Abstract
Bakgrunn
Utviklingen av effektive kreftvaksiner er fremdeles en utfordring. Til tross for den avgjørende rollen plasmacytoid dendrittiske celler (PDCs) i anti-tumorrespons, deres terapeutiske potensialet er ennå ikke utarbeidet. Vi utforsket relevansen av HLA-A * 0201 matchet allogene PDCs som vektorer for immunterapi.
metoder og resultater
Stimulering av PBMC fra HLA-A * 0201
+ givere av HLA- A * 0201 tilpasset allogene PDCs pulsert med tumor-avledede peptider utløst høye nivåer av antigen-spesifikke og funksjonelle cytotoksiske T-celleresponser (opp til 98% tetramer
+ CD8 T-celler). PDC-vaksine viste sterk anti-tumor terapeutiske effekt in vivo, som vist ved inhibering av tumorvekst i en humanisert musemodell. Det også utløst svært funksjonelle kreftspesifikke T-celler ex-vivo fra PBMC og TIL i stadium I-IV melanom pasienter. Responser mot Mela, GP100, tyrosinase og MAGE-3 antigener nådde tetramer nivåer opp til 62%, 24%, 85% og 4,3% henholdsvis. PDC vaksine primet T-celler spesifikt drept pasientenes egne autologe melanoma tumorceller. Dette semi-allogen PDC vaksinen var mer effektiv enn konvensjonelle myeloide DC-baserte vaksiner. Videre PDC vaksine utformingen endows det med et stort potensial for klinisk anvendelse i behandling av kreft.
Konklusjoner
Disse funnene markere HLA-A * 0201 matchet allogene PDCs som potente induktorer av svulst immunitet og gi en lovende Immun strategi for å bekjempe kreft
Citation. Aspord C, Charles J, Leccia MT, Laurin D, Richard MJ, Chaperot L, et al. (2010) A Novel Cancer Vaccine strategi basert på HLA-A * 0201 matchede Allogen Plasmacytoid dendrittiske celler. PLoS ONE fem (5): e10458. doi: 10,1371 /journal.pone.0010458
Redaktør: Graham Pockley, University of Sheffield, Storbritannia
mottatt: 04.12.2009; Godkjent: 07.04.2010; Publisert: 04.05.2010
Copyright: © 2010 Aspord et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Institut National du Cancer (ACI-63-04 og canceropole 2004-05) og Etablissement Français du Sang. J. Charles var en mottaker av tilskudd fra National Academy of Medicine og canceropole 2004-05. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
utviklingen av effektive vaksiner for kreftbehandling representerer et stort folkehelseproblem [1]. Fordi cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) er i stand til å gjenkjenne og lysere ondartede celler, har mange terapeutiske studier blitt utviklet for å forsterke CTL-responser. Myeloide dendritiske celler (MDC) -baserte vaksiner lyktes i å fremkalle spesifikke T-celler i pasienter, men uten tilstrekkelig klinisk effekt [2], [3]. Adoptiv overføring av cellulær antitumor effektor T-celler forsterket ex vivo fra TIL indusert objektiv tumorregresjon [4], [5], men kompleksiteten av denne strategien har hindret bred utvikling. Derfor er det et sterkt behov for nye immunterapeutiske strategier for å overvinne begrensningene i nåværende protokoller.
Opp til nå, induksjon av spesifikke T-celleresponser for både adoptive og aktive immunterapeutiske strategier har vært basert på mDCs [6 ] – [8]. Plasmacytoid dendrittceller (PDC) er imidlertid nøkkelspillere i immunitet [9], [10] med en rolle i tumor-spesifikke immunresponser [11]. PDCs avvike fra mDCs i mange aspekter som TLR uttrykk, migrasjon profil og immunresponser utløsende. pdc er også i stand antigenerobring, prosessering og presentasjon [12] – [15]. Antigen-pulset PDC kan stimulere bestemte primære (Mela) og minne (influensa) autologe CD4 og CD8 T-celle immunresponser in vitro [16] – [19] og prime funksjonelle T-celle responser in vivo som vises etter vaksinering av mus med CpG eller virus-aktivert PDC [20] – [21]. pdc finnes innenfor mange tumorer hos mennesker [22] – [26], hvor de er antatt å være umodne, tolerogene eller assosiert med dårlig prognose. Men i melanom, kan PDC aktivering ved TLR-L utløse potente antitumoreffekter. Hos mus imiquimod program (TLR7-L) [27] eller intratumoral injeksjon av CpG (TLR9-L) [28] snudd den funksjonelle hemming av PDC, og dermed fremme tumorregresjon. Videre lokal CpG administrasjon i melanom pasienter indusert rekruttering og aktivering av PDC i sentinel lymfeknuter [29] og senere kreftspesifikke CD8 T-celler assosiert med klinisk nytte [30]. Potensialet av PDC i å generere effektiv tumor-spesifikke immunresponser er også blitt påvist i en musemodell [31]. PDC-baserte metoder og TLR-agonister [32] er derfor lovende for behandling av human cancer.
