Abstract
Cervical kreft celler viser en økt krav til ubiquitin-avhengige protein degradering assosiert med en forhøyet stoffskifte omløpshastighet. Ubiquitin, som er et lite, sterkt konservert protein uttrykt i alle eukaryote celler, kan være kovalent bundet til bestemte målproteiner å merke dem for nedbrytning av ubiquitin-proteasom-system. Tidligere studier markere viktig rolle Ubiquitin B (UBB) og UBB-avhengige proteasomal protein nedbrytning i histondeacetylase inhibitor (HDACi) -indusert svulst selektivitet. Vi antok at UBB spiller en avgjørende rolle i funksjon av livmorhalskreftstamceller. Vi målte endogene UBB nivåer i mammospheres
in vitro
av real-time PCR og Western blotting. Funksjonen til Ubb i kreft stilk-lignende celler ble vurdert etter knockdown av Ubb ekspresjon i forlengede Trichostatin A-markerte HeLa-celler (HeLa /TSA) ved å måle
in vitro
celleproliferasjon, celle apoptose, invasjon, og kjemoterapi motstand samt ved å måle
in vivo
vekst i en orthotopic modell av livmorhalskreft. Vi vurderte også kreftstamcelle frekvens, tumorsphere formasjon, og
in vivo
vekst av menneskelige livmorhalskreft xenografter etter UBB lyddemping. Vi fant ut at HeLa /TSA var resistent mot kjemoterapi, høyt uttrykt UBB genet og stamcellemarkører Sox2, OCT4 og Nanog. Disse cellene vises også indusert differensiering evner, inkludert forbedret migrasjon /invasjons /malignitet evner
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre ble en forhøyet ekspresjon av Ubb vist i tumorprøver av kjemoterapi pasienter. Stanse av UBB hemmet tumorsphere formasjon, senket uttrykk for stamcellemarkører og redusert livmorhals xenograft vekst. Våre resultater viser at UBB ble betydelig økt i lengre Trichostatin A-utvalgte HeLa-celler, og det spilte en sentral rolle i opprettholdelsen av livmorhalskreft stilk-lignende celler.
Citation: Tian Y, Ding W, Wang Y, Ji T, Sun S, Mo Q, et al. (2013) Ubiquitin B i livmorhalskreft: Kritisk for vedlikehold av kreft Stilk-Like Cell tegn. PLoS ONE 8 (12): e84457. doi: 10,1371 /journal.pone.0084457
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 19 august 2013; Godkjent: 22 november 2013; Publisert: 18.12.2013
Copyright: © 2013 Tian et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Science Foundation National of China (No. 81372806, 81101962, 81101965, 81202060). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP er den nest vanligste kreftformen blant kvinner under 65 år og den hyppigste dødsårsaken fra gynekologisk kreft på verdensbasis. En kvinnes risiko for å utvikle livmorhalskreft ved 65 års alder spenner fra 0,69% i utviklede land til 1,38% i utviklingsland. I 2010, omtrent 75, ble 000 nye tilfeller av livmorhalskreft diagnostisert i Kina [1,2]. Foreløpig ca 35% av kvinner diagnostisert med livmorhalskreft har tilbakevendende sykdom, med 90% av disse finnes innen 3 år etter første behandling [3]. På grunn av multi-medikamentresistens og også motstand mot radioterapi, vil konvensjonelle metoder ikke være effektive for tilbakevendende tilfeller. Bedre målrettet terapi og chemo /radio-allergi strategier er avgjørende for å redusere dødeligheten av denne ødeleggende malignitet.
Identifiseringen av kreft stamceller-lignende celler i solide svulster åpner nye tilnærminger til kjemoterapi; en bedre forståelse av mekanismene som ligger til grunn karsinogenese og behandlingsresistente egenskaper av kreft stilk-lignende celler er nødvendig. I de siste årene har oppsamling av bevis antydet at potensialet for å initiere en tumor, inklusive cervical carcinoma, er en ganske unik egenskap ved en liten undergruppe av stilk-lignende celler som kalles «kreft stamceller» (cscs) eller «tumor-initiering celler «. Cscs har den eksklusive muligheten til å fornye seg selv, og dermed utvide pool av cscs og la svulsten til å differensiere i den heterogene ikke-tumorigent kreft [4]. Den cscs hypotesen har spennende kliniske implikasjoner i livmorhalskreft: det kan forklare terapi svikt og sykdom tilbakefall som følge av motstanden i cscs til døden stimuli. Faktisk, ved å beholde den biologiske kjennetegnene på stamceller vev, slik som quiescence, selvfornyelse og multimedikamentresistens, cscs utgjør en indre ildfast tumorcellepopulasjonen som er motstandsdyktig mot terapier utviklet for å utrydde hurtig delende celler. Derfor, identifisering og karakterisering av cscs er grunnleggende for prognose og behandling av livmorhalskreft [5].
