Abstract
Sykdom orientert funksjonell analyse av epigenetiske faktorer og deres reguleringsmekanismer i avvikende lyddemping er en forutsetning for bedre diagnostikk og terapi. Likevel, de nøyaktige mekanismene er fortsatt uklart og komplisert, involverer samspillet av flere effektorer inkludert nucleosome posisjonering, DNA metylering, histone varianter og histonmodifikasjonene. Vi undersøkte epigenetisk stanse kompleksiteten i tumorsuppressorgenet
Cadm1
i muselungekreftstamcellelinjer, stiller arrangøren hypermethylation forbundet med transkripsjonen undertrykkelse, men stort sett svarer til demethylating medikamentell behandling. Etter å forutsi nucleosome stillinger og transkripsjonsfaktor bindingssteder langs
Cadm1
arrangøren, vi gjennomført single-molekyl kartlegging med DNA metyltransferase
M.Sss
jeg, som avslørte i stille arrangører høy nucleosome belegg og okklusjon av transkripsjonsfaktorbindingsseter. Videre
M.Sss
I kartene over arrangører varierte innenfor og mellom de ulike lungekreftcellelinjer. Kromatin analyse med micrococcal nuklease også antydet variasjoner i nucleosome posisjonering for å ha implikasjoner i binding av transkripsjonsfaktorer nær nucleosome grenser. Chromatin immunoprecipitation viste at histone varianter (H2A.Z og H3.3), og motstridende histone modifikasjon merker (H3K4me3 og H3K27me3) alle colocalized i samme nucleosome stillinger som minner om epigenetisk plastisitet i embryonale stamceller. Til sammen epigenetisk stanse kompleksiteten i promoter-regionen i
Cadm1
er ikke bare definert av DNA hypermethylation, men høy nucleosome belegg, endret nucleosome posisjonering, og «toverdige» histonmodifikasjonene, også trolig bidratt i transkripsjonen undertrykkelse av dette gen i lungekreftceller. Resultatene vil bidra til å definere terapeutiske intervensjon strategier bruker epigenetiske narkotika i lungekreft
Citation. Reamon-Buettner SM, Borlak J (2012) Dissecting epigenetisk Dempe kompleksitet i det Mouse Lung Cancer lyddemper Gene
Cadm1
. PLoS ONE 7 (6): e38531. doi: 10,1371 /journal.pone.0038531
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, Spania
mottatt: 22 september 2011; Godkjent: 07.05.2012; Publisert: 06.06.2012
Copyright: © 2012 Reamon-Buettner, Borlak. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av departementet for vitenskap og kultur, Niedersachsen, Tyskland 25A 5-7251-99 /00. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskript
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt en ledende dødsårsak, men de molekylære mekanismer for sykdom er i stor grad ukjent. Mange studier viser nå at genetiske og epigenetiske forandringer som syndebukkene [1]. Epigenetiske hendelser er arvelige endringer i genuttrykk uten endringer i primær DNA-sekvens. De er viktige for normal utvikling og differensiering, men når feilsendt føre til sykdommer, spesielt cancer [2]. Likevel, mange av prosessene som resulterer i genet Slå kan reverseres med epigenetiske legemidler, og tilbyr et håp for behandling og terapi [3]. Den epigenetisk landskapet stanse er imidlertid kompleks som involverer samspillet mellom hoved effektorer, inkludert nucleosome posisjonering, DNA-metylering, histon varianter, histonmodifikasjonene og ikke-kodende RNA [4]. Hvordan disse effektorer interagere med hverandre for å påvirke genekspresjon og forårsake sykdom er fortsatt uklar.
DNA ble pakket inn i en kompleks nukleoprotein struktur i kjernen av en celle som kalles kromatin, og den grunnleggende repeterende enhet av kromatin er kjent som nucleosome, struktur og funksjon som fortsatt blir belyst [5]. Hver nucleosome består av en octameric histon kjerne (to eksemplarer av H2A, H2B, H3 og H4), rundt hvilke lag 147 bp DNA er pakket i 1,65 superhelical svinger. Nucleosome posisjonering spiller en avgjørende rolle i kromatin høyere orden folding og i genregule [6] – [8]. Nukleosomer kan påvirke transkripsjon ved å modulere tilgjengeligheten av DNA til regulatoriske proteiner og transcriptional maskiner, som fører til genaktivering eller undertrykkelse. Nucleosome posisjonering kan i sin tur påvirkes av flere faktorer, blant annet DNA-sekvens preferanser, DNA metylering, histone varianter, og histone posttranslational modifikasjoner [6]. Videre nucleosome posisjonering er forskjellig fra nucleosome belegg, som ikke står nucleosome begynner forutsatt at en gitt basepar er inne i en nucleosome [7].