tumorantigener vanligvis utløse svake reaksjoner. I motsetning til dette, allogene responser rettet mot ikke-selv MHC er ekstremt potente. Interessant nok er den allogeneiske respons mediert av MHC klasse II-begrenset CD4 + T-celler fremmer bystander spesifikk T-celle-induksjon [33], [34] som allerede er vist med viruspeptider [35] og tumorregresjon etter allogen hudtransplantat [36]. Allogeneicity derfor kunne utnyttes til å fremme immunogenisitet mot tumorantigener [37] når de vurderer en delvis HLA kampen mellom vaksinen og pasienten, videre omtalt som HLA matchet allogeneicity.
Fordi PDCs spiller en fundamental rolle i å utløse T celle responser, kan bruken være lovende som nye immunterapeutiske strategier. Imidlertid er bruk av autologt PDC for cancer immunoterapi vanskelig på grunn av knapphet på disse cellene [38] og mulig funksjonsendring PDCs høstet fra tumor-bærende pasienter. Vi utforsket derfor potensialet i HLA-A * 0201 matchet allogen PDC å indusere HLA-A * 0201-begrenset anti-tumor immunitet. Vi brukte en unik menneskelig PDC cellelinje (GEN) etablert fra leukemisk HLA-A * 0201
+ PDC med fenotypiske og funksjonelle egenskaper stengt for primær PDCs [39], [40], [41]. Strategien besto av ved hjelp av de peptid-lastet PDCs å indusere HLA-A * 0201-begrenset antigen-spesifikke CTL. Vi viser her ved hjelp av tumor og virale modell antigener potensialet av det bestrålte peptid-pulset humant HLA-A * 0201 tilpasset allogene PDC linje (GENiusVac) in vitro, sin terapeutiske effekt in vivo hos humaniserte mus, og dens kliniske relevansen ex vivo med melanom pasientenes celler. Våre funn markere HLA-A * 0201 matchet allogene PDCs som potente indusere av anti-tumor immunitet og gi en lovende ny Immun strategi for å bekjempe kreft.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
kulturer ble utført i RPMI 1640 Glutamax supplementert med 1% ikke-essensielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat (Sigma), 100 ug /ml gentamycin og 10% FCS (alle fra Invitrogen med mindre varslet). Melanom linjen Me275 ble gitt av Pr J-C Cerottini (Ludwig Institute for Cancer Research, Epalinges, Sveits). Melanom linjer COLO829 og A375, T2 og K562 linjer ble kjøpt fra ATCC (LGC Standards, Molsheim, Frankrike). Melanom linjen Mel89 ble generert i vårt laboratorium (figur S1). Anti-human CD45, CD3, ble CD8 Abs kjøpt fra Beckman Coulter. Anti-HLA-A2 Abs ble kjøpt fra BD Biosciences og anti-human Mela fra Sigma.
Peptider og tetramerer
Vi brukte følgende Virus-og tumor-avledet HLA-A * 0201 bundne peptider (NeoMPS) og tilsvarende itag HLA-A * 0201 tetramers (Beckman Immunomics): Mela
26-35 (ELAGIGILTV), GP100
209-217 (IMDQVPFSV), tyrosinase
369-377 (YMDGTMSQV ), MAGE-3
271-279 (FLWGPRALV), FluM1
58-66 (GILGFVFTL), CMVpp65
495-503 (NLVPMVATV).
