Abstract
Bakgrunn
Tidligere studier har vist at microRNAs er dysregulerte i skjoldbruskkjertelen og spiller viktige roller i den post-transcriptional regulering av målet onkogener og /eller tumorsuppressorgener.
metodikk /hovedfunnene
Vi studerte funksjonen av MIR-126-3p i skjoldbruskkjertelen kreftceller, og som en markør av sykdom aggressivitet. Vi fant ut at Mir-126-3p uttrykk var betydelig lavere i større svulster, i tumorprøver med extrathyroidal invasjon, og i høyere risikogruppe skjoldbruskkjertelkreft i 496 papillær skjoldbruskkreftprøver fra Kreft Genome Atlas studiekohorten. I en uavhengig prøvesett, senke MIR-126-3p uttrykk ble observert i follikulær skjoldbrusk kreft (som har kapsel og angioinvasion) sammenlignet med follicular adenomer. Mekanistisk, ektopisk overekspresjon av MIR-126-3p betydelig hemmet tyreoideakreft celleproliferasjon,
in vitro product: (p 0,01) og
in vivo product: (p 0,01), kolonidannelse (p 0,01), tumor spheroid dannelse (p 0,05), cellemigrasjon (p 0,05), VEGF-sekresjon og endotelial tube formasjon, og lungemetastaser
in vivo
. Vi fant 14 spådd målgener, som ble vesentlig endret på MIR-126-3p transfeksjon i skjoldbruskkjertelen kreftceller, og som er involvert i kreft biologi. Av disse 14 genene,
SLC7A5 Hotell og
ADAM9
ble bekreftet å være hemmet av MIR-126-3p overekspresjon og å være direkte mål av MIR-136-3p.
konklusjoner /Betydning
Så vidt vi vet, er dette den første studien som viser at MIR-126-3p har en svulst-undertrykkende funksjon i skjoldbruskkjertelen kreftceller, og er assosiert med aggressiv sykdom fenotype.
Citation: Xiong Y, Kotian S, Zeiger MA, Zhang L, Kebebew E (2015) MIR-126-3p Hemmer Thyroid kreft celle vekst og metastasering, og er assosiert med aggressiv skjoldbruskkjertelen. PLoS ONE 10 (8): e0130496. doi: 10,1371 /journal.pone.0130496
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, KINA
mottatt: 20 mars 2015; Godkjent: 19 mai 2015; Publisert: 05.08.2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Denne forskningen ble støttet av egenutført forskningsprogram for Senter for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Thyroid kreft er den vanligste endokrine kreft. og en av de raskest voksende kreftdiagnoser i USA [1,2]. Skjoldkjertelkreft kommer fra parafollicular celler (medullær) og follikulære celler (ikke-medullær), som står for over 95% av alle skjoldbrusk kreft tilfeller og er klassifisert i fire hoved histologiske grupper: follikulær skjoldbrusk kreft (FTC), papillær skjoldbruskkreft (PTC ), anaplastisk skjoldbruskkjertelkreft (ATC), og Hürthle karsinom (HCC).
microRNAs (mirnas) er små, ikke-kodende RNA som er omtrent 21 nukleotider lang og regulerer genuttrykk [3,4]. mirnas spille en betydelig rolle i tumordannelse og viser bemerkelsesverdig vev spesifisitet, og mirnas har også vist seg å være gode kreft biomarkører [5]. Tidligere studier har vist at flere mirnas er dysregulerte i skjoldbrusk kreft stammer fra follikulære celler [6-8]. I vår forrige undersøkelse fant vi at uttrykket av MIR-126-3p ble nedregulert i maligne skjoldbrusktumorprøver i forhold til godartet skjoldbrusktumorprøver [9,10]. Downregulated MIR-126-3p uttrykk ble observert i FTC og HCC, som er bare histologisk skilles fra follikulær eller Hürthle celleadenomer når kapsulært invasjon og /eller angioinvasion er til stede. Rollen MIR-126-3p i skjoldbruskkjertelkreft er ikke undersøkt tidligere, men vår uttrykk analyse i skjoldbruskkjertelen kreftprøver tyder på at tapet av MIR-126-3p kan være forbundet med skjoldbrusk kreft progresjon, og at det kan fungere som en tumor suppressor.