Modifikasjon av DNA-metylering skjer ved kovalent addisjon av en metylgruppe i stilling 5 av cytosin ring, og skaper 5-metylcytosin. DNA-metylering er et velkjent epigenetisk Stillemekanismen og er forbundet i forskjellige biologiske prosesser og sykdommer (vurderinger, [4], [9]). Tet (1011 trans) proteiner kan konvertere 5-metylcytosin (5mC) til 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) [10], [11], og nylig også i 5-formylcytosine (5FC) og 5-carboxylcytosine (5caC) [12] . DNA-metylering kan hemme genekspresjon ved å hindre transkripsjonelle aktivatorer fra å binde DNA målet eller ved rekruttering av metyl-CpG-bindende domene (MBD) proteiner, som i sin tur rekruttere histon-modifiserende og kromatin-remodeling komplekser til denaturert sider [4]. CpG metylering kan også bidra til undertrykkelse av genet ved å fremkalle en mer kompakt og stiv nucleosome konformasjon [13].
mammalian DNA-metylering maskineri blir mediert av DNA metyltransferaser (DNMTs), som etablerer og opprettholde DNA-metylering mønstre. DNMT1 er nødvendig for å opprettholde DNA-metylering mønstre, mens
de novo
metyltransferaser DNMT3A og DNMT3B målrette nye unmethylated DNA-områder (for gjennomgang, [14]). Nukleosomer kan påvirke DNA metylering, men så langt studier viser avvikende resultater. Enten DNA metyltransferaser fortrinnsvis rettet mot nucleosome-bundet DNA [15], eller nukleosomer gi beskyttelse mot metylering [16]. Videre nukleosomer som inneholder metylert DNA stabilisere de novo DNA metyltransferaser 3A /3B (DNMT3A /3B) slik at lite fritt DNMT3A /3B for å eksistere i kjernen [17]. Stabilisering av DNMT3A /3B på nukleosomer i denaturert regionene fremmer ytterligere spredning av DNA metylering og dermed sikrer trofast epigenetisk arv. CpG metylering kan også ha en tydelig innvirkning på proteinbinding når det er til stede innenfor et nukleosomale bakgrunn [18].
nukleosomale histoner kan utveksles med histon-varianter, og deres innlemmelse kan påvirke nucleosome posisjonering, og således genaktivitet (anmeldt i [19]). Syntesen av kanoniske histoner er koblet til DNA-replikasjon i S-fasen, mens histone varianter blir syntetisert i løpet av cellesyklusen. Videre, i motsetning til kanoniske histoner hvis funksjon er først og fremst i genomet emballasje og genregulering, ikke-kanoniske histoner har viktige roller i en rekke prosesser, inkludert kromosom segregering, transkripsjonen regulering, og DNA-reparasjon. Blant disse histon variantene er den H2A variant H2A.Z, som er sterkt konservert i løpet av evolusjonen eukaryot [20], [21]. Histon variant H2A.Z skiller seg vesentlig fra H2A av flere aminosyrer, og fortrinnsvis lokaliserer til genet promotere i pattedyrceller, hvor det er spredt over flere nukleosomer oppstrøms og nedstrøms for transkripsjonsstartsetet [22]. En annen godt bevart histon variant er H3.3, en variant som skiller seg fra kanoniske H3 av noen aminosyresubstitusjoner, og funnet å være anriket i hele genet legeme av transkriberte gener, promotorområdene i aktive og inaktive gener, og ved regulatoriske elementer. Denne varianten akkumuleres også ved stille loci i pericentric kromatin og telomerer [23].
