Abstract
Ctf18-replikering faktor C komplekse inkludert Dscc1 (DNA replikasjon og søsterkromatidutveksling samhold 1) er innblandet i søsterkromatidutveksling samhold, DNA replikasjon, og genom stabilitet i
S. cerevisiae Hotell og
C. elegans
. Vi har tidligere utført genuttrykk profilering i grunnskolen kolorektal kreft celler for å identifisere nye molekylære mål for behandling av tykktarmskreft. En funksjon av kreft-assosiert transkripsjonen signatur åpenbart fra dette arbeidet er det opphøyde uttrykk for proto-onkogen
DSCC1
. Her har vi avlest det molekylære grunnlaget for avvikende ekspresjon av human DSCC1 i kolorektal kreft og dens evne til å fremme overlevelsen av kreftceller. Kvantitativ PCR og immunhistokjemi analyser bekreftet at uttrykket nivået av DSCC1 er forhøyet i 60-70% av kolorektal tumorer i forhold til deres matchet noncancerous colonic slimhinnene. En
i silico
evaluering av presumptive
DSCC1
promoter regionen for konsensus DNA transkripsjonen regulatoriske elementer avdekket en mulig rolle for E2F familien av DNA-bindende proteiner i å kontrollere DSCC1 uttrykk. RNAi-mediert reduksjon av E2F1 redusert uttrykk for DSCC1 i kolorektal kreftceller. Gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter demonstrerte at DSCC1 er involvert i levedyktigheten av kreftceller i respons til genotoksiske stimuli. Vi avslører at E2F avhengig uttrykk for DSCC1 ensidige anti-apoptotiske egenskaper i kolorektal kreftceller, og at dens undertrykkelse kan være et nyttig alternativ for behandling av tykktarmskreft
Citation. Yamaguchi K, Yamaguchi R, Takahashi N, Ikenoue T, Fujii T, Shinozaki M, et al. (2014) Overuttrykte Cohesion Etablering Factor DSCC1 gjennom E2F i tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (1): e85750. doi: 10,1371 /journal.pone.0085750
Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA
mottatt: 28 oktober 2013, Godkjent: 30 november 2013; Publisert: 17 januar 2014
Copyright: © 2014 Yamaguchi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grant-i-Aid for Unge Forskere (# 23790126), MEXT /JSP, Japan K. Yamaguchi, og Global COE Program «Center for utdanning og forskning for den avanserte genom-basert medisin for personlig medisin og kontroll over hele verden smittsomme sykdommer «, MEXT /Japan Society for Promotion of Science, Japan til Y. Furukawa. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de hyppigste menneskelige svulster i verden. I CRC celler, forstyrrelse av systemer som regulerer genetisk eller epigenetisk integritet gjør forskjellige funksjoner som kromosom ustabilitet (CIN), mikro ustabilitet (MSI), og CpG island methylator fenotype (CIMP). Et stort flertall av kolorektal tumorer vise CIN som inkluderer brutto genetiske endringer som slettinger, presiseringer, inversjoner, rearrangements, gevinst eller tap av hele eller store deler av kromosomer, og trans [1]. En tidligere studie identifisert somatiske mutasjoner i fem genene inkludert
MRE11
,
ZW10
,
ZWILCH
,
ROD
, og
DING
blant 100 mennesker CIN-kandidat gener som delte likhet med gjær eller flyr «ustabilitet» gener [2]. Deres data antydet at minst en av tre funksjoner inkludert dobbel tråd pause reparasjon, kinetochore funksjon, og kromatid segregering, er svekket i CIN svulster ved somatisk mutasjon. En annen studie søkte etter mutasjoner av 102 mennesker homologer av gjær CIN gener i 132 kolorektal kreft. Derfor har de identifisert totalt 11 mutasjoner i fem gener som inkluderte fire forbundet med søsterkromatidutveksling samhold (
SMC1L1
,
CSPG6
,
NIPBL
, og
STAG3
, de homologer av gjær
SMC1
,
SMC3
,
SCC2
, og
henholdsvis SCC3
,) [3]. Siden søsterkromatidutveksling samhold er uunnværlig for cellulære prosesser som kromosom segregering, homolog recombinational reparasjon og regulering av transkripsjon [4], genetiske endringer i komponentene og regulatorer bør spille en avgjørende rolle i CIN av kolorektal tumorer.