I en tidligere studie, vi utførte SMART å identifisere de viktigste genene ansvarlig for tumor-selektive virkning av Trichostatin A ( TSA), en av de mest omfattende studert HDACis. Vi identifiserte Ubiquitin B (UBB), som kan kovalent kobling til visse target proteiner merking dem for nedbrytning av ubiquitin-proteasome system (UPS), som en formidler av kreft celle apoptose indusert av TSA. Tap av UBB gen-funksjon tillagt den sterkeste motstanden mot TSA behandling [6].
Vårt første funn i denne studien var at celler som overlevde TSA screening har noen egenskaper cscs. For å bekrefte egenskapene til disse kreft stilk-lignende celler, isolert vi sfære dannende celler (SFCs) ved screening livmorhalskreft cellelinjer. Karakterisering av disse SFCs ble definert av CSC-lignende funksjoner, inkludert høyere tumorigenicity enn foreldre HeLa-celler; forhøyet uttrykk for Sox2, Oct4 og Nanog; og multimedikamentresistens. Ekspresjonen av Ubb i disse stilk-lignende celler ble undersøkt i ytterligere forskning. Vi fant ut at vedlikehold av kreft stamceller-lignende egenskaper korrelert med UBB uttrykk, og stanse UBB uttrykket kan reversere kreft stamcelleegenskaper.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Tjueto pasienter som er diagnostisert livmorhals plateepitelkarsinom og gjennomgikk primær kirurgi direkte eller etter mottatt vanlig Cisplatin-basert kjemoterapi ble valgt til å delta i denne studien og alle pasientene gitt skriftlig informert samtykke. Den postoperative vevsprøver ble samlet ved Institutt for klinisk patologi, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (Hust). Informasjon om histopatologiske diagnosen ble anmeldt av minst to spesialister i gynekologisk patologi. Denne undersøkelsen ble gjennomgått og godkjent av etikkomiteen av Tongji Hospital, Tongji Medical College, Hust.
Xenotransplantat svulst studie
Disse eksperimentene ble utført ved hjelp av 6- til 8-ukers gammel kvinne nonobese diabetiker /alvorlig kombinert immunmangel (NOD /SCID) mus kjøpt fra HFK (Beijing) og plassert på Experimental Animal Center, Tongji Medical College, Hust. Mus ble valgt tilfeldig for hver gruppe; totalt seks mus per gruppe ble anvendt og plassert på tre per bur. HeLa HeLa og /TSA-celler ble trypsinert, telles og re-suspendert i 100 ul Dulbeccos PBS og deretter injisert subkutant. Vekstratene xenotransplantater ble målt hver tredje dag, og volumet ble beregnet ved hjelp av formelen: L × W
2 × 0,5. Fotografier av xenotransplantater ble tatt etter mus ble gitt en dødelig overdose av natriumpentobarbital anestesi. Alle forsøksprotokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Hust, og undersøkelsen ble utført i henhold til de kommer (forsøksdyr: Rapportering av
In vivo
Experiments) retningslinjer [7] {Kilkenny 2012 # 29}.
Cell kultur og transfeksjon
HeLa-celler ble oppnådd fra ATCC og vedlikeholdes i vårt laboratorium. HeLa /TSA-celler ble etablert ved behandling av HeLa-celler med 1 uM Trichostatin A (TSA, Sigma) i 24 timer, og deretter opprettholde cellene i 200 nM TSA for en annen 7 til 10 dager. De overlevende celler ble tillatt å komme seg i ytterligere 4-7 dager. Deretter ble de samlet og lov til å spre seg.
sirnas (Invitrogen) ble transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. En shRNA lentivirus ble brukt til å infisere celler etter produsentens protokoll.