i denne studien har vi testet hypotesen om at MIR-126-3p er en tumor suppressor og er assosiert med sykdom fenotype. Vi bestemte funksjonen av MIR-126-3p i skjoldbruskkjertelen kreftceller, bruker både
in vitro Hotell og
in vivo
modeller. Vi fant at overekspresjon av MIR-126-3p betydelig hemmet tyreoideakreft celleproliferasjon, kolonidannelse, tumor spheroid dannelse, migrasjon, VEGF-sekresjon og HUVEC tube formasjon, og lungemetastaser
in vivo
. Videre fant vi at Mir-126-3p regulerer uttrykket av mange kreftrelaterte gener, inkludert de koding oppløst stoff bære familie syv medlem 5 (
SLC7A5
) og en disintegrinproteinet og metalloproteinase domene som inneholder protein 9 (
ADAM9
), og at det direkte rettet mot disse genene. Til slutt ble MIR-126-3p uttrykk funnet å være assosiert med sykdom aggressivitet.
Metoder
The Animal Care og bruk komité i National Cancer Institute, National Institutes of Health godkjent dyrestudie protokoll. Når musene nådde humane eutanasi kriterier, ble musene avbildes, og avlives ved CO2 innånding. Studien ble godkjent av Office for menneske Forskning Gjerder og pasientinformasjon ble samlet prospektivt under en Institutional Review Board godkjent protokollen ved National Institutes of Health klinisk senter (Bethesda, Maryland) etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke.
human thyroid tumorprøver, cellelinjer og dyrkningsbetingelser
human thyroid vev ble oppnådd ved fjerning av svulster, straks hurtigfrosset og lagret ved -80 ° C. Serial vevssnitt ble anvendt for RNA-ekstraksjon og farvet med hematoxylin og eosin for å bekrefte diagnosen, og at tumorcelle-innholdet var 80% eller høyere. Studien ble godkjent av Office for menneske Forskning Gjerder og pasientinformasjon ble samlet prospektivt under en Institutional Review Board godkjent protokollen ved National Institutes of Health etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke.
Menneskelig skjoldbrusk kreft cellelinjer XTC- 1 (HCC), FTC-133 (FTC), og TPC-1 (PTC) ble opprettholdt i DMEM med 4500 mg /l D-glukose og L-glutamin, og 110 mg /l natrium-pyruvat, supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), thyroid-stimulerende hormon (10 mU /ml), penicillin (10.000 U /ml), streptomycin (10 000 U /ml), Fungizone (250 mg /ml), og insulin (10 ug /ml) i en standard fuktet inkubator ved 37 ° C i en 5% CO
2 og 95% O
2 atmosfære. FTC-133-Luc2-celler ble samlet ved transfeksjon FTC-133-celler med en luciferase-uttrykkende vektor, og cellene ble dyrket i det samme medium med G418 i en konsentrasjon på 200 pg /mL [11]. Cellelinjene ble autentisert ved hjelp av korte tandem repeat profilering
miRNA transfeksjon
En miRNA etterligne for HSA-MIR-126-3p (miRNA etterligne, Analyse ID:. MC12841, Applied Biosystems, Foster City , CA) ble transfektert inn i cellene i en konsentrasjon på 25 nM bruker Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, California), etter produsentens protokoll. Et oligonukleotid som ikke representerer noen kjente miRNA (miRNA etterligner negativ kontroll # 1; Applied Biosystems). Ble anvendt som en negativ kontroll
RNA isolering og kvantitativ sanntids RT-PCR
Total RNA ble isolert fra cellelinjene og vevsprøver ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA). Den TaqMan mikroRNA-analysen (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ble anvendt for å måle MIR-126-3p ekspresjonsnivået (HSA-MIR-126-3p, Assay-ID: 002228). Totalt RNA ble reverstranskribert med et miRNA-spesifikk primer, etterfulgt av sanntids-PCR ved anvendelse av TaqMan prober. U6 ble anvendt som en endogen kontroll. De relative mengder av
ADAM9 Hotell og
SLC7A5
mRNA ble bestemt ved bruk av TaqMan analysen (Applied Biosystems) på en ABI 7900 HT system; human
GAPDH
ble anvendt som en endogen kontroll. Den ΔΔ Ct metoden ble brukt til å beregne uttrykket nivåer.