Vi har tidligere utført genuttrykk profilanalyse i CRC [5], og funnet ut at DNA replikasjon og søsterkromatidutveksling samhold 1 (
DSCC1
, også kjent som
DCC1
) ble ofte forhøyet i tykktarmssvulster sammenlignet med ikke-kreft i kolon mukosa. Dcc1p, en homolog av DSCC1, ble først identifisert som medlem av alternative replikering faktor C (RFC) kompleks i gjær, og fysisk forbinder med Ctf8p og Ctf18p [4]. Sletting av komponenten, Ctf18p, Ctf8p, eller Dcc1p, resulterte i alvorlige Søsterkromatidutbytting samhold defekter, og økt følsomhet for mikrotubulidynamikk depolymerisering narkotika, noe som tyder på at disse komponentene er avgjørende for vedlikehold av kromatin integritet [4]. Selv om Dcc1p ikke var avgjørende for levedyktigheten av gjær, sletting av Dcc1p førte til syntetisk dødelighet i kombinasjon med mutasjon av andre søsterkromatidutveksling utjevnings proteiner [6]. I tillegg til innblanding i søsterkromatidutveksling samhold, spiller CTF18-DSCC1-CTF8-RFC kompleks en avgjørende rolle i DNA replikasjon gjennom interaksjon med enkeltrådet og primet DNA som en loader prolifererende cell nuclear antigen [7]. Videre genetiske nettverk analyse av funksjonelt relaterte gener i gjær antydet at komponentene i CTF18-DSCC1-CTF8-RFC kompleks samvirke med MAD /BUB spindel sjekkpunkt svei, den RAD51 DNA-reparasjon vei for dobbelt-trådbrudd, det RAD9 DNA-skade sjekkpunkt, og TOF1 /MRC DNA replikasjon sjekkpunkt pathway [8], [9]. Oppdagelsen av at mutasjon i CTF18-RFC økt lett gjenta ustabilitet bekreftet rolle dette komplekset i DNA-replikasjon sjekkpunkt [10]. Disse data indikerte at DSCC1 spiller en viktig rolle i replikasjon, spindel sjekkpunkt og DNA reparasjon, noe som fikk oss til å undersøke om deregulert uttrykk for DSCC1 er involvert i menneskelig kolorektal tumorigenesis.
Her viser vi for første gang at DSCC1 er ofte oppregulert i CRC i det minste delvis gjennom den forbedrede transkripsjonelle aktivering av E2F. Vi avslører også at forhøyet uttrykk for DSCC1 overfører chemoresistance i CRC celler ved å gi kreftceller med anti-apoptotiske egenskaper. Disse funnene vil bidra til en bedre forståelse av CRC, og fungere som et utgangspunkt for utvikling av nye strategier for diagnostisering og behandling av CRC.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Dette prosjektet ble godkjent av etisk komité av Institute of Medical Science, University of Tokyo (IMSUT-IRB, 21-14-0806). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasientene i denne studien. Alle kolorektal kreft vev og tilsvarende ikke-kreft vev ble oppnådd fra kirurgiske prøver av pasienter som gjennomgikk kirurgi.
Cell kultur
Menneskelig CRC cellelinjer HCT116, HCT-15, SW480, DLD-en , LoVo, Caco-2, LS174T, HT-29, og RKO ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Alle celler ble dyrket i passende media supplert med FBS (Life Technologies, Carlsbad, California) og antibiotika /antimycotic løsning (Sigma, St. Louis, MO).
Utarbeidelse av plasmider uttrykker DSCC1 og E2Fs
hele den kodende regionen til
DSCC1
cDNA (GenBank aksesjonsnr NM_024094) ble amplifisert ved RT-PCR ved anvendelse av et sett av primere; forover primer: 5′-CCGGAATTCATGAAGAGGACCCGCGAC-3 «og revers primer: 5′-CGGCTCGAGAGAAATGGGTCTTCTCGAATTAT-3» (understrekede nukleotider angir gjenkjenningsseter for restriksjonsenzymer). PCR-produktene ble klonet inn i
Eco
RI og
Xho
I områder av pcDNA3.1 /myc-His. Vi i tillegg genererte plasmider uttrykker HA-merket DSCC1 (pCAGGS-DSCC1). Konstruksjonene pcDNA3-HA-E2Fs ble vennlig levert av Dr. JR Nevins (Duke University, Durham, NC).
Kvantitativ PCR og genkopitallet analyse
Real-time PCR ble utført ved hjelp den LightCycler 480 system (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Genomisk DNA ble ekstrahert fra CRC-cellelinjer for kopiantall analyse. Kvantitativ PCR ble utført på ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System, ved hjelp av FAM-merkede prober (5′-TCAGGTTTCCTACCTTCCGGCTGCTT-3 «) og et sett med primere (forward: 5′-GGCGCGCTTTCAAACG-3′, omvendt: 5»-GCGGGCAAGAAAGAAGTTCC-3 «) for
DSCC1
, og TaqMan Kopier Antall Referanse Analyser RNase P som en kvantitativ kontroll (Life Technologies). Kopien antall
DSCC1
i kreftcellene ble beregnet i sammenligning med genomisk DNA fra friske frivillige som bruker CopyCaller Software.