UV eksponering av cellene
For UV-bestråling, celler ble sådd i en tetthet på 2 × 10
5 /ml og vokst til vedlegget ble oppnådd, og en enda mono ble dannet. Deretter ble cellene vasket to ganger med forvarmet PBS og utsatt for UV mens i PBS. UV-lys ble generert fra en 15-W UVB lampe (UVP), som avgir det meste av energien i UVB-området 280-370 nm, med en emisjonstopp ved 310 nm. Intensiteten av UVB ble standardisert av en UVB meter og satt til 200 J /m
2. Etter bestråling ble friskt medium tilsatt.
Transwell migrasjonsanalysen
HeLa HeLa og /TSA-celler ble sådd ut på et transwell kammer i 48 timer. Cellene som migrerte gjennom membranen ble fiksert og farget med 0,1% krystallfiolett og deretter undersøkt under et lysmikroskop.
Identifikasjon av SP celler
HeLa og HeLa /TSA celler ble trypsinert og inkubert med 5 ug /ml Hoechst 33342 fargestoffer (Roche) ved 37 ° C i 90 min; ble reaksjonen avsluttet ved inkubering i isvann i 10 min. De fargede celler ble analysert ved et FACSCalibur flowcytometer (BD) ved anvendelse av en 355 nm UV-eksitering; fluorescensemisjonen ble oppsamlet under anvendelse av et 450 nm båndpassfilter for Hoechst blå og et 670 nm båndpassfilter for Hoechst rødt. Datainnsamling og analyse ble utført med Cellquest Pro programvare (BD).
Colony formasjon, mammosphere dannelse og begrense utvannings analyser
HeLa og HeLa /TSA-celler ble talt opp og belagt med samme tetthet i en 6-brønns plate i 7 dager. Cellene ble vasket to ganger med PBS og fiksert med 4% paraformaldehyd i 10 minutter. Deretter ble cellene vasket med destillert vann i 5 minutter to ganger, og inkubert med 0,1% krystallfiolett farging løsning i 10 minutter. Til slutt, ble cellene vasket med destillert vann i 5 minutter to ganger, eller inntil den overskytende fargestoff ble fullstendig fjernet.
Mammosphere dannelse og begrensende fortynning analyser ble utført som tidligere beskrevet av Calcagno AM [8]. Vanligvis, utførte vi disse eksperimentene i HeLa og HeLa /TSA-celler for å vurdere mammosphere dannelse i ultra-lav feste kulturbrønner (Costar) i serumfritt DMEM /F12-medium supplert med rekombinant human epidermal vekstfaktor (EGF 10 ng /ml, Peprotech); rekombinant human fibroblast vekstfaktor-basiske (bFGF, 10 ng /ml, Peprotech); insulin (50 ug /ml, Sigma); B27 (100 enheter /ml, Invitrogen), penicillin (100 enheter /ml, Invitrogen) og streptomycin (100 ug /ml, Invitrogen). Mammospheres ble identifisert som beskrevet [9] hver 3 dager etter koloni spredning priser. Den begrensende fortynningsanalyse ble utført ved utsåing av forskjellige antall celler (fra 500 celler til bare en celle) per brønn inn i tre 96-brønners ultra-lav festeplatene. Spheroids ble talt på 14 dager eller senere, avhengig av vekstrater på kulene. Forsøkene ble utført in triplo, og de beregnede gjennomsnitt er presentert.
RNA isolering, revers transkripsjon og kvantitativ RT-PCR-analyse
Total RNA ble isolert ved hjelp av Qiagen RNeasy kit i henhold til produsentens instruksjoner. RNA kvantifisering ble bestemt ved anvendelse av et Nanodrop spektrofotometer mikro-volum (Thermo Fisher), og mRNA integritet ble bekreftet ved agarosegelelektroforese. Revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ble deretter utført ved bruk av 2 mikrogram av total RNA. Kvantitativ RT-PCR ble utført i en CFX96 Trykk
TM Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) ved hjelp av følgende thermocycler program for alle genene: 5 min av pre-inkubering ved 95 ° C etterfulgt av 40 sykluser med 15 s ved 95 ° C, 15 s ved 60 ° C og 30 s ved 72 ° C. Primerne for alle målgener og referansegenet er oppført i tabell S1. Datainnsamlingen, herunder gangers forandring i genekspresjon, ble bestemt fra den samme mengden total RNA.