I tillegg til erstatning av histon varianter, aminosyrerester i den N-terminale hale av histoner (kanonisk så vel som varianter), kan modifiseres ved hjelp av forskjellige kovalente post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs) og danner grunnlaget for den epigenetisk regulering av kromatinstruktur og genfunksjon [24]. Mer viktig er det crosstalk mellom histonmodifikasjonene med andre epigenetiske regulatorer å forsterke eller reversere funksjoner modifikasjoner. Slike PTMs, som inkluderer blant annet acetylering, metylering, og fosforylering, spille en direkte rolle i å påvirke kromatinstruktur, eller de kan representere merker eller signaler å bli gjenkjent av leserne av histonmodifikasjonene, for å angi en løs eller kompakt kromatin [25]. Forstyrrelser av histonmodifikasjonene i normale reguleringsprosesser har blitt funnet i sykdommer, inkludert kreft utvikling og progresjon [26].
CADM1 plakater (celleadhesjonsmolekyl 1) er en tumor suppressor gen identifisert i ikke -små celle lungekreft (NSCLC), men også implisert i andre humane kreftsykdommer [27], [28]. Vi viste tidligere at
Cadm1
ble undertrykt i mus lunge kreft stamcellelinjer, og genekspresjon høyt korrelert med arrangøren hypermethylation [29]. Men etter behandling med demethylating midlet 5-aza-2-deoksycytidin (5-aza-dC), de fleste av cellelinjene var ikke reagerer tyder deltakelse av ytterligere epigenetiske Silencing arrangementer. Det foreliggende studium forsøkte å forstå epigenetiske landskap som fører til undertrykkelse av transkripsjonen
Cadm1
i de samme mus lungekreft stamceller, og til slutt å få innsikt i den mekanistiske epigenetisk stanse av tumorsuppressorgener, generelt, og som reaksjon på epigenetiske narkotika. Ved hjelp av bioinformatiske verktøy, spådde vi nucleosome stillinger og transkripsjonsfaktor bindingssteder langs
Cadm1
promoter. Vi har gjennomført en streng enkelt-molekyl kartlegging av kromatin med DNA metyltransferase,
M.Sss
jeg å bestemme nucleosome belegg og okklusjon av transkripsjonsfaktorer bindingssteder. Med et panel av primere å avhøre midten, samt venstre og høyre grenser spådd nukleosomer, vi analysert for differensial nucleosome posisjonering i MNase-fordøyd kromatin og chiped DNA med kanoniske histon H2A, varianter histon H2A.Z og H3.3, samt for histonmodifikasjonene, H3K4me3 og H3K27me3. Til sammen representerer lungekreft celler vises flere epigenetiske Silencing hendelser som vil bidra til å definere terapeutiske intervensjonsstrategier.
Resultater
Cadm1
Arrangøren Hypermethylation korrelerer med Transkripsjonell undertrykkelse
Dette og tidligere studie [29], fant at
Cadm1
arrangøren CpG hypermethylation korrelert med transkripsjonen undertrykkelse i lungekreftcellelinjer etablert fra enkle, spontant transformlungetumorceller av
c-myc
og
c-Raf
dobbelttransgene mus. CpG metylering i individuelle kloner var heterogen innenfor og mellom 10 forskjellige lungekreftcellelinjer. Det tidligere studie viste også at metylering av CPGs i kjernebindingsseter til transkripsjonsfaktorer SP1, SP3, og Zf5 avskaffet DNA-proteinbinding. Videre behandling med demethylating agent, 5-aza-2-deoksycytidin (5-aza-DC) restaurert
Cadm1
genekspresjon, men så langt bare i to cellelinjer, noe som tyder på ytterligere epigenetiske Silencing hendelser. Faktisk, som sammenligner DNA-metylering i ubehandlet og i aza-behandlede lungecancer cellelinje A2C12 med tilsvarende gjen uttrykk for
Cadm1
viste at de fleste av de 69 CPGs analysert i promoter-regionen ble fortsatt metylert i det aza-behandlede A2C12. Dermed behandling med 5-aza-dC alene var ikke i stand til å gjeninnsette genekspresjon i alle lungekreftcellelinjer eller demethylate arrangøren regionen i
Cadm1 Hotell og disse observasjonene førte oss til å mistenke for flere lag med epigenetisk stanse på plass. Vi undersøkt videre
Cadm1
promoter og dermed få innsikt i omfanget av epigenetisk stanse kompleksiteten i de ulike lungekreft cellelinjer.