PBMC, PDC linje, primær PDC isolasjon og mDCs generasjon
Menneskelig PBMC ble oppnådd fra HLA-A * 0201
+ friske donorer av Ficoll-Hypaque densitetsgradientsentrifugering (Eurobio). Den humane pdc linje GEN2.2 ble dyrket som tidligere beskrevet [39]. Primær PDC ble isolert fra blodet av HLA-A * 0201
+ friske donorer. DC ble først beriket av uttømming av uønskede celler ved hjelp av Pan DC pre-berikelse kit (StemCell). Gjenvundne celler ble enten sendt til BDCA4 + seleksjon (Miltenyi) eller merket med en avstamning cocktail, CD123, HLA-DR og CD11c antistoffer (BD) og sorteres på en BD FACSAria på basis av CD123 og HLA-DR ekspresjon og mangel på Lin og CD11c markører. Renheten av PDC etter slag som var over 98%. mDCs ble differensiert fra blodmonocytter anvendelse av 500 U /ml GM-CSF og 10 ng /ml IL-4 (Tebu Prepotech, Frankrike) i 6 dager. Denne studien ble gjennomført under en prosedyre som er godkjent av det franske Blood Agency Institutional Review Board. Alle givere signert informert samtykke former.
Melanom pasientprøver
Prøver ble hentet fra fase I til IV HLA-A * 0201 melanom pasienter som registrerte informert samtykke former. Vi brukte ekstra materiale som ikke var nødvendig for pasientens diagnose eller analyse, og ikke kreves tilleggsprosedyrer. Derfor i samsvar med den franske regulering, ingen etikk godkjenning kreves, men informasjon og signert samtykke fra pasientene. Kliniske parametere er vist i tabell S1. Blodprøver ble erholdt fra 12 pasienter og PBMC renses ved gradient tetthet. Ferske tumorprøver ble innhentet fra 6 pasienter som gjennomgikk kirurgi for in-transit metastaser. Prøvene ble dilacerated og spaltet i 2 mg /ml kollagenase D (Roche Diagnostics) 20 U /ml DNase (Sigma). Deretter tumorceller ble isolert fra cellesuspensjonen ved tilslutning og TIL anriket fra den ikke-adherente fraksjon av tetthets-gradient.
spesifikke T-cellerespons induksjon in vitro
GEN celler ble først ladet med ett eller flere peptid (er) av interesse. I korthet ble cellene vasket 3 ganger med serumfritt RPMI og resuspendert til 1.10
6 celler /ml. β2-mikroglobulin (0,1 ug /ml endelig) (Sigma) og peptid (er) (1-10 pM sluttkonsentrasjon) (NeoMPS) ble tilsatt. Etter 3 timers inkubering ved 37 ° C ble cellene vasket to ganger, bestrålt med 30Gy og resuspendert ved 2,10
5 celler /ml i RPMI med 10% FCS. Peptid-lastet GEN ble deretter ko-dyrket med semi-allogen HLA-A * 0201 PBMC i et 01:10 forhold i RPMI + 10% FCS i minst 7 dager. Kulturer ble ukentlig restimulert med peptid-lastet GEN og 200 U /ml IL-2 (Proleukine, Chiron). I noen eksperimenter, ikke-stimulerte primære PDCs eller mDCs modnet med LPS (1 pg /ml) ble anvendt etter de samme betingelser. I noen forsøk som blokkerer anti-IFNα (50.000 U /ml) og anti-IFNβ (25.000 U /ml) antistoffer (PBL medisinske laboratorier) eller kontroll geite-IgG ble tilsatt ved dag 0 og dag 2 av kulturen. Spesifikke CD8 T-celle-responser ble målt ved hjelp av tetramer merking av PBMC innledningsvis og på forskjellige trinn av kulturen. Cellene ble resuspendert i HBSS med 2% FCS, farget med CD45 FITC, itag HLA-A * 0201 tetramer PE, CD3 PC7-, CD8 APC antistoffer og analysert ved flowcytometri analyse ved hjelp av en FACSCalibur og Cell quest software (Becton Dickinson). For å bestemme innledende tetramerfritt nivåer, minst 1 til 2,10
6 arrangementene ble kjøpt.
In vitro funksjonelle analyser
IFNy sekresjon og CD107 uttrykk ved tetramer + CD8 T-celler.