Western blot
Hel-cellelysat ble utarbeidet med RIPA buffer (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) og ble brukt til ADAM9 protein deteksjon ved Western blot hjelp av en kanin polyklonale anti-ADAM9 antistoff (1: 1000 fortynning, Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA) og for SLC7A5 protein deteksjon av Western blot hjelp av en kanin polyklonale anti-SLC7A5 antistoff (1: 500 fortynning; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). GAPDH protein, en kontroll, ble oppdaget ved hjelp av en mus monoklonalt anti-GAPDH (# 0411) antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California).
spredningsanalyse
Celleproliferering ble bestemt ved hjelp av CyQUANT celleproliferasjonsanalyse (Invitrogen) i følge produsentens protokoll. Fluorescensintensiteten ble målt ved anvendelse av en fluorescens mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), med eksitasjon ved 485 nm deteksjon og emisjon ved 538 nm.
Migration assay
Cellular migrering ble målt under anvendelse av en BD Chamber (Catalog # 354578, BD Biosciences, Bedford, MA), i henhold til produsentens instruksjoner. Cellekulturmedium med 10% FBS ble anvendt som en kjemoattraktant i det nedre brønn i Boyden kammer. Tyroid kreft celler ble sådd ut i det øvre rom av kammeret i serumfritt medium (4 x 10
4 celler per brønn). Etter inkubering ved 37 ° C i 5% CO
2 i 22 timer, ble de ikke-migrerende celler fjernes fra den øvre overflaten, og cellene som hadde migrert gjennom membranen til den nedre overflate var farget med Diff-Quik Flekk Set (Siemens Healthcare Diagnostics, Inc., Newark, DE). Bilder ble tatt fra membranen av hver innsats under et mikroskop (50 × forstørrelse) ved hjelp av et digitalt kamera. Bildene ble vist på dataskjermen og cellene i fem felt i hver innsats ble talt opp.
spheroid kultur
To dager etter miRNA transfeksjon ble cellene trypsinert, telte, resuspendert i dyrkningsmedier , og belagt i en Ultra Low Cluster plate (Costar, Corning, New York) på 3,5 × 10
4 celler per brønn. Platene ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2, og mediet ble skiftet hver 2 til 3 dager. Etter 2 uker med kultur, ble cellene farget med krystallfiolett og fotografert under et mikroskop. Det totale arealet som opptas av kuler i et bilde ble målt ved å omgi omkretsen av hver spheroid, merking hele området, og beregne piksel tall ved hjelp ImageJ programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
myk-agar assay for kolonidannelse
Tre dager etter miRNA transfeksjon ble FTC-133-celler trypsinert, tellet og resuspendert i kulturmedium. To-lags mykagar ble utført i seks-brønns plater. Det nederste lag av agar (2 ml /brønn) inneholdt 0,6% agar (Difco agar edel; BD Diagnostics, Sparks, MD) i Hams F-12 medium, supplert med 10% FBS, penicillin (100 U /ml), streptomycin ( 10 000 U /ml), og Fungizone (250 ng /ml). Tretti tusen celler ble blandet med 1 ml av øvre agar-oppløsning (0,35% agar i kulturmedium). Etter 30 minutter ble 1 ml av kulturmedium tilsatt til hver brønn. Platene ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2, og mediet ble skiftet to ganger i uken. Etter to uker med kultur, ble cellekolonier farget med krystallfiolett og undersøkt under et mikroskop. Kolonitelling ble utført i tre ulike felt.