subcellular fraksjonering og immunoblotting
Celler ble lysert i radioimmunpresipitasjonsmålinger forsøks-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoksykolat, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS) supplert med en proteaseinhibitor cocktail sett III (Calbiochem, San Diego, CA). Atom ekstrakter ble utarbeidet etter Nuclear Extract Kit (Active Motif, Carlsbad, California). Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE og immunoblot-analyse ble utført under anvendelse av de angitte antistoffer. Pepperrot peroksidase-konjugert geit anti-mus eller anti-kanin IgG (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) fungerte som det sekundære antistoff for ECL Detection System (GE Healthcare).
farging
Primær antistoffer som brukes for immunhistokjemisk og immunocytokjemisk farging var anti-DSCC1 (B01P, Abnova, Taipei, Taiwan) og anti-Myc (Sigma). Spesifisiteten til DSCC1 antistoff ble bekreftet ved blokkering med DSCC1 rekombinant protein (data ikke vist). Disse eksperimentene ble utført som beskrevet tidligere [11].
Induksjon av apoptose og flowcytometri
For å studere induksjonen av apoptose ble cellene behandlet med camptothecin (Wako, Osaka, Japan), doksorubicin (LC Laboratories, Woburn, MA), MG132 (Merck Millipore, Darmstadt, Tyskland), eller utsatt for y-bestråling (Gammacell 40, Atomic Energy of Canada, Ontario, Canada). Expression of spaltet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og kløyvde caspase-3 ble oppdaget av western blot analyse ved hjelp av anti-spaltet PARP (9541) og anti-caspase-3 antistoffer (9662), henholdsvis (Cell Signaling Technology, Danvers , MA). Vurdering av apoptose ble også utført av annexin V og PI dobbeltfarging bruker Alexa Fluor 488 Annexin V /død celle apoptose Kit (Life Technologies). I korthet, dyrkede celler ble behandlet med bærer eller camptothecin i 24 timer. Cellene ble farget med Annexin V og PI, og senere analysert på en FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ved hjelp FlowJo programvare (Tre Star, Ashland, Oregon).
Celleviabilitet analysen
Plasmidene som uttrykker kort hårnål RNA (shRNA) ved hjelp av U6 promoter (psiU6BX3.0) ble fremstilt som tidligere beskrevet [12]. Plasmider uttrykker DSCC1 shRNA (psiU6-shDSCC1) ble konstruert ved å klone dobbel-strandet oligonukleotider inn i
Bbs
I områder av psiU6BX3.0 vektor. To målsekvenser, 5′-GUGGACAGAAGAAGAUAUU-3 «(shDSCC1 # 1) og 5′-GCAAACCAUAGGUGCAUUA-3′ (shDSCC1 # 2), ble anvendt for DSCC1 shRNAs. Som negative kontroller, utarbeidet vi et plasmid rettet mot forbedrede grønt fluorescerende protein (psiU6-shEGFP) og disse er målrettet mot kodede sekvenser av shDSCC1 # 1 (5»-AAAUUGCGAAGGUGAUGAA-3 «, psiU6-shDSCC1 1scr #) eller shDSCC1 # 2 (5»- AACACGUUAAUAACCGGUG-3 «, psiU6-shDSCC1 # 2scr). Celleviabilitet analysene ble utført som beskrevet tidligere bruker HCT116, SW480, og RKO celler transfektert med plasmider som uttrykker shEGFP, shDSCC1, eller rykke shDSCC1 [11]. For å undersøke effekten av DSCC1 overekspresjon på celleproliferasjon, transfektert vi SW480 og HCT116-celler med pCAGGS-DSCC1 og etablert to eller tre kloner stabilt uttrykker eksogent DSCC1. Kontroll SW480 og HCT116-celler transfektert med tom vektor ble også etablert som mock celler.
Arrangøren reporter analyser og seterettet mutagenese
luciferaserapportørplasmid plasmider som inneholder
DSCC1
arrangøren var utarbeidet av kloning av 5′-flankerende område av
DSCC1
inn i
Mlu
jeg og
Bgl
II restriksjonsenzym områder av pGL3-Basic vektor (Promega, Madison, WI ). Et DNA-fragment på ca. 1,0-kb i det 5′-flankerende region av
DSCC1
ble amplifisert ved PCR ved anvendelse av genomisk DNA fra friske frivillige og et sett med primere (forward: 5′-CGACGCGTATGTCTGCTCAGATCCTTTGAAT-3 «, revers : 5»-GAAGATCTCGCCGGGTCTAGGAGTCC-3 «). Mutant plasmider inneholder erstatninger i antatte E2F bindingssteder i
DSCC1
promoter ble generert ved seterettet mutagenese bruke QuikChange II XL seterettet mutagenese Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Celler podet i 6-brønns plater ble transfektert med rapportør plasmidene sammen med PRL-TK (Promega) ved hjelp av Fugene 6 reagens. Cellene ble høstet 24 timer etter transfeksjon, og reporter aktiviteter ble målt ved dobbel luciferase-systemet (TOYO B-Net, Tokyo, Japan). For knockdown av E2F1 uttrykk, ble syntetisk E2F1 siRNA kjøpt fra Sigma (følelse: 5′-GGGAGAAGUCACGCUAUGA-3 «, anti: 5′-AUAGCGUGACUUCUCCCCC-3»).