T-celler ble først merket med itag HLA-A * 0201-tetramer PE for 30 minutter ved romtemperatur, vasket og restimulert med peptid-pulset T2 celler (10:01 forhold) for 5 H30. For IFNy sekresjon, en ul /ml Brefeldin A (BD Biosciences) tilsatt for siste 3 timer. Cellene ble deretter overflate merket med anti-CD3 PC7 og anti-CD8 APC antistoffer og sendt til IFNy intracellulær farging (BD Biosciences). For CD107 deteksjon, anti-CD107a og CD107b FITC-antistoff (10 ul /1,10
6-celler) (BD Biosciences) ble tilsatt i mediet ved begynnelsen av restimulering i nærvær av Golgi STOP (0,67 ul /ml) for siste 4 timer. Celler ble deretter merket med anti-CD3 PC7 og anti-CD8-antistoffer APC. IFNy og CD107-farging ble analysert på tetramer
+ CD8 + T-celler, tetramer
-.. CD8 + T-celler og CD4 + -T-celler
Cytotoksisitet assay
Antigen-spesifikk cytotoksisk aktivitet ble målt ved å utføre en standard
51Cr frigivelse assay. T-celler ble sortert fra co-kulturen ved hjelp av en EasySep human T-celle berikelse kit (Stem Cell). Målceller (peptid-pulset T2 celler, K562, allogene eller autologe tumorceller) ble merket med 50 uCi i 1 time ved 37 ° C, vaskes 3 ganger og sådd med effektor-T-celler ved den angitte E: T-forhold i rundbunnet 96 -vel platene. Etter 4 timers inkubering, ble radioaktiviteten målt på 30 pl av supernatantene på en mikroplate-scintillasjonsteller Top Count NXT (Perkin Eimer). Gjennomsnittet av triplikate målinger ble uttrykt som en prosent av spesifikk lysis med formelen:. (Sample frigjøring – spontan frigjøring) /(maksimal frigivelse – spontan frigivelse) x 100
In vivo-funksjonelle forsøk i mus humaniserte
NOD-SCID β
2 m
– /- immunodeficient mus (NOD.Cg-Prkdc
SCIDβ
2 m
Tm1Unc /J) ble kjøpt fra Jackson Immunoresearch Laboratories (Bar Harbor , USA) og avlet på Plateforme de Haute Technologie Animale (Phta, La Tronche, Frankrike). For aktive behandlingsforsøk, ble huPBL mus konstruert ved å transplantere intraperitonealt (ip) 50.10
6 PBMC fra friske donorer i sublethally bestrålt NOD-SCID β
2 m
– /- mus (120-150 CGY). Mus ble ytterligere vaksinert med 5.10
6 bestrålte peptid-pulset GEN celler ved ip eller sc ruter gang i uken. Respons på vaksinasjon ble analysert ved ulike tidspunkt i blodet, peritoneal lavage, milt og lymfeknuter. Organer ble spaltet i 30 minutter ved 37 ° C med 2 mg /ml kollagenase D (Roche Diagnostics). Resulterende cellesuspensjoner ble vasket med HBSS + 2% FCS, farget ved hjelp av følgende anti-humane antistoffer (CD45 FITC, itag HLA-A * 0201 tetramer PE, CD3 PC7-, CD8 APC) og sendt til flowcytometri analyse. For å vurdere terapeutisk effektivitet, ble 1,10
6 humane tumorceller implantert subkutant i flanken av de humaniserte mus enten 5 dager etter (profylaktisk) eller 4 dager før (terapeutisk) den første vaksineringen. Vaksinasjon ble gjentatt hver uke. Tumorstørrelse ble overvåket etter 2-3 dager og tumorvolum beregnes med formelen: (kort diameter)
2 x lang diameter /2. For å analysere spesifikke T-celler i svulsten nettstedet og i DLN, ble vev fordøyd som tidligere beskrevet og cellesuspensjoner ble sendt til tetramer merking og flowcytometri analyse. Alle i-vivo eksperimenter har blitt godkjent av Regional komité for Animal Ethic Rhone-Alpes (CREEA) tilknyttet CNRS.
Statistisk analyse
De statistiske analysene ble utført ved hjelp av Mann-Whitney ikke parametrisk U test og uparet t-test ved bruk av Prism programvare.