Western blotting-analyse
Totalt celleproteiner ble hentet ut og løst med 10% SDS-PAGE, overført til PVDF polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (350mA i 1 time), og analysert med antistoffer mot UBB, UBC, UbA52, UbA80, pSTAT3, vimentin, Pakt og β-aktin (ProteinTech Group), MDR-1 og Oct4 (Santa Cruz), Sox2 og Nanog (Millipore). Proteinene ble visualisert ved hjelp av pepperrot konjugert sekundære antistoffer med SuperSignal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Pierce) og fotografert i ChemiDoc ™ XRS + system med bilde Lab ™ programvare (Bio-Rad).
Immunofluorescensanalyse av mammospheres
Mammospheres ble samlet etter ca 14 dager, avhengig av størrelse og vekstrater, og deretter vasket med PBS to ganger og sentrifugert ved 300 g. De mammospheres ble re-suspendert med Optimal temperatur skjære forbindelse (O.C.T., Sakura) og plassert i flytende nitrogen. Frosne kuler ble deretter skiver i 5-mikrometer tykke seksjoner. Immunfluorescens av disse frosne snitt ble utført i henhold til det primære antistoff produsentens protokoll. Fluorescensavbildning ble utført ved anvendelse av en konfokal laser scanning mikroskop.
Strømningscytometri
HeLa HeLa og /TSA-celler ble behandlet i 48 timer med 1 uM TSA, 30 uM DDP (Sigma, P4393), eller 75 nM Paclitaxol eller ble bestrålt med UVB. Deretter ble cellene trypsinert og inkubert med Annexin V-FITC og PI i henhold til produsentens protokoll. Den apoptose prosenten ble bestemt ved bruk av BD FACSCalibur flowcytometer og Cellquest Pro programvare (BD).
statistiske metoder
Statistisk signifikans ble bestemt av uparede Student t test med GraphPad Prism programvare (versjon 5.01) , bortsett fra for sammenligning av Ubb ekspresjon i kliniske livmorhalskreft vevsprøver, som ble analysert med en to-veis ANOVA test. Betydning for alle tester ble satt til
p
. 0,05
Resultater
Forlengede HDACi valgte HeLa /TSA celler var resistente mot kjemoterapi
Inkubasjon av HeLa-celler med TSA (500 nM) ved forskjellige tidspunkter (6, 12, 18 og 24 timer) induserte en tidsavhengig økning i Ubb mRNA og ubiquitin proteinnivåer (figur 1A), mens uttrykkene i den andre tre ubiquitin- koding gener (UbA52, UbA80 og UBC) ble ikke påvirket. Tilsvarende inkubering med forskjellige konsentrasjoner (200, 400, 600 og 800 nM) av TSA i 24 timer også resulterte i en økning av Ubb genekspresjon, mens ingen endring av uttrykkene for de andre tre ubiquitin-kodende gener ble observert. TSA administrasjon, innenfor et bestemt konsentrasjonsområde, i 24 timer førte til en bestemt konsentrasjonsavhengig stimulering av Ubb mRNA og protein ekspresjon (figur 1B).
A, HeLa-celler ble behandlet med 500 nM TSA for den indikerte ganger og utsatt for analyse mRNA nivået av UBB, UBC, UbA52 og UbA80 ved real-time PCR og tilsvarende proteinnivå ved western blotting. B, HeLa-celler ble inkubert med TSA i 24 timer i en dose i området fra 200 til 800 nm og underkastet analyse av mRNA-nivået av Ubb, UBC, UbA52 og UbA80 av real-time PCR og tilsvarende proteinnivå ved western blotting. C, Øvre panel: representative rettene fra kolonidannende analysen på dag 7, 10 og 14. Nedre panel: antall koloni dannet i HeLa og HeLa /TSA på dag 7, 10 og 14. Søylene representerer gjennomsnittet av tre separate forsøk ; feilfelt, SD; *,
p
0,05. D, HeLa /TSA-celler ble behandlet med TSA (1 uM), DDP (30 uM), og PTX (75 nM) i 48 timer eller UV, ble apoptose celler kvantifiseres ved Annexin V /PI farging og flowcytometri analyse. De representative eksempler på flowcytometri Resultatene er vist. E, Cellene ble behandlet som beskrevet i D, ble den gjennomsnittlige prosentandeler av apoptose celler rapportert i grafene. Verdier, mener prosenter; feilfelt, SD; *,
p
0,05 (n = 3 gjennomkjøringer).