nucleosome Posisjonering forslag og merknader langs
Cadm1
Arrangøren regionen
for å finne ut om CpG metylering kan påvirke nucleosome belegg som fører til epigenetisk stanse, som tidligere vist [30], brukte vi bioinformatiske verktøy for å forutsi nucleosome posisjoner, og å kommentere
Cadm1
promoter regionen. Ved hjelp av en nucleosome posisjonerings forutsigelse basert på genom-DNA-sekvens (Segal, se Materialer og Metoder), som ligger vi minst fem mulige nucleosome posisjoner omtrent 1000 bp inn i transkripsjonsstartsetet (TSS) og translasjonsstartsetet (ATG). Den RefSeq TSS (NM_001025600.1) ligger på -21 i ATG. Den anslåtte nukleosomer er utpekt vilkårlig forhold til ATG, som NUC 1 (-1011 til -865), NUC 2 (-697 til -551), NUC 3 (-417 til -271), NUC 4 (-230 til -84 ) og NUC 5 (-41 til 106). Bindingsstedene for predikerte sekvens-spesifikke transkripsjonsfaktorer ligger ved grensen eller innenfor disse nukleosomer, og høykonsentrert på nukleosomer de ved siden av TSS (figur 1A). Mange CPGs er funnet inne nukleosomer, særlig de i CpG øy i promoter-regionen i
Cadm1 plakater (figur 1B). 1000-bp region er dekket av fem fragmenter av størrelse 124-349 bp vi brukt til å analysere CpG metylering i bisulfitt-behandlede genomisk DNA, særlig i forbindelse med DNA-metyltransferase-baserte enkelt-molekyl kromatin (MAP-IT) analyse (figur 1C tabell S1). I løpet av studien, andre nucleosome posisjoneringsalgoritmer ble tilgjengelig (f.eks NuPOP, ICM, se Materialer og metoder) og sammenligning viste overlapping i spådommer blant de tre metodene som brukes (figur 1D). Likevel, plasseringen av tre nukleosomer (betegnet NUC 1, 3, 4) syntes å være mer eller mindre konsekvent.
(A) Plassering av fem analyserte nukleosomer (blå rektangler) og bindingssteder av transkripsjonsfaktorer. Nukleosomer er vilkårlig nummerert fra lengst (f.eks NUC 1) mot RefSeq transkripsjon start hotellet (TSS) og oversettelsen startwebstedet ATG, som begge ligger på nucleosome 5 (NUC 5). Nukleotid-nummerering med en svarer til en av ATG. (B) Forut nukleosomer og plassering av CPGs (vertikale striper) og CpG øy langs
Cadm1
promoter. (C) Fem fragmenter dekker analysert CPGs i sulfitt-behandlet genomisk DNA og spådd nucleosomes. (D) Mulige nucleosome stillinger fra tre forskjellige algoritmer.
Enkelt molekyl Chromatin Kartlegging av
Cadm1
Arrangøren Region med
M.SssI
avslører Høy nucleosome Occupancy i Lung Cancer Celler
neste gjennomført en enkelt-molekyl kromatin kartlegging av
Cadm1
promoter-regionen. Vi har benyttet en footprinting strategi som muliggjør kromatinstruktur kartlegging ved unmethylated CpG øyer ved å behandle isolerte kjerner med DNA metyltransferaser, særlig CpG-spesifikke DNA-metyltransferase (
M.Sss
I), etterfulgt av genomisk bisulfitt sekvensering av individuelle avkom DNA-molekyler [31], [32]. Denne prosedyren betegnet som metylering baserte enkelt promoter analyse (M-SPA), er også beskrevet som metyltransferase tilgjengelighet protokoll for enkeltmaler (MAP-IT) [33]. I hovedsak vil CPGs bli metylert av
M.Sss
jeg, en bakteriell cytosin C5 metyltransferase, med mindre CPGs er blokkert av nukleosomer eller DNA bindende proteiner. For dette formål er nucleosome lokalisering definert som en region med ca. 147 bp som er utilgjengelig for
M.Sss
I.