Tumor xenograft studier
FTC-133 celler som inneholder luciferasereportergenet
luc2
ble transfektert med MIR-126-3p eller speil NC og inokulert subkutant (10
6 levedyktige celler) til de venstre og høyre flankene av atymiske nakne mus. Svulster ble målt med calipers på ulike tidspunkter, og volumene ble beregnet som lengde × bredde × høyde. Obduksjonstumorprøver ble fotografert å dokumentere grov morfologi, og deretter prøver ble veid. FTC-133
luc2
celler (7,5 × 10
5) transfektert med MIR-126-3p og MIR-NC ble injisert i atymiske hårløse mus via halevenen, og musene ble fotografert ukentlig bruker en Xenogen IVIS 100-systemet.
sårtilheling analysen
Thyroid kreft celle migrasjon ble vurdert ved hjelp av en ripe sårtilheling analyse [12] der 150.000 celler ble transfektert med mirnas, belagt i seks-brønns plater, og lov til å feste seg og vokse i 44 timer (miRNAs). Deretter ble tre vertikale sår laget med en steril 10-mL pipettespissen, og deretter en horisontal linje ble laget på tvers av de tre linjene, slik at cellene kan observeres på samme punkt. Cellene ble inspisert hver 12. time og bredde målinger tatt opp til 24 timer.
VEGF ELISA
Kultur media supernatant ble samlet 72 timer etter transfeksjon av skjoldbruskkjertelen kreftceller med MIR-NC eller speil 126-3p. VEGF-nivåer ble målt ved anvendelse av human VEGF Quantikine ELISA-sett (R 0,05. Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) system (Oppfinnsomhet Systems, Redwood City, CA) ble brukt for pathway analyse
miRNA-126-3p mål spådommer
TargetScan 5.1 (http:. //Targetscan .org /) ble brukt for å identifisere potensielle direkte målgener for MIR-126-3p.
Luciferase reporter analysen
1573-basepar 3′-UTR av menneskelig
ADAM9
ble klonet inn i en tom luciferase reporter vektor, pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), genererer en villtype
ADAM9
3′-UTR luciferase reporter konstruksjon (pEZX-ADAM9-3’UTR) . Den 2947-basepar 3′-UTR av menneskelig
SLC7A5
ble også klonet inn pEZX-MT01, genererer en villtype
SLC7A5
3′-UTR luciferase reporter konstruksjon (pEZX-SLC7A5- 3’UTR). For den doble luciferase-analysen, ble FTC-133-celler sådd ut i triplikat i 24-brønners plater og ko-transfektert med 0,25 ug reporter-konstruksjonen og 15 pmol av MIR-126-3p eller MIR-NC ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) . Etter 24 timer ble cellene lysert og analysert for både ildflue og
Renilla
luciferase-aktivitet ved anvendelse av mir Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia) på en SpectraMax M5E mikroplateleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), i henhold til produsentens instruksjoner.
