosomet membranpermeabilitet i A2780 celler. I kontrast, fikk behandling med SNPP ikke medføre vesentlige endringer i membran permeabilitet (Fig 6C), i tråd med vår forrige observasjon at SNPP ikke induserer undertrykkelse av β-catenin protein uttrykk.
A2780 celler ble behandlet med 5 mikrometer ZnPP (
A
) eller fem mikrometer SNPP (
B
) for 1, 4 eller 21 timer. Cellene ble deretter inkubert med 2,5 uM AO i 30 minutter ved 37 ° C. Etter inkubering ble cellene vasket to ganger med HBSS. Bilder ble tatt med et fluorescerende mikroskop (60x) med eksitasjon ved 500 nm, emisjon på 526 nm for AO grønn, eksitasjon ved 460 nm, emisjon ved 650 nm for AO rødt.
C
. A2780-celler ble forbehandlet med 21,2 uM Brefeldin A og 4 uM Monensin i 4 timer. Cellene ble deretter behandlet med 5 uM ZnPP i 1 time, etterfulgt av inkubering med 2,5 uM AO i 30 minutter ved 37 ° C. Etter inkubering ble cellene vasket to ganger med HBSS. Bilder ble tatt med et fluorescerende mikroskop (60x) med eksitasjon ved 500 nm, emisjon på 526 nm for AO grønn, og eksitasjon ved 460 nm, emisjon ved 650 nm for AO rødt. Vist er representative bilder av tre individuelle eksperimenter.
BFA er kjent for å blokkere intracellulær transport av lysosomale enzymer [26] og Monensin kan blokkere forsuring av lysosomer [27,28]. Derfor testet vi om en BFA /Monensin cocktail kunne reversere lysosome membran permeabilitet indusert av ZnPP. Etter forbehandling av cellene med en BFA /Monensin cocktail (endelig konsentrasjon på 21,2 uM BFA og 4 uM Monensin) over natten (figur 6B), en reversering i den ZnPP-indusert lysomal membranpermeabilitet ble observert. Disse resultatene støtter involvering av lysosome degradering veien i ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin protein uttrykk. For å bekrefte denne antakelsen, ble A2780 og DU145 cellene behandlet med BFA /Monensin cocktail natten og behandlet med ZnPP på de angitte konsentrasjoner og varigheter (Fig 7). ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin protein uttrykk ble betydelig svekket ved forbehandling med BFA /Monensin cocktail. Effekten av ZnPP på β-catenin var både dramatisk og betydelig og reverseringen av BFA /Monensin ble bare observert etter 0,5 og 1 time ZnPP behandling (data ikke vist). Imidlertid dempningen korrelert med konsentrasjonen og varigheten av ZnPP behandling. Disse observasjonene viser videre at lysosome degradering veien er sannsynligvis involvert i ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin protein uttrykk.
A2780
(A)
eller DU145
(B)
celler ble forbehandlet med eller uten 21.2 uM BFA og 4 uM Monensin over natten, etterfulgt av behandling med 5 uM av ZnPP til 0,5 eller 1 time.
C
. A2780-celler ble forbehandlet med 21,2 uM BFA og 4 um Monensin over natten, etterfulgt av behandling med ZnPP i 1 time ved indikerte konsentrasjoner. Celler ble høstet og lysert. Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av antistoffer mot β-catenin og β-aktin. Vist er representative bilder av tre individuelle eksperimenter.
Diskusjoner
Denne studien er designet for å utforske de potensielle cellulære mekanismer som medierer ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin uttrykk ved hjelp kreftcelle modellsystemer. Det mest interessante funn fra denne studien er at ZnPP-indusert β-catenin proteinnedbrytingen er ledsaget av en signifikant inhibering av de ubiquitin-proteasom-reaksjonsveien degradering; og lysosome-mediert protein degradering synes å formidle denne hendelsen. Disse resultatene ytterligere belyse de cellulære mekanismene for ZnPP sin anticancer aktivitet og indikerer en potensiell ny strategi rettet mot β-catenin Wnt signalveien for kreftbehandling.