CPGs innenfor
Cadm1
promoter-regionen i normal lunge er i hovedsak unmethylated og genet blir uttrykt. Vi behandlet kromatinet av normal lunge med
M.Sss
jeg og analysert beskyttede (unmethylated) CPGs langs promoter-regionen i
Cadm1
, spesielt de innenfor spådd nukleosomer eller transkripsjonsfaktor bindingssteder. Vi brukte bisulfitt primere som forsterker fem fragmenter, tre av dem overlapper hverandre, og dekker 69 CPGs fra -944 til 41, i forhold til oversettelse start området, ATG (se figur 1C, Tabell S1).
M.Sss
jeg behandling av «naken» genomisk DNA fungerte som kontroll. Ved hjelp av DNA-metylering mønster i «naken» genomisk DNA og normal lunge som referanse, analyserte vi kromatin fra lungetumor, lungekreft cellelinjer, og en 5-aza-dC-behandlede lungecancercellelinje med svak gene re-ekspresjon. For å få innsikt i ulike øyeblikksbilder av
Cadm1
promoter, sammenlignet vi DNA-metylering mønstre av uavhengige
M.Sss
Jeg behandlinger av samme cellelinjer.
Metylering effektiviteten av M .SssI langs Cadm1 promoter-regionen i «nakne» genomiske DNA-kontroller.
Metylering effektiviteten av
M.Sss
jeg ble først bestemt i «naken» mus genomisk DNA. Metylering effektivitet i gjennomsnitt 21 kloner for hvert fragment varierte 51-91% (figur S1). Den høyeste effektivitet ble oppnådd i de to nærmeste fragmentene rundt TSS, dvs. MFRA og TSFR1 på 91%. Unmethylated CPGs i disse fragmentene var mer eller mindre tilfeldig. Denne differensial metylering effektivitet kan være en indikasjon på at arrangøren regionen i nærheten av TSS var mer følsomme for DNA metylering. I vår forrige analyse, metylering indeks på fragment TSFR1 som inkluderer TSS ga klareste korrelasjon til transkripsjonen undertrykkelse. Totalt metylering i fem fragmenter, 106 kloner og 1,478 CPGs var 76%. Ved bruk av samme protokoll, vi også bestemt metylering effektiviteten av «naken» genomisk DNA isolert fra en lungekreft cellelinje (A2Cl2) som allerede inneholdt før CpG metylering. Totalt metylering i fem fragmenter, 31 kloner og 416 CPGs var 98%, noe som indikerer robustheten av analysen.
M.SssI kromatin kartet over normal lunge.
Vi analyserte kartet M.SssI i kromatin isolert fra ni sammenslåtte normale lunger. For fragment BFR (255 bp, 6 CPGs -944 til -837), de fleste kloner viste en strekning av unmethylated CPGs (figur S1), spesielt de som ligger innenfor en forutsagt nucleosome (NUC 1) (figur S2). For fragment 1FR (279 bp, 10 CPGs, -682 til -531), flere kloner viste også en strekning av unmethylated CPGs, mange faller innenfor en anslått nucleosome (NUC 2) (Figur S3). Disse resultatene antyder nucleosome belegg.
For de neste tre overlappende fragmenter rundt TSS (MFR1, MFRA, TSFR1) og i regionen der flere transkripsjonsfaktor bindingssteder kan bli funnet (se figur 1A), den mønstre i de fleste kloner indikerte fravær av nucleosome belegg, men snarere tyde på binding av transkripsjonsfaktorer eller andre proteiner som er nødvendige for regulering. Fragment MFR1 (124 bp, 14 CPGs, -456 til -341) blir forsterket av metylering-spesifikke primere (med tre CPGs i både forover og bakover primere). Dette fragment inneholder forutsagte bindingsseter for transkripsjonsfaktorer, for eksempel PPARg, ER, etf, hvor CPGs innenfor disse bindingsseter var for det meste unmethylated i flere kloner, som tyder på deres binding og en mulig rolle i den transkripsjonelle regulering av
Cadm1
. Den spådde ETF området er inne i en nucleosome (NUC 3), mens PPARg er på grensen av NUC 3, og kan lett påvirkes av endringer vedrørende nucleosome belegg og skyve (figur S4).