data~~POS=TRUNC analyse~~POS=HEADCOMP
The National Cancer Institute Cancer Genome Atlas (TCGA) datasett for skjoldbruskkjertelkreft ble benyttet for å bestemme en sammenheng mellom MIR-126-3p uttrykk og sykdom aggressivitet (data portal, https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). Normalisert intensitetsverdier (log 10) for Mir-126-3p uttrykk ble innhentet fra 454 papillær skjoldbruskkreftprøver. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet. For å bestemme statistisk signifikans, ble en analyse av varians og t-test brukes etter behov. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
MIR-126-3p uttrykk i skjoldbruskkjertelkreft er assosiert med aggressiv sykdom fenotype og svulster med kapsel og angioinvasion
Vi har tidligere identifisert MIR-126-3p å bli nedregulert i skjoldbrusk kreft follikulær celle opprinnelse og i tumortyper som var vanskelige å diagnostisere ved svulst biopsi undersøkelse som kapsel invasjon og angioinvasion kan ikke fastslå med cytologi. Dermed var vi interessert i å avgjøre om MIR-126-3p uttrykk var assosiert med sykdom aggressivitet og spesielt i svulster med kapsel invasjon og angioinvasion. For å undersøke dette, brukte vi TCGA datasettet for papillær skjoldbruskkjertelkreft. Vi fant ut at Mir-126-3p uttrykk var lavere i større primære tumorer (figur 1A), i tumorprøver med extrathyroidal invasjon (fig 1B), og i høyrisikogruppen skjoldbruskkjertelkreft (fig 1C). Gitt sammenslutning av MIR-126-3p med mer aggressiv papillær skjoldbruskkjertelkreft, ved siden spurte vi om MIR-126-3p uttrykk ble lavere i lokaliserte svulster med kapsel invasjon og angioinvasion bruker follikulær skjoldbrusk kreft og adenomer prøver som malignitet er bare av etablert tilstedeværelsen av disse to kjennetegn for kreft. Vi fant MIR-126-3p var betydelig lavere i lokaliserte follikulær skjoldbruskkjertelkreft sammenlignet med follicular adenomer (fig 1D). Disse funnene er tatt sammen tyder på at Mir-126-3p kan ha en betydelig rolle i skjoldbrusk kreft initiering og eller progresjon.
(A) MIR-126-3p er betydelig lavere i større papillær skjoldbruskkjertelkreft (T3 i forhold til T2 og T1 svulster). Data for TCGA prøver med tilgjengelige tumor størrelse data. T1 svulster mindre enn 2 cm og ikke vokser utenfor skjoldbruskkjertelen, T2 svulster 2cm men lt 4cm og ikke vokser utenfor skjoldbruskkjertelen, T3 svulster måle 4cm eller vokser utenfor skjoldbruskkjertelen. ** Indikerer p 0.01, *** indikerer p 0,001. Y-aksen er log
10 normalisert uttrykk. (B) MIR-126-3p uttrykk er betydelig lavere i papillær skjoldbruskkjertelkreft med minimal og moderat extrathyroidal invasjon. ** Indikerer p 0.01, *** indikerer p 0,001. Y-aksen er log
10 normalisert uttrykk. (C) MIR-126-3p uttrykk er betydelig lavere i høy og middels Macis risiko papillær skjoldbruskkjertelkreft sammenlignet med svulster lave Macis risiko. Macis er et prognostisk scoring system brukes i TCGA database som er basert på tilstedeværelse av metastaser, pasientens alder, fullstendighet av reseksjon, lokal invasjon, og tumor størrelse. ** Indikerer p 0.01, *** indikerer p 0,001. Y-aksen er log
10 normalisert uttrykk. (D) MIR-126-3p uttrykk er betydelig lavere i follikulær skjoldbruskkjertelkreft enn follikulær skjoldbruskkjertelen adenom. All follikulær skjoldbruskkjertelkreft tilfellet hadde histologisk tegn på kapsel og vaskulær invasjon og adenomer ikke har noen bevis for kapsel og vaskulær invasjon. ** Indikerer p 0,01. Y-aksen er 2 ^ -. (ΔΔCt)
MIR-126-3p regulerer skjoldbruskkjertelkreft celleproliferasjon, koloni og spheroid formasjon, og cellemigrasjon
Gitt sammenhengen mellom speil 126-3p uttrykk og aggressiv skjoldbrusk kreft sykdom fenotype, ønsket vi å finne ut om funksjonen av MIR-126-3p i skjoldbruskkjertelen kan mechanistically forklare denne foreningen. Vi har overuttrykt MIR-126-3p i tre godt karakterisert og autentiserte thyroid kreft-cellelinjer (TPC-1, FTC-133 og XTC-1) ved bruk av MIR-NC som en negativ kontroll for å bestemme dens virkning på cellulær proliferasjon. MIR-126-3p overekspresjon hemmet celledeling betydelig i TPC-en og FTC-133 celler i 120 timer, med 52% (p 0,001) og 37% (p 0,001), henholdsvis; men det hemmet spredning bare med 16% i XTC-1 celler på 168 timer (p 0,001) (figur 2A, 2B og 2C). En myk agar-kolonidannelse analyse ble utført for å evaluere forankrings-uavhengig vekst i FTC-133, som er en koloni-dannende thyroid kreft cellelinje. Vi fant en signifikant lavere antall kolonier i FTC-133 cellelinjer overekspresjon MIR-126-3p (Fig 2D). Vi studerte også effekten av MIR-126-3p på skjoldbruskkjertelkreft celletumor spheroid formasjon. FTC-133 og XTC-1 cellelinjer danne kuler når dyrket i ultra-lave tilhenger kulturflasker, og etter transfeksjon med MIR-126-3p, antall og størrelse på kuler ble betydelig redusert (figur 2E).