Resultater
Menneske HLA matchet allogene PDCs indusere antigen-spesifikk T-celle responser fra frisk donor PBMC med en sterk effekt in vitro
for å undersøke potensialet for HLA matchet allogen PDC i antigen-spesifikk T-celle responser induksjon, sammenlignet vi muligheten av peptid-lastet primære PDC sortert fra friske givere «blod å indusere spesifikke T-celle responser i autolog og allogen HLA-A * 0201-matchet innstillinger. PDC førte til en betydelig høyere spesifikk T-celle-induksjon i HLA-A * 0201 tilpasset allogene innstillinger i forhold til autologe betingelser (forsterkning av det absolutte antall Mela-spesifikke T-celler i 7 dager: 35,6 ± 8,9 vs 17,9 ± 8,7, gjennomsnitt ± SEM , p = 0,02) (figur 1A og 1B, fire eksperimenter utført med tre forskjellige donorer). Som knapphet på primær PDC hindrer deres bred terapeutisk anvendelse vi brukte den humane PDC-cellelinje (GEN) etablert fra leukemisk HLA-A * 0201
+ PDC som en kilde for HLA-A * 0201 tilpasset allogene PDCs. For å vurdere om det bestrålte HLA-A * 0201
+ PDC linje kan indusere spesifikke T-celle responser som primær PDC in vitro, allogen HLA-A * 0201
+ PBMC fra friske donorer ble stimulert med bestrålte peptid-loaded GEN celler. For både tumor (Mela) og virale (influensa) avledede peptider, fikk vi en massiv forsterkning av spesifikke T-celler etter bare syv dager med kultur som oppdages av tetramer merking (figur 1C, Figur S2). Denne induksjon ble ytterligere forbedret ved seriestimuleringer hver 7. dag med peptid-lastet PDC linje, i kombinasjon med IL-2. Vi rutinemessig fått 5-25% av tetramer
+ CD8 T-celler etter 7 dager, 40-60% etter 15 dager, og opp til 98% etter 40 dager (figur 1C). Slike høye responser ble gjengitt med celler fra friske givere 14-20 og med forskjellige melanoma tumor-avledede antigener slik som Mela, GP100, TYR, MAGE-3 (figur 1 D), så vel som virus-avledede antigener (figur S2). Tumor-spesifikke tetramer
+ T-celle responser nådd gjennomsnitt på 22% for Mela (range 2-60%), 0,3% for GP100 (range 0-3%), 1,2% for TYR (range 0-8%) og 0,84% for MAGE-3 (område 0-4%) i 20 dager. Multi-spesifikke responser ble også indusert ved hjelp av GEN-celler lastet med flere forskjellige peptider (ikke vist). Således HLA matchet allogeneiske primære PDCs eller PDC linje fremkalle sterke primær- og hukommelses antigen-spesifikke T-celle responser in vitro fra friske donorer.
(A, B) av autolog eller allogen HLA-A * 0201
+ primær PDC sortert fra blodet hos friske givere ble pulsert med Mela peptid og anvendt for å stimulere HLA-A * 0201
+ PBMC. Den spesifikke T-celle-responsen ble analysert ved d7 av tetramer merking. (A) Prosent av Mela spesifikke T-celler (inngjerdet på CD8 + T-celler). En representant eksperimentet er vist. (B) amplifisering av det absolutte antall spesifikke T-celler fra d0 til d7 (4 uavhengige eksperimenter utført med 3 forskjellige donorer). (C, D) allogene HLA-A * 0201
+ PBMC fra friske donorer ble stimulert med bestrålte peptid belastede HLA-A * 0201
+ PDC linje og ukentlig restimulert i nærvær av IL2. Spesifisitet av T-cellene ble bestemt ved tetramer merking og strømningscytometri-analyse. (C) Representative dotplots gating på CD8 + T-celler (venstre panel) og prosenter (panel høyre) over Mela tetramer
+ T-celler i kultur utgangspunktet og på ulike tidspunkter etter stimulering med PDC linjen lastet med Mela peptid. Influensa tetramer ble anvendt som kontroll. (D) Representative dot plots gating på CD8 + T-celler (venstre panel) og prosentandeler av tetramer
+ CD8 + T-celler oppnådd på dag 7, 14 og 20 av kulturen mot Mela (n = 18), gp100 (n = 16 ), TYR (n = 16) og MAGE-3 (n = 16) tumorantigener.