Fragment MFRA (222 bp, 27 CPGs, -396 til -180) blir også forsterket av metylering-spesifikke primere (med 5 CPGs i forover primer, 6 CPGs i revers primer). Dette fragmentet omfatter en forutsagt nucleosome (NUC 3), og dels at en annen (NUC 4) (fig S5). Den inneholder to bindingsseter for SP1 som ligger innenfor eller på venstre kant av NUC 4. CPGs i SP1 bindingssteder på -224 og -211 ble okkupert i mange kloner som har nucleosome fritt mønster. Dette resultatet støtter videre at SP1 kan faktisk spille en rolle i reguleringen av
Cadm1
. Det var 2 av 15 kloner, men som viste en lang strekning av CpG beskyttelse inni en anslått nucleosome (NUC 3), noe som indikerer nucleosome formasjon i denne delen av arrangøren av
Cadm1
.
fragment TSFR1 (345 bp, 37 CPGs, -302 41) er forsterket av primere som inneholder tre CPGs i foroverprimeren, og to CPGs i revers primer (figur 2). Våre tidligere resultater viste at metylering indeksen hentet fra denne fragment korrelerte høyt med transkripsjonen undertrykkelse sammenlignet med de andre fragmentene analyseres i
Cadm1
promoter-regionen. Den inneholder bindingsseter for SP1, Zf5 og andre spådde transkripsjonsfaktorer. Også inkludert er de RefSeq transkripsjonsstartsetet (TSS), translasjonsstartsetet, ATG, så vel som minst to forutsagte nukleosomer (NUC 4 og NUC 5). Det var ingen lang strekning av unmethylated CPGs, bortsett fra 3 av 15 kloner der de fleste av de vernede CPGs faller innenfor en anslått nucleosome (NUC 4). I disse klonene uten åpenbare belegg på NUC 4, en forutsagt nucleosome (NUC 5) hvor RefSeq TSS samt ATG områdene er plassert, som syntes å være ikke til stede i tillegg, i samsvar med en åpen kromatin som er forbundet med transkripsjon. Videre -224 CpG i bindingssetet av SP1 og -192 CpG i Zf5, var ofte unmethylated, for å støtte deres binding i promoter-regionen i
Cadm1.
(A) metylering mønstre i kloner etter behandling med CpG-spesifikke DNA metyltransferase (
M.Sss
i) og scoring av 32 CPGs (-271 til 24 CPGs, TSFR1 fragment) i «naken» mus-tail genomisk DNA, og kromatin fra ni sammenslåtte normale lunger, tre sammenslåtte solide lungesvulster, og syv forskjellige lungekreft cellelinjer med liten eller ingen
Cadm1
genuttrykk. Mønstrene ble oppnådd med BISMA hvor blå boksene representerer unmethylated CPGs (= beskyttet) mens røde bokser, denaturert CPGs. I lungesvulster og lungekreft cellelinjer, kan CpG metylering være endogen og /eller fra
M.Sss
jeg behandling. (B) Annotation av analysert
Cadm1
promoter-regionen (CPGs, antatte bindingssteder av lunge-spesifikke transkripsjonsfaktorer, spådde nukleosomer), og de tilsvarende sekvens-kontekst DNA metylering mønstre vist i (A). En strekning av beskyttede CPGs spesielt innenfor spådd nucleosome fire var hyppig i mange av de 84 kloner oppnådd i lungekreftcellelinjer.
For å oppsummere,
M.Sss
jeg metylering kart observert i kloner av normal lunge antydet dannelsen av de forutsagte fem nukleosomer langs promoter-regionen i
Cadm1
. Mønstrene som finnes i de tre fragmenter (MFR1, MFRA, og TSFR1) rundt TSS, der tre nukleosomer (NUC 3, NUC 4, og NUC 5) er plassert, viste fravær av nucleosome belegg i mange kloner. Imidlertid bindingsstedene for transkripsjonsfaktorer så som Sp1 og Zf5 viste beskyttelse, noe som tyder på deres rolle i den transkripsjonelle regulering av
Cadm1
. I motsetning til de to nukleosomer lenger unna TSS (nuc1 og NUC 2), uten noen åpenbar nucleosome ombygging syntes å finne sted som de fleste kloner bare utstilt lange strekninger av unmethylated CPGs.