(A-C) Thyroid kreft cellelinje spredning med MIR-126-3p overekspresjon. Y-aksen representerer celletallet. Feilfelt representerer standardfeil for gjennomsnittet (SEM). (* Indikerer p 0,05; ** indikerer p 0,01; *** indikerer p 0,001). (D) MIR-126-3p overekspresjon hemmer kolonidannelse i skjoldbruskkjertelen kreftceller. Kolonitall i FTC-133 cellelinjer. Y-aksen representerer antall kolonier per felt. Feilfelt representerer SEM (*** indikerer p 0,001). (E) MIR-126-3p overekspresjon reduserer størrelsen og antall sfæroider. Topplate: representant bilde av kuler i kultur med MIR-126-3p overekspresjon (FTC-133 celler). Nedre panel: Kvantifisering av sfæroide forskjeller mellom XTC-en og FTC-133 celler med MIR-126-3p overekspresjon. Det totale arealet som opptas av kulene innenfor et bilde ble målt ved å omgi omkretsen av hver spheroid, merking hele området, og beregne pikseltall med ImageJ programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Y-aksen representerer størrelsen og antallet av sfæroidene. Feilfelt representerer SEM (* indikerer p 0,05).
neste fastsatte effekten av MIR-126-3p på cellemigrasjon ved bruk av scratch sårtilheling analysen. Vi fant at overekspresjon av MIR-126-3p betydelig hemmet lukking av sår i TPC-1 celler (p 0,001), FTC-133 celler (p 0,001), og XTC-1 celler (p 0,01) (figur 3A). For å bekrefte våre funn, vi brukte også en Boyden kammer analyse for å studere effekten av MIR-126-3p på cellemigrasjon. Vi fant at overekspresjon av MIR-126-3p også signifikant inhiberte cellemigrering (figur 3B).
Sårtilheling assay (A) og Boyden kammer assay (B) data. MiR-126-3p overekspresjon betydelig redusert sår bredde stenging på 24 timer i alle skjoldbruskkjertelkreft cellelinjer studert. Y-aksen representerer såret avstand. Feilfelt representerer SEM (** indikerer p 0,01; *** indikerer p 0,001). MiR-126-3p overekspresjon betydelig redusert antall migrerte celler i alle skjoldbruskkreftceller i Boyden kammer analysen. Y-aksen representerer antallet migrerte celler per felt. Feilfelt representerer SEM (* indikerer p 0,05; ** indikerer p 0,01; *** indikerer p 0,001).