De spesifikke T-celler indusert av HLA matchet allogen PDC stilt in vitro funksjonell HLA-begrenset aktivitet
Vi videre undersøkt funksjonaliteten til de spesifikke T-celler indusert av HLA-A * 0201 matchet allogen PDC linje. Vi først analysert evnen av tumor-spesifikke T-celler til å utskille IFNy og hurtig CD107 ved restimulering. Når ko-dyrket med peptid-lastet T2 celler, Mela-spesifikke T-celler utskilt IFNy og uttrykt CD107 i nærvær av den relevante men ikke kontroll peptid (figur 2A). Vi oppnådd i løpet av tumor-reaktive T-celler gjennomsnitt av 25% IFNy
+ tetramer
+ CD8 T-celler ved spesifikke restimulering sammenlignet med 5% i henhold til kontrollbetingelser (p = 0,007), og 50% CD107
+ tetramer
+ CD8 T-celler ved spesifikke restimulering sammenlignet med 24% i henhold til kontrollforhold (p = 0,02) (data ikke vist). Vi neste testet deres cytotoksisitet ved å utføre
51 Cr frigjøring analyse ved hjelp av peptid-lastet T2 celler og melanom svulst linjer som mål. Mela-spesifikke T-celler viste en sterk cytotoksisk aktivitet mot T2 celler lastet med relevant men ikke med kontroll peptid (figur 2B). Vi erholdt 88% av spesifikk drepe versus 13% i henhold til kontrollbetingelser (gjennomsnitt av 8 forsøk, s 0,001) (ikke vist). I tillegg Mela-spesifikke T-celler var i stand til å lysere HLA-A * 0201
+ Mela
+ (Me275), men verken HLA-A * 0201
+ Mela
– (A375) eller HLA -En * 0201
-MelA
+ (COLO829) melanom svulstceller (figur 2B, Figur S1) demonstrerer HLA-A * 0201-begrensning og antigen spesifisitet av denne aktiviteten. Videre ble dette lyse inhibert av EGTA-MgCl2 eller ved CD8 T-celle-uttømming (ikke vist), som sammen med CD107 overflate-ekspresjon ved spesifikk restimulering, foreslår en mekanisme som omfatter cytolytisk granulat exocytose fra CD8 T-celler. Slike funksjonelle kapasitet ble observert med T-celler som er tatt ved forskjellige tidspunkter av den 7-40 dagers kultur. Tilsvarende analyse utført med virus-spesifikke T-celler viste kapasiteten Flu tetramer
+ T-celler til å utskille IFNy og uttrykke CD107 på spesifikke restimuleringen, og deres cytotoksiske egenskaper (Tall S3A og S3b). Viktigere, observerte vi bare en mindre allogen respons-induksjon, som er bekreftet dårlig aktivering av ikke-spesifikk tetramer
– CD8 + T-celler og CD4 + T-celler mot GEN celler. Dette ble observert etter en stimulering (Flu respons) (figur S3C og S3D), men også etter gjentatte stimuleringer med PDC linjen (Mela respons), ved å måle IFNy-sekresjon (figur 2C) og CD107-uttrykker T-celler (figur 2D) på restimuleringen med T2 eller GEN celler. Vi har også observert fravær av tetramer
+ T-celleaktivitet mot GEN celler ladet med et irrelevant peptid. Dermed utløser PDC linje fullt ut funksjonell antigen-spesifikke T-celler med mindre bystander allogene responser.
(A) mela-spesifikke T-celler indusert ved PDC linje utskiller IFNy og hurtig CD107 på overflaten ved spesifikke restimulering. Celler fra kultur (dag 14) ble sendt til tetramer merking og restimulert med T2 celler pulsert med en relevant eller kontroll peptid. IFNy-produksjon ble vurdert ved intracellulær farging og CD107 ekspresjon ved tilsetning av anti-CD107a + B-antistoffer under restimulering. Dotplots er inngjerdet på tetramer
+ CD8 + T-celler. Representant for 8 eksperimenter utført med 3 givere på dag 8-40 av kulturen. (B) Mela-spesifikke T-celler indusert av PDC linjen er cytotoksiske. T-celler ble valgt ut fra kultur og sendt til en
51 Cr frigjøring analyse ved hjelp av peptid-lastet T2 celler og melanoma kreftceller som mål. Representant for 8 eksperimenter utført med 4 givere på d13-40 av kulturen. (C, D) IFNy sekresjon og CD107 ekspresjon ble vurdert som beskrevet i (A) etter tre stimuleringer av PBMC og analysert på tetramer
+ CD8 + -T-celler (hvite stolper) og på den ikke-spesifikke tetramer
– CD8 + T-celler (grå søyler) og CD4 + T-celler (svarte søyler) ved restimulering med peptid-pulset T2 eller GEN celler (4 eksperimenter for hver tilstand).