M.SssI kromatin kartet lunge svulst.
Vi analyserte
M.Sss
jeg kart kromatin isolert fra tre sammenslåtte solide lungesvulster av c
-Raf
transgene mus.
Cadm1
var fortsatt uttrykt i disse svulstene (ikke vist). På grunn av endogen CpG metylering i lungesvulster, resulterer bare fra unmethylated CPGs (dvs. beskyttet) etter
M.Sss
jeg behandling ble tolket. Ikke desto mindre, mønstrene i kloner antydet dannelsen av minst tre nukleosomer (nuc1, NUC 2, NUC 3) (figurene S1, S2, S3, S5). På fragment TSFR1, hvor NUC 4 og NUC 5 bor, var det ingen lang strekning av unmethylated CPGs langs fragment å indikere nucleosome belegg, men 18 individuelle CpG nettsider viste beskyttelse (figur 2). Faktisk 13 av 19 kloner utstilt samme mønster. Blant funksjonene i disse felles mønster inkluderer nesten ingen metylering i to SP1 bindingsseter (-224, -164 CPGs), så vel som for Zf5 (-192, -190, -188 CPGs). Behandling av kromatin avledet fra lungetumorprøve viste ikke tilstedeværelse av nukleosomale belegg i analysert kloner på fragment TSFR1. Men dette resultatet var basert på samlede lungesvulster som fortsatt uttrykt i noen grad
Cadm1
. Videre er lungetumor sammensatt av mange celletyper, inkludert ikke-kreft de som kunne ha bidratt til de resultater som er vist i figur 2. Ikke desto mindre, ved nivået for de enkelte tumorcellelinjer, markerte forskjeller i nukleosomale posisjoneringen ble observert som beskrevet nedenfor.
M.SssI kromatin kart over ulike lungekreft cellelinjer.
Vi har gjennomført
M.Sss
jeg kartlegging på 10 lunge kreft cellelinjer med varierende grad av
Cadm1
promoter hypermethylation og transkripsjons-undertrykkelse, samt et lungekreft cellelinje behandlet med 5-aza-dC. I likhet med lunge svulst, på grunn av endogen CpG metylering i lungekreftcellelinjer, bare mønstre fra unmethylated CPGs (dvs. beskyttet) etter
M.Sss
jeg behandling ble vurdert. Vi analyserte kart over de enkelte cellelinjer (figur S6, S7), samt kollektivt. Som tidligere nevnt, har vi også analysert mønstre i «naken» genomisk DNA fra en lungekreft cellelinje (A2C12), som ble metylert endogent (se figur S1C). Videre, for å bekrefte resultatene og bestemme mønstre av forskjellige bilder av
Cadm1
arrangøren, vi har gjennomført to behandlingsforsøk i enkelte cellelinjer (figur S6). Her beskriver vi den kollektive
M.Sss
jeg maps funnet i lungekreft cellelinjer med liten eller ingen
Cadm1
genuttrykk.
For fragment BFR, en strekning av minst tre unmethylated CPGs ble observert i mange kloner. Disse tre steder på -944, -924, -903 CPGs, er plassert inne NUC 1 og dermed tyder belegg av denne nucleosome (figur S2). For fragment 1FR, selv om det var kloner som viste en strekning på minst tre unmethylated CPGs å foreslå nucleosome belegg (NUC 2), de fleste kloner var svært denaturert CPGs og kilden til denne metylering kan være både endogene og på grunn av
M .sss
jeg behandling (Figur S3).
for fragment MFR1, de fleste av de 98 klonene var svært denaturert, med unntak av de to CPGs på -423 og -408. Disse to CPGs er innenfor den anslåtte bindende sekvens av transkripsjonsfaktorer (PPARg, ER), og er på grensen til NUC 3 (figur S4). Beskyttelse av disse to CpG nettstedene kan være både fra transkripsjon bindende og nucleosome skli. EMSA resultater antydet at PPARg bind
in vitro
til
Cadm1
arrangøren med atom utdrag fra lungekreft cellelinje (A2C12), men ikke i normal lunge (figur S8), og kunne spille en rolle i lungekreft.
for fragment MFRA, det var fem kloner blant 86 kloner med nesten ingen metylering å foreslå nucleosome belegg (NUC 3) (figur S5). Det var også enkelte CpG nettsteder som viste lav metylering, spesielt SP1 bindingssteder på -224 og -211, som ligger på grensen til en nucleosome (NUC 4) (figur S5). Dermed kunne vern i lungekreftcellelinjer på -224 og -211 skyldes både SP1 bindende og nucleosome belegg.