MIR-126-3p regulerer skjoldbrusk tumorvekst og metastase
in vivo
Gitt vår
in vitro
data, ønsket vi å evaluere effekten av MIR-126-3p på tumorvekst
in vivo Hotell og avgjøre om midlertidig forhøyede nivåer av MIR-126-3p kunne ha en bærekraftig og langsiktig fenotypiske effekt. Vi fant ut at tumorxenotransplantater stammer fra FTC-133
luc2
celler transfektert med MIR-126-3p var betydelig mindre og veide mindre enn tumorxenotransplantater fra MIR-NC gruppen (p 0,01) (fig 4A) . Fordi en av de mest dramatiske effektene av MIR-126-3p overekspresjon
in vitro
var på cellemigrasjon, vi neste bestemt om MIR-126-3p regulert metastaser
in vivo
. For å avgjøre om overekspresjon av MIR-126-3p kunne hemme tumormetastaser
in vivo
, FTC-133
luc2
celler transfektert med MIR-126-3p og MIR-NC ble injisert i atymiske nakne mus via halevenen, og musene ble fotografert hver uke. Vi fant at overekspresjon av MIR-126-3p dramatisk undertrykt lungemetastaser i denne modellen (fig 4B).
(A) Vekst av tumorxenotransplantater i nakne mus. Venstre panel: representative bilder mus xenograft størrelse på obduksjon. Midtre og høyre panel: svulst luciferase aktivitet og tumor volum måling og vekt. FTC-133-Luc2 celler transfektert med MIR-126-3p og MIR-NC ble inokulert subkutant i flankene av atymiske nakne mus. (B) Tumor metastasering. Venstre panel: Representative bilder av mus med metastaser som viser luminescens signal. Midtre panelet: Kvantifisering av luminescens signalintensitet forskjeller mellom MIR-126-3p og MIR-NC. FTC-133-Luc2 celler transfektert med MIR-126-3p og MIR-NC ble injisert i atymiske hårløse mus via halevenen, og musene ble avbildet med en Xenogen IVIS 100-systemet. Den relative luminescens Signalet fra hver mus blir beregnet som forholdet mellom opprinnelige signalet til signalet tatt 14 dager etter injeksjon. Bildene som vises her ble tatt 7 uker etter vene injeksjon av tumorceller. Feilfelt representerer SEM (* indikerer p 0,05; ** indikerer p 0,01; *** indikerer p 0,001). Alle dyreforsøk ble gjentatt to ganger. Høyre panel: Et representativt mikroskopisk bilde (hematoxylin og eosin [H E] farging) av metastatisk lunge svulst indusert av FTC-133-Luc2 celler transfektert med MIR-NC og en H E-fargede delen av metastatisk lunge svulst indusert av FTC -133-Luc2 celler transfektert med MIR-126-3p.
MIR-126-3p regulerer ADAM9 og SLC7A5 uttrykk i skjoldbruskkjertelen kreftceller
Gitt at Mir-126-3p hadde en effekt på celleproliferasjon, migrasjon og metastaser
in vitro Hotell og
in vivo
, var vi interessert i å bestemme målet pathway (e) og genet (e). Vi brukte to tilnærminger til å bestemme kandidat Mir-126-3p mål. (1) genom-wide uttrykk analyse med overekspresjon av MIR-126-3p og (2) et mål prediksjon database analyse
Integrated analyser av genom-wide genuttrykk data og mål scan prediksjon avslørt 14 gener som mål for Mir-126-3p (S1 tabell). Vi utførte en sti analyse med disse 14 gener. Den øverste sykdommer og biologiske funksjoner identifisert av IPA er oppsummert i S2 tabell. Kreft var toppen sykdomskategori, med fire molekyler som er involvert i denne veien som ble betydelig redusert ved MIR-126-3p overekspresjon. Videre blant de 14 genene, fant vi at
SLC7A5
hadde høyest fold endringer i begge cellelinjene ved MIR-126-3p overekspresjon, og
ADAM9
hadde den nest høyeste ganger endring (2,8 fold) i FTC-133 celler, som ble brukt for både