Den peptid-lastet HLA matchet allogen pdc linje utløser sterke in vivo-antigen-spesifikke T-celle-responser i mus humanisert
bruken av HLA-tilpasset allogene PDCs som en vaksine krever induksjon av antigen-spesifikk T-celle responser in vivo. Derfor vurderte vi vaksinen potensialet i PDC linje i en humanisert musemodell [42] konstruert av xenotransplanting menneskelig PBMC inn immunodeficient NOD-SCIDβ
2 m
– /- mus (huPBL SCID-modell). Tjuefire timer etter intraperitoneal overføring, ble human CD45
+ hematopoetiske celler funnet på injeksjonsstedet, men også i omløp og lymfoide organer (ikke vist). En enkelt intra-peritoneal injeksjon av det bestrålte peptid belastede HLA-A * 0201 tilpasset allogen PDC linje induseres sterke antigen-spesifikke T-celle responser mot viral (FluM1, CMVpp65) og tumor (Mela) antigener i huPBL mus (figur 3A). Humant tetramer
+ CD8 T-celler ble funnet ikke bare på stedet for immunisering (peritoneal lavage), men også i sirkulasjonen (blod) og lymfoide organer (milt, lymfeknuter) (Figur 3A). Vi evaluerte deretter om flere ukentlige injeksjoner av peptid-pulsede PDC linje kan øke nivået av responsen. Interessant, virusantigen (influensa) induserte en høy svar som toppet seg 7 dager etter første vaksine og redusert etterpå, mens respons til tumor antigen (Mela) holdt øke ved senere restimulations (figur S4). Innenfor alle vaksinert huPBL mus (n = 22, 18 og 38) rekonstituert med humant PBMC (baseline nivå av tetramer + CD8 + T-celler var 0,11% (FluM1), 0,12% (CMVpp65) og 0,01% (Mela) tetramer
+ T celler) nivåer av spesifikke T-celler som gjenfinnes i de ulike organene varierte 0,7 til 1,9% for FluM1, 1.1 til 5.9% for CMVpp65, og 0,2 til 1% for Mela (figur 3B). Dermed utløser peptid-pulsede PDC linje sterke og omfattende antigen-spesifikke T-celle responser in vivo
(AB) immunsvikt NOD-SCIDβ
2m
-. /- Mus ble rekonstituert intraperitonealt med 50,10
6 human HLA-A * 0201
+ friske givere «PBMC og vaksinert ved samme rute med 5.10
6 bestrålt peptid-lastet GEN celler. Spesifikk T-celle-induksjon ble analysert ved injeksjonsstedet (lavage), i sirkulasjonen (blod) og lymfoide organer (milt, LN) ved tetramer merking av humane T-celler i cellesuspensjoner. (A) Vaksinasjon med peptid-lastet GEN-celler indusert spesifikke T-celle responser in vivo. Representative prikkplotter av tetramer merket T-celler indusert etter en enkel vaksinering med peptid-lastet GEN celler i ulike organer i dag 8 for anti-virusvaksine (influensa, CMV) og dag 10 for anti-tumor vaksine (Mela) (inngjerdet på CD8
+ T-celler). En mus per gruppe er vist. Innledende nivåer av spesifikke T-celler i løpet av PBMC var 0,04%, henholdsvis 0,14% og 0,003%. (B) Nivåer av spesifikke T-celler før (dag 0) og etter vaksinering med GEN lastet med FluM1 (n = 22 mus, 4 givere, en vaksine), CMVpp65 (n = 18 mus, 2 givere, en vaksine) og Mela ( n = 38 mus, 4 givere, 2-3 vaksiner) peptider ved de angitte tider i forskjellige organer. Hver prikk representerer en vaksinert huPBL mus (barer på gjennomsnittet).
Vaksinasjon med peptid-lastet HLA matchet allogen PDC linjen beskytte humanisert mus fra tumorprogresjon hos både profylaktiske og terapeutiske innstillinger
Vi neste undersøkte den terapeutiske potensialet i denne strategien i humanisert mus ytterligere innpodet med menneskelig svulst. NOD-SCIDβ
2 m
– /- mus ble rekonstituert intra-peritonealt med menneskelig HLA-A * 0201
+ PBMC og ukentlig vaksinert subkutant med bestrålte peptid-pulset GEN celler før eller etter å ha blitt utfordret med melanom svulst celler. I et forebyggende setting, injeksjon av huPBL mus med Mela-lastet GEN celler, sammenlignet med influensa-lastet GEN celler, hemmet HLA-A * 0201
+ Mela
+ tumorvekst (Me275) i fem uavhengige forsøk (tumor størrelse på dag 27 = 12 vs 77 mm
3, p 0,0001) (Figur 4A og 4C). I motsetning veksten av HLA-A * 0201
-MelA
+ (COLO829) og HLA-A * 0201
+ Mela