For fragment TSFR1, de fleste av de 84 kloner vises lange strekninger av unmethylated CPGs å foreslå høy nucleosome belegg (NUC 4 og NUC 5) rundt TSS (figur 2). En oppdatering av beskyttelse var tydelig i CPG områder -224 til -188; en annen lapp var på -174 til -90. Bindingsstedene for SP1 og Zf5 er inne i en oppdatering av unmethylated CPGs indikerer okklusjon grunn nucleosome belegg. For å støtte denne antakelsen av en nucleosome belegg, ble den samme strekningen av unmethylation funnet etter behandling av kromatin av lungekreft cellelinje (GA7) med
M.Cvi
PI (GPC metylase), og der metylering av CpG nettsteder (= endogen CpG metylering) ble scoret (data ikke vist).
Lungekreft cellelinje (A2C12) etter behandling med 5-aza-dC.
Den cellelinje A2C12 svarer til 5-aza-dC behandling resulterer i
Cadm1
re-uttrykk. Imidlertid er graden av re-ekspresjon varierer fra behandling til behandling. Vi analyserte
M.Sss
jeg kart 5-aza-DC-behandlet A2C12 som viste svak
Cadm1
gen re-uttrykk og sammenlignet med ikke-behandlede A2C12 og normal lunge (figur 3 ). For fragment BFR, noen kloner viste nå strekning av unmethylated CPGs, og dette resultatet foreslo nucleosome belegg (NUC 1). For fragment 1FR, tre kloner viste også strekninger av unmethylated CPGs å indikere nucleosome belegg (NUC 2).
(A) Plassering av de fem fragmenter analysert i
Cadm1
promoter regionen som dekker 69 CPGs -944 til 41, i forhold til oversettelse start området, ATG. CPGs er representert ved striper. (B-D) metylering kart over normal lunge og A2C12; blå boksene representerer unmethylated CPGs (= beskyttet) mens røde bokser, denaturert CPGs. Fragmentene blir presentert med hensyn til deres plassering, dvs. fra BFR til TSFR1. De CPGs i kjernesekvensen av SP1 og Zf5 bindingsseter er indikert med piler. (D) Etter fem-aza-dC behandling og svak gen re-uttrykk, noen kloner ligne mønstre funnet i normal lunge (f.eks i TFSR1, lukket), til å foreslå nucleosome ombygging (utkastelse) i genuttrykk.
i de neste tre fragmenter mot TSS (MFR1, MFRA, TSFR1), noen kloner vises mønstre som ligner på normal lunge, som er et tegn på mønstre forbundet med kastet ut nukleosomer og aktiv transkripsjon. For fragment MFR1, seks kloner lignet mønstre av ikke-nucleosome belegg og transkripsjonsfaktorer bindende sett i normal lunge. For fragment MFRA, var det bare fire mønstre observert: 7/21 fullstendig fravær av metylering; 12/21 med samme mønster og kloner syntes å være i ferd med å bli ombygd eller nucleosome å bli kastet ut; og 2/21 i mellom. De to SP1 områder ble okkupert i alle kloner. Dermed er Sp1 bindende i disse kloner med kastet ut nukleosomer, et funn som stemmer godt overens med våre tidligere resultater EMSA [29]. For fragment TSFR1, flere kloner lignet mønster funnet i normal lunge indikerer fravær av nucleosome men transkripsjonsfaktor bindende. Dette resultatet foreslo kromatin remodellering etter 5-aza-dC behandling.
Totalt resultater M.SssI kartlegging.
For å oppsummere,
M.Sss
jeg kartlegging i normale lunge støtter dannelsen av minst fem nukleosomer på de forut posisjoner langs promoter-regionen i
Cadm1.
det var kloner å vise lange strekninger av unmethylated CPGs i disse stillingene, spesielt i de to nukleosomer (NUC 1, NUC 2)