Inntil de fleste av HeLa-celler gikk apoptose etter behandling med TSA (1 um i 24 timer og vedlikeholdes med 200 nM i 7 til 10 dager), de overlevende celler (HeLa /TSA) ble sådd ut for å danne kloner. Etter ytterligere 10 til 14 dager med vekst, krystallfiolett farging viste at HeLa /TSA-celler hadde en betydelig proliferativ evne sammenlignet med de tilsvarende kontrollcellene. Antallet HeLa /TSA-kolonier var omtrent 16 ganger mer enn den til kontrollgruppen på den 14. dag (
p
0,01) (figur 1C).
For ytterligere å undersøke følsomheten for HeLa /TSA celler til TSA, vi behandlet HeLa /TSA celler med andre vanlige kjemoterapi TSA og. Som vist i FACS resultater, HeLa /TSA-celler viste en bemerkelsesverdig motstand mot ikke bare TSA (gjennomsnittlig 9,48% mot 25,53%,
p
= 0,014), men også cisplatin (DDP) (gjennomsnittlig 13,25% vs. 53.76%,
p
0,01), Paclitaxol (PTX) (gjennomsnittlig 8,69% vs 35,36%,
p
0,01), og selv ultrafiolett lys (UV) (gjennomsnittlig 15,38 % vs. 44,8%,
p
0,01) (figur 1D, E). Disse resultatene tyder på at HeLa /TSA-celler kan inneholde en anriket undergruppe av celler som er resistente mot vanlige kjemoterapeutiske midler, og med UV.
HeLa /TSA-celler oppviste en oppregulering av ekspresjonen Ubb og økt mammosphere formasjon
for ytterligere å undersøke holdbarheten av HeLa /TSA celler til kjemoterapi og UV-lys var relatert til uttrykk av UBB, mRNA uttrykk i HeLa /TSA celler ble evaluert. Vi har observert en betydelig økning av Ubb i HeLa /TSA-celler, mens ingen tilsynelatende forandring av de tre andre ubiquitin gener (figur 2A). Likeledes fant vi også en signifikant økning i proteinnivå Ubb, ikke de andre tre ubiquitin-kodende gener. Videre har vi også funnet oppregulering av pSTAT3, vimentin og MDR-1 sammen med nedregulering av pakt i HeLa /TSA-celler sammenlignet med foreldre HeLa-celler (figur 2B). Disse data indikerte at HeLa /TSA-celler ble chemo-resistente, og det kan være relatert til høy ekspresjon av Ubb. Videre er de fleste av HeLa /TSA-celler ble i en udifferensiert tilstand og gjennomgår epitelial-mesenkymale overgang (EMT). Funnene som presenteres her er i tråd med våre tidligere resultater, som indikerte at UBB er en viktig formidler av TSA-indusert tumor selektiv drapet [6].
A, HeLa /TSA celler ble analysert for UBB, UBC, UbA52 og UbA80 mRNA nivåer. Kolonnene representerer gjennomsnittet av tre separate forsøk; feilfelt, SD; *,
p
0,05. B, HeLa /TSA-celler ble analysert for proteinnivåer UB proteiner, pSTAT3, vimentin, pakt og MDR-1, ble β-actin anvendt som en lasting kontroll. C, Kvantitativ analyse av proliferasjon indeksen bestemmes av CCK-8-analyse i de angitte tidsrom. De som vises er gjennomsnitt gjennom tre separate forsøk resultater; feilfelt, SD. D, Representative eksempler på tranwell analysen ble fotografert på 200 × forstørrelser. E, Themorphologic inntrykk av en representant mammosphere i de angitte tidsrom ble photograghed på 200 × forstørrelser. F, sfæroid formasjons analyser ble utført ved begrensende fortynning med 256 celler til en celle pr brønn av en 96-brønns Ultra-Low Heft plate. Dette eksperimentet ble utført for trippel ganger med seks brønner per brønn fortynning. Antallet kolonier ble tellet på dag 14. G, Mammosphere celler av HeLa HeLa og /TSA ble gjen dyrket i et vanlig fastsittende plate i 24 timer, og deretter behandlet med TSA, DDP, og PTX i 48 timer eller UV for 5 min. Apoptose celler ble kvantifisert ved anvendelse av Annexin V /PI farging og flowcytometri analyse. Verdiene er gjennomsnitt og SD (feilfelt) av 3 separate eksperimenter, *,
p
0,05. H, HeLa /TSA mammosphere celler ble analysert for UBB, UBC, UbA52 og UbA80 mRNA nivåer. GAPDH ble anvendt som en referansekontroll.
ytterligere undersøkt de biologiske egenskapene til HeLa /TSA-celler og observert at spredning av HeLa /TSA-celler var signifikant høyere enn i HeLa-kontrollcellene, spesielt på lange -term kultur (figur 2C). I tillegg ble graden av migrasjon i HeLa /TSA-celler signifikant økning i transwell Migration-analysen (figur 2D). Disse resultatene antydet at HeLa /TSA celler viste en høy ondartet potensiale.