β-catenin proteinnivået ditt er godt kontrollert av fosforylering og ubiquitin-proteasome degradering [9]. Derfor har vi i utgangspunktet trodde at ZnPP ville aktivere proteasome degradering veien, og dermed føre til rask β-catenin protein degradering. Men flere linjer med eksperimentelle bevis indikerte at proteasomhemmingen degradering ikke direkte megle ZnPP-indusert β-catenin protein degradering. Først β-catenin protein fosforylering, en hendelse som fører til ubiquitinering og påfølgende proteasomet nedbrytning av β-catenin, ble ikke indusert av ZnPP i kreftceller. Tvert imot, ZnPP behandling raskt redusert fosforylerte β-catenin proteinnivåer, sannsynligvis på grunn av den raske nedbrytningen av det totale cellulære β-catenin protein. For det andre, western blot analyse av poly-ubiquitinmolekyler viste at ZnPP induserer akkumulering av poly-ubiquitinmolekyler, noe som tyder på at ZnPP fungerer som en proteasominhibitor snarere enn en aktivator. Tredje, co-IP med en β-catenin antistoff og western blot analyse av K48-linkage spesifikke poly-ubiquitinmolekyler viste at poly-ubiquitinmolekyler β-catenin akkumulert etter ZnPP behandling, i samsvar med sin hemming av proteasome aktivitet. Til slutt, en direkte måling av proteosomet chymotryptisk, bekreftet tryptiske og caspase-lignende aktiviteter som ZnPP undertrykker signifikant proteasomer aktiviteter i en tids- og konsentrasjonsavhengig måte i kreftceller. Så vidt vi vet, er dette den første demonstrasjonen som ZnPP er en proteasominhibitor. Merk at ZnPP er proteasome hemmende aktivitet er forskjellig fra de tidligere etablerte proteasomhemmere som MG132 [21,22], ved at ZnPP synes å ha et bredere spekter av proteasome hemmende aktivitet (figur 3 og 4).
muligheten for at ZnPP kan indusere β-catenin protein eksport gjennom exosomes [23] som dermed reduserer mobil β-catenin protein uttrykk ble heller ikke støttet av våre eksperimentelle resultater. β-catenin protein var umulig å oppdage ved western blot analyse av ekstracellulære proteiner samlet inn fra det kondisjonerte medium av ZnPP-behandlede celler. Videre ble det av exosomes isolert fra mediet ikke inneholder p-catenin proteiner. Disse observasjonene indikerer at ZnPP ikke induserer β-catenin protein sekresjon fra kreftceller.
Vi har nylig rapportert at sink ionoforer forbedre lysosomet membranpermeabilitet som fører til frigjøring av lysosomale enzymer og spaltning av cellulære proteiner [14]. I den foreliggende undersøkelse, bruk av AO tillatt oss å vise at ZnPP forbedrer lysosomet membranpermeabilitet i vårt kreftcelle modellsystemet, noe som tyder på at ZnPP undertrykkelse β-catenin proteinekspresjon er et resultat av lysosomal enzymoppløsning av cellulære proteiner. Viktigere, ZnPP-indusert lysosomet membranpermeabilitet kan være effektivt dempes ved forbehandling av cellene med proteinet transport hemmende cocktail BFA /Monensin [29], som er kjent for å blokkere cellulær transport av lysosomet enzymer (BFA, [26]), og hemmer lysosomet forsuring (Monensin, [27]). Selv om denne inhibitoriske cocktail er ikke spesifikke for lysosomene, til bruk av Monensin og BFA endre lysosomet struktur og aktivitet er godt dokumentert [30-32]. Disse observasjoner støtter ideen om at lysosomet-mediert reaksjonsvei proteinnedbrytingen er involvert i den ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin ekspresjon. Forbehandling av kreftceller med BFA /Monensin cocktail betydelig svekket undertrykkelse av β-catenin protein uttrykk ved ZnPP ytterligere bekrefter involvering av lysosomal protein degradering vei i denne prosessen. Det gjenstår å fastslå hvorvidt bestemte lysosomale enzymer er ansvarlige for ZnPP-indusert β-catenin proteinnedbrytning, eller hvorvidt en utvalgt gruppe av proteiner nedbrytes gjennom denne prosessen i kreftceller. Potensialet interaksjon av ubiquitin-proteasome system med lysosome degradering pathway [33,34] som kan forklare ZnPP-indusert β-catenin protein degradering er under aktiv etterforskning. Gitt at det ikke er noen tidligere rapporter på lysosome-mediert hemming av β-catenin uttrykk, funnene fra denne studien gir ny innsikt i ZnPP sin anticancer aktivitet og avdekke eventuelle nye strategier i å undertrykke den kanoniske Wnt signalveien.
i sammendrag, har vi undersøkt cellulære mekanismer som formidler den ZnPP-indusert undertrykkelse av β-catenin ekspresjon i kreftceller. Våre resultater tyder på at lysosomet degradering veien er sannsynligvis involvert i ZnPP undertrykkelse av β-catenin ekspresjon og at denne prosess er ledsaget av en hemming av proteasomet aktivitet. Disse funnene gir en ny mobil mekanisme ZnPP sin anticancer aktivitet og implisere en ny strategi for å målrette den kanoniske Wnt signalveien.