in vitro Hotell og
in vivo
analyser i denne studien. Begge
ADAM9 Hotell og
SLC7A5
spiller viktige roller i flere kreftformer, og har vist seg å bli målrettet av MIR-126-3p [13-16]. Dermed var vi interessert i å avgjøre om SLC7A5 og ADAM9 proteinnivåer ble endret på MIR-126-3p overekspresjon. Vi fant ut at Mir-126-3p overekspresjon redusert SLC7A5 protein uttrykk i TPC-en og XTC-1 celler (figur 5A) og redusert ADAM9 protein uttrykk i alle tre cellelinjer (TPC-1, FTC-133, og XTC-1) (fig 5B). Vi fant også at Mir-126-3p overekspresjon downregulated ADAM9 protein uttrykk i FTC-133
luc2
tumorxenotransplantater som hadde blitt inokulert subkutant i flankene av atymiske hårløse mus og lov til å utvikle for 10 dager (fig 5C ). Gitt disse resultatene, vi neste avgjort om
ADAM9 Hotell og /eller
SLC7A5
var direkte mål av MIR-126-3p. Vi utførte luciferasepreparater analyser på FTC-133 celler ko-transfektert med pEZX-ADAM9-3’UTR (vektor med 3′-UTR av
ADAM9
) og Mir-126-3p eller MIR-NC. Vi fant ut at Mir-126-3p overekspresjon betydelig redusert luciferase aktivitet i forhold til den negative kontrollen (figur 5D), noe som tyder på at MIR-126-3p direkte rettet mot 3′-UTR regionen
ADAM9 Hotell og
SLC7A5
i skjoldbruskkjertelen kreftceller. Vi neste analysert om det var en sammenheng mellom MIR-126-3p uttrykk og ADAM9 og SLC7A5 mRNA uttrykk i TCGA papillær skjoldbruskkjertelkreft datasett, og fant en signifikant invers assosiasjon med SLC7A5 mRNA uttrykk (r = -0,257, p 0,01), men ikke med ADAM9 mRNA uttrykk (fig 5E).
(A) immunoblotter av SLC7A5 og GAPDH i TPC-en og XTC-1 cellelinjer, som ble transfektert med enten MIR-126-3p eller MIR-NC for 72 timer. FTC-133 cellelinjen hadde ingen påviselig protein uttrykk for SLC7A5. (B) immunoblotter for ADAM9 og GAPDH i TPC-en, FTC-133 og XTC-1 cellelinjer, som ble transfektert med enten MIR-126-3p eller MIR-NC i 72 timer
in vitro
. (C) immunoblot for å detektere ADAM9 og GAPDH i FTC-133-Luc2 tumorxenografter som hadde blitt inokulert subkutant inn i flankene av atymiske nakne mus og lov til å utvikle seg i 10 dager. (D) Luciferase aktivitet pEZX-SLC7A5-3’UTR og pEZX-SLC7A5-3’UTR i FTC-133 celler ved samtidig transfektert med MIR-126-3p eller MIR-NC. Alle luciferase-målinger ble utført i triplikat, og avlesninger ble foretatt 24 timer etter transfeksjon. Feilfelt representerer SEM (*** indikerer p 0,001). (E) Ekspresjonsnivået av MIR-126-3p er betydelig omvendt assosiert med ekspresjonsnivået av
SLC7A5
i 481 papillære thyroid kreft prøver fra TCGA datasett. *** Indikerer p. 0,001
MIR-126-3p reduserer VEGF-sekresjon og endothelial tube dannelse
Gitt at vi fant MIR-126-3p uttrykk er lavere i lokaliserte follikulær skjoldbruskkjertelkreft med kapsel og vaskulær invasjon, og MIR-126-3p har blitt rapportert å regulere angiogenese og målet
VEGF
, neste fastsatte vi om MIR-126-3p regulerer angiogenese i skjoldbruskkjertelen kreftceller [17-20] . Vi fant ut at Mir-126-3p overekspresjon betydelig redusert VEGF-sekresjon i to av tre skjoldbruskkjertelen kreftceller
in vitro plakater (figur 6A). En av de viktigste determinantene for vellykket tumorvekst er evnen til å rekruttere nye blodkar. Dermed har vi analysert VEGF protein uttrykk nivå i lungemetastatiske svulster fra
in vivo
studier og endothelial tube formasjon ved hjelp av HUVEC analysen
in vitro
. 0,5.