Tidligere rapporterte studier har indikert at en langvarig kontinuerlig utvalg av celler for legemiddelresistens beriker celle populasjoner med kreft stilk lignende cellekarakteristikker [8]. Dataene som er rapportert ovenfor viser at HeLa /TSA-celler viste en høy malignitetspotensiale, som kan ha oppstått under seleksjonstrykk av kjemoterapi. Vi utførte eksperimenter for å teste om HeLa /TSA celler ble beriket med kreft stamceller-lignende celler. HeLa /TSA-celler ble dyrket i et ikke-klebende tilstand for å danne mammospheres. Vi fant at HeLa /TSA-celler hadde en signifikant høyere mammosphere formasjon potensial. De HeLa /TSA mammospheres var større og vokste raskere enn HeLa mammospheres, som var små cellegrupper som følges til parabolen og var vanskelige å score i den begrensende fortynning analysen (figur 2E). Selv om HeLa-celler som hadde en tendens til å danne mammospheres, var de ikke i stand til å bli scoret etter utsåing færre enn åtte celler, mens bare en HeLa /TSA celle hadde en sannsynlighet på 66,7% for å danne en mammosphere (figur 2F). For å fastslå om kulene var identisk med adherently dyrkede celler, trypsinert vi kuler og recultured dem i en tilhenger tilstand; disse re-tilhenger HeLa /TSA celler fortsatt var resistente mot TSA, DDP, PTX og UV, i motsetning til resultatene for re-tilhenger HeLa-celler, som ikke var resistente (figur 2G). Videre Ubb genekspresjon i HeLa /TSA mammospheres var fremdeles signifikant høyere enn i kontrollgruppen HeLa mammosphere celler (figur 2H).
De ovenfor angitte data antyder at det HeLa /TSA-celler oppviste en oppregulering av Ubb, pSTAT3 , vimentin, mens Pakt ble nedregulert. Dessuten, disse cellene ble udifferensierte og i en tilstand av quiescence og oppviste en høyere mammosphere-dannende egenskaper i et ikke-heftende situasjon. Disse egenskapene fremhevet at HeLa /TSA celler kan inneholde kreft stilk-lignende celler, og dette fenomenet kan være relatert til oppregulering av UBB.
HeLa /TSA cellene har kreft stamceller-lignende egenskaper
for ytterligere å undersøke om HeLa /TSA celler ble beriket med kreft stamceller lignende celler, utførte vi real-time PCR for å påvise genuttrykk av stamcelle biomarkører. Vi fant ut at Sox2, Oct4, og Nanog var signifikant oppregulert i HeLa /TSA celler sammenlignet med HeLa mammospheres (figur 3A). Western blotting bekreftet at HeLa /TSA mammospheres sterkt uttrykt stamcelle biomarkører. I tillegg fant vi også MDR-1 og UBB ble høyt uttrykt i HeLa /TSA celler (figur 3B). Tilsvarende immunfluorescens analyseresultatene viste at nesten alle HeLa /TSA celler besatt de viktigste funksjonene i stilk-lignende celler, nemlig uttrykk for disse stamcelle biomarkører (Figur 3C).