– (A375) melanom svulster ble ikke påvirket etter injeksjon av Mela eller influensa-loaded GEN-celler i tre uavhengige eksperimenter (figur 4C), noe som viser den HLA-A * 0201-restriksjon og antigen spesifisitet av terapien. Videre peptidet belastede PDC også fremkalle en beskyttende immunrespons mot allerede etablerte tumorer. Vaksinasjon av tumorbærende huPBL mus med Mela-lastet GEN celler hemmet tumorvekst sammenlignet med influensa-lastet GEN celler (tumorstørrelse på dag 25 = 6 vs 36mm
3, p = 0,01) (figur 4D-4F). Spesielt, tetramer
+ CD8 + T-celler ble funnet på tumorstedet og i de uttrekk LN (figurene 4B og 4F), noe som tyder på at tumor-reaktive T-celler indusert av HLA matchet allogene PDC hadde migrert til setet for antigenet uttrykk og T-cellene var i stand til å drepe kreftceller
(AC) immunodeficient NOD-SCID β
2 m
-. /- mus rekonstituert intraperitonealt med human HLA-A * 0201
+ PBMC (huPBL mus) ble ukentlig vaksinert subkutant med bestrålt Mela eller influensa-lastet GEN celler og utfordret 5 dager senere med melanom svulstceller i flanken. (A) Oppfølging av tumorprogresjon. Ett eksperiment representant for 5. (B) Tetramer merking av svulsten og drenering LN cellesuspensjoner fra huPBL mus vaksinert med Mela-lastet GEN celler som viser tilstedeværelse av Mela-spesifikke T-celler (inngjerdet på CD8 + T-celler). (C) De terapeutiske virkningene av vaksinen er HLA-A * 0201-begrenset og antigen-spesifikke. Sammentumorstørrelse 27 dager etter implantasjon av Me275, COLO829 og A375 melanomceller i huPBL mus vaksinert med Mela eller influensa-lastet GEN celler (pool av 3 uavhengige eksperimenter for hver tumortype utført med 6 til 14 mus per gruppe). (DF) immunodeficient NOD-SCID β
2 m
– /- mus rekonstituert intraperitonealt med human HLA-A * 0201
+ PBMC (huPBL mus) ble først utfordret med melanom Me275 tumorceller i flanken og deretter vaksinert subkutant med bestrålt Mela eller influensa-lastet GEN celler ukentlig starter 4 dager senere. (D) Oppfølging av tumorprogresjon. En representant eksperiment av 2. (E) Comparative tumorstørrelse 25 dager etter tumor implantasjon (pool av 2 uavhengige eksperimenter, 8 mus /gruppe). (F) Tetramer merking av svulsten og drenering LN cellesuspensjoner fra huPBL mus vaksinert med Mela-lastet GEN celler som viser tilstedeværelse av Mela-spesifikke T-celler (inngjerdet på CD8 + T-celler).
HLA matchet allogen PDC tråd lastet med melanom-avledet peptider induserer multi-spesifikke og svært funksjonelle T-celle responser ex-vivo fra stadium i-IV melanom pasienter
Vi neste undersøkt relevansen av denne strategien hos kreftpasienter. Vi testet kapasiteten til peptid-pulset PDC linje for å utløse ex-vivo tumor-spesifikke responser fra PBMC og tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL) isolert fra trinn IV HLA-A * 0201
+ melanompasienter (Tabeller S1 og S2 ). Ukentlig stimulering av pasientenes PBMC med PDC linjen pulset enten med Mela, GP100, TYR eller MAGE-3 peptid førte til massiv forsterkning av spesifikke CD8 + T-celler i minst 2 av 4 melanom antigener (5A og 5B). Svulsten spesifikke tetramer
+ CD8 T-celle responser nådd gjennomsnitt av 23% for Mela (range 0,4 til 62%), 1,2% for GP100 (område 0,05 til 3,5%), 0,3% for TYR (område 0,01 til 2,5% ) og 0,2% for MAGE-3 (område 0,03 til 0,72%) etter 20 dager (baseline tetramer + CD8 + T-celler varierte 0,02 til 0,03% ved d0). En pasient ble ekskludert fra analysen på grunn av en ekstremt intens respons (85% tetramer
+ T-celler på dag 14) mot TYR (figur S5). Videre gjentatte stimuleringer av patients’TIL med PDC linje pulset med en blanding av de 4 melanom peptider førte til den massive amplifikasjon av spesifikke T-celler i minst 3 antigener (figurene 5C og 5D). Tumor-spesifikke tetramer
+ CD8 T-celle responser nådd gjennomsnitt av 39% for Mela (range 12-59%), 7,4% for GP100 (range 0,2 til 24%), 0,3% for TYR (område 0,05 til 1,2%) og 1,1% for MAGE-3 (range 0,1 til 4,3%) etter 20 dager med baseline nivå format dag henholdsvis 0 1,7, 0,2, 0,05 og 0,3%,.