A, HeLa /TSA mammosphere cellene ble analysert for Sox2, OCT4 og Nanog mRNA-nivåer. Kolonnene representerer gjennomsnittet av tre separate forsøk; feilfelt, SD. B, kvantitativ analyse av Sox2, Oct4, Nanog, MDR-1 og UBB proteinnivåer av western blotting. C, HeLa /TSA mammosphere celler ble analysert ved immunfluorescens for Sox2, Oct4 og Nanog. De representative bildene ble tatt ved hjelp av et fluorescens mikroskop (opprinnelig forstørrelse x 200). Kjernene ble presentert som oppdages ved hjelp av
DAPI plakater (4 «, 6-diamidino-to-phenylindole) farging. D, Analyse av side-populasjonen cellefraksjon i HeLa HeLa og /TSA-cellekulturer. Venstre panel: HeLa; panel til høyre: HeLa /TSA. E, Analyse av CD44 og CD24 ekspresjon i HeLa HeLa og /TSA-celler. Venstre panel: HeLa; høyre panel. HeLa /TSA
Det har blitt rapportert at ABC transporter-mediert utstrømming ansatt ved Hoechst 33342 fargestoff for å isolere fargestoff unntatt side populasjoner (SPS) er beriket i celler med kreft stilk -lignende egenskaper i en rekke svulster [10]. Ved hjelp av differensial Hoechst 33342 flekker å identifisere SPs i heftende celler, observerte vi en betydelig økning av SP-positive celler i HeLa /TSA celler sammenlignet med foreldre HeLa-celler (gjennomsnittlig 8,3% vs. 0,8%,
p
0.01, sammen student t-test) (Figur 3D). Tidligere studier har vist at bryst cscs fra mammosphere celler utstilt overflatemarkører CD44
+ CD24
– [9,11]. Som HeLa /TSA viste en høy dannelseshastigheten av kuler, undersøkte vi CD44 og CD24 uttrykk i HeLa /TSA celler. Resultatene viste at 52,4% av HeLa /TSA var CD44
+ CD24
-., Som var lik den forrige rapportert i bryst cscs (Figur 3E)
Disse dataene viste at langvarig medikamentvalg av HeLa /TSA celler indusert en høy uttrykk for stamcelle biomarkører og en berikelse av CD44
+ CD24
– celler. Derfor kan HeLa /TSA-celler bli beriket av cellene som har kreft stilk-lignende egenskaper.
UBB siRNA kan nedregulerer SP og spheroid formasjon
Resistance av kreft stamceller til cellegifter har tidligere blitt beskrevet i en rekke krefttyper, inkludert kreft i eggstokkene [10]. For å bekrefte at den ondartede fenotype og høy SP celleandel på HeLa /TSA celler ble knyttet til den høye uttrykk for UBB genet, benyttet vi siRNA til knockdown UBB i cellene. Etter transfeksjon av HeLa celler med 3 forskjellige sirnas som er rettet mot CDS av UBB genet, har vi valgt å bruke UbBsi2 fordi det viste en 77% knockdown av UBB genet i henhold til real-time PCR og Western blotting resultater (figur 4A, B) . Å effektivt transfektere sirnas inn kuler, introduserte vi UbBsi2 inn et lentivirus vektor (LV-UbBsi). Etter knockdown av Ubb genet i både HeLa og HeLa /TSA sfæroider ved hjelp av LV-UbBsi (figur 4C), real-time PCR Resultatene viste at selv om Ubb genekspresjon av HeLa /TSA-LV-UbBsi kuler var fremdeles signifikant høyere enn den til HeLa-LV-UbBsi kuler (
p
0,01) (figur 4D), forskjellen mellom gruppene var bare 1,74-fold, som var mye lavere enn 9,25 ganger differansen mellom den ikke-dempet HeLa /TSA og kontroll HeLa-kuler (figur 2 H). Samtidig ekspresjon av Sox2, Oct4 og Nanog i HeLa /TSA-celler ble redusert betydelig etter LV-UbBsi infeksjon (figur 4E, F), og SP
+ forhold på HeLa /TSA-LV-UbBsi-celler ble signifikant redusert fra 2,58% til 1,25% (
p
0,01) (figur 4G). Etter re-dyrking av Ubb-tause klumper i suspensjonen, observerte vi at antall sfæroider som dannes i HeLa /TSA-LV-UbBsi-celler ble redusert fra et gjennomsnitt på 49-32 (
p
= 0,04) ( Figur 4H). Disse data viste at stanse Ubb synlig redusert tumor stammen lignende egenskaper av HeLa /TSA-celler tyder på at kreft stammelignende egenskaper av HeLa /TSA-celler kan være relatert til høy ekspresjon av Ubb.
A, HeLa celler ble transfektert med 10 nM UBB-targeting siRNA, eller stealth RNAi kontroll i 72 timer. Real-time PCR-analyse av forhold UBB mRNA uttrykk ble satte. GAPDH ble anvendt som en referansekontroll. B, Den kvantitative analysen av Ubb proteinnivået ved western blotting. Celler ble behandlet som beskrevet i A. Beta-aktin ble benyttet som en referanse kontroll. C, HeLa HeLa og /TSA mammosphere-celler ble infisert med LV-UbBsi, som ble klonet med UbBsi2, i 72 timer og underkastet analyse ved hjelp av Western-blotting for Ubb proteinnivå. D, LV-UbBsi-infiserte mammosphere celler ble analysert for UBB, UBC, UbA52 og UbA80 mRNA nivåer. GAPDH ble anvendt som en referansekontroll. Kolonnene representerer gjennomsnittet av tre separate forsøk; feilfelt, SD. E, LV-UbBsi-infiserte HeLa /TSA mammosphere celler ble analysert for Sox2, OCT4 og Nanog mRNA nivåer. GAPDH ble anvendt som en referansekontroll. Kolonnene representerer gjennomsnittet av tre separate forsøk; feilfelt, SD. F. LV-UbBsi-infiserte HeLa /TSA mammosphere celler ble analysert for Sox2, OCT4 og Nanog proteinnivåer. Beta-aktin ble benyttet som en referanse kontroll. G, Analyse av side-populasjonen cellefraksjon i LV-UbBsi-infisert HeLa HeLa og /TSA-cellekulturer. H, De sfæroide formasjons analyser ble utført på LV-UbBsi-infiserte celler.
Færre HeLa /TSA celler kan danne xenografter
in vivo
For ytterligere å validere stammen lignende potensialet i HeLa /TSA celler, utførte vi
in vivo
eksperimenter ved subkutant injeksjon av 100 til 5000 celler i NOD /SCID-mus. Vi kunne ikke påvise noen forskjell i tumorigenicity mellom HeLa /TSA og HeLa celler ved injisering mer enn 1000 celler (figur 5A, B). Imidlertid, når det er mindre enn 500 celler ble implantert, HeLa /TSA-celler utviste en potensielt mer tumorigen tilstand (figur 5C, D). I tillegg til de forskjeller i gjennomsnittlig tumorvekst, HeLa /TSA-celler initieres tumorer oftere (6/6 injeksjoner) enn moder HeLa (3/6 injeksjoner) celler (
p
= 0,04) i respons på et injeksjons av 500-celler (tabell 1). Videre HeLa /TSA celler initiert svulster i 6/6 injeksjoner, mens HeLa-celler ikke igang tumorer (0/6 injeksjoner) når 100 celler ble implantert. Jo større evne til tumorvekst
in vivo
var i overensstemmelse med ondartet vekst i vedheftende cellekultur. Etter knockdown av UBB av LV-UbBsi, selv om HeLa /TSA-LV-UbBsi kunne danne xenografter på samme frekvens i forhold til HeLa /TSA-LV-con når injisert med 500 infiserte celler (figur 5E), størrelsen og vekten av xenotransplantater ble betydelig redusert (figur 5F, G, H). Disse resultatene bekrefter at HeLa /TSA celler viste en høy tumorigent potensiale som kan bli redusert med lyddemping UBB.
HeLa og HeLa /TSA celler ble injisert subkutant i NOD /SCID-mus med fire forskjellige celletettheter. A-E, er tumorvolumet plottet som en funksjon av tid. A, 5000-celler; B, 1000 celler; C, 500 celler; D, 100 celler; E, 500 LV-con eller LV-UbBsi-infiserte HeLa /TSA celler. F, Fotografier av subkutant dannet LV-con eller LV-UbBsi-infiserte HeLa /TSA svulster vises. G, redusert tumorstørrelsen med hensyn til inhibering Ubb følgende LV-UbBsi infeksjon i HeLa /TSA-xenografter. De horisontale linjene representerer den gjennomsnittlige størrelse; error bar, SD;
p
= 0,001, to-veis ANOVA test; 6 mus /gruppe. H, Tumorvekter av xenografter som er beskrevet i G. De horisontale linjene representerer den gjennomsnittlige vekt; error bar, SD;
p
0,001, to-veis ANOVA test; 6 mus /gruppe.
Cell linje
No. celler injisert
No. av svulster /Nei. av mus
Maksimal tumor volum (mm
3)
Maksimal tumorvekt (g)
dag svulst harvest
HeLa50006/66750.485110005/66280.41545004/66680.46571000/6☆0☆HeLa/TSA50006/68520.595110006/65730.39545006/68100.53571006/65700.3960Table