Chromatin immunoprecipitation analysen
for å undersøke samspillet mellom E2F1 med
DSCC1
promoter-regionen, en kromatin immunpresipitering (chip) analysen ble utført i henhold til Agilent pattedyr ChIP protokollen med små modifikasjoner. HCT116-celler ble kryssbundet med 1% formaldehyd i 10 minutter ved romtemperatur og stoppet med 0,4 M glycin. Kromatin ekstrakter ble skåret av micrococcal nuklease spaltning, og hvorpå protein-DNA-kompleksene ble immunoutfelt med 3 ug av anti-E2F1 polyklonalt antistoff (C-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) bundet til anti-kanin IgG-belagte Dynabeads ( life Technologies). Non-immun kanin IgG (Santa Cruz Biotechnology) ble anvendt som en negativ kontroll. De utfelte DNA ble underkastet kvantitativ PCR-analyse med et primersett (forover (-26) 5′-CCGGAAACACGCCCATGGC-3 «og bakover (127) 5′-GGGTCCTCTTCATCGCAGC-3») for å forsterke
DSCC1
promoter-regionen. Spesifisitet av analysen ble bestemt ved amplifisering av en distal oppstrøms region i
DSCC1
promoter med følgende primere: forover (-1279) 5′-AGTTGTAGGGAATGTTTCCCATT-3 «og bakover (-1111) 5»- GATTGGTTCATGTGACCTACTTC-3 «. I tillegg er amplifikasjoner av celledeling syklus 2 (
CDC2
) promoter og glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
) promotor ble anvendt for positive og negative kontroller, henholdsvis (primere:
CDC2
frem 5′-CGCCCTTTCCTCTTTCTTTC-3 «,
CDC2
reversere 5′-ATCGGGTAGCCCGTAGACTT-3′,
GAPDH
frem 5′-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3 «,
GAPDH
reversere 5′-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3 «).
Resultater
uttrykk for DSCC1 er ofte forhøyet i CRC
for å identifisere nye målmolekyler for behandling og /eller diagnostiske biomarkører for CRC, vi tidligere utførte uttrykk profilanalyse av kolorektal tumorer og deres matchede normale kolorektal vev av cDNA microarray [5]. Blant de genene deregulerte i kolorektale svulster, uttrykk for DNA replikasjon og søsterkromatidutveksling samhold 1 (
DSCC1
) ble økt mer enn to ganger i 5 av 7 kolorektal kreft sammenlignet med tilsvarende ikke-kreft kolon slimhinnen (figur 1A ). Påfølgende real-time PCR-analyse ved hjelp av ytterligere 20 CRC vev og tilsvarende ikke-kreft slimhinnen viste at
DSCC1
uttrykk ble løftet mer enn to ganger i 12 av de 20 svulster (Figur 1a). En immunhistokjemisk farging viste akkumulert DSCC1 protein i 29 av 40 CRC vev sammenlignet med tilsvarende tilstøtende ikke-cancerous colonic slimhinnen (figur 1B). Selv om vi søkte etter sammenhenger mellom uttrykket og clinicopathological faktorer som alder og kjønn på pasientene, beliggenhet, størrelse og histologiske data av svulster som dybden av invasjonen, spredning til lymfeknuter, og vaskulær eller lymfekar invasjon, ingen av de faktorene var signifikant assosiert med DSCC1 uttrykk (tabell S1). I tillegg western blot-analyse ved bruk av CRC-cellelinjer avdekket at DSCC1 er rikelig uttrykt i HCT116, HT-29, og DLD-1-celler, og at det ble uttrykt på lave nivåer i SW480, SW620, og Caco-2-celler (figur 1C) . Selv om vi sammenlignet stabiliteten DSCC1 protein i HCT116 (DSCC1-høy) og SW480 (DSCC1-lav) celler ved cycloheximide jage analysen, DSCC1 var relativt stabil i begge HCT116 og SW480 celler. Behandling med MG132, en proteasominhibitor heller ikke forbedre DSCC1 uttrykk (Figur S1 A). Disse data antydet at protein stabilitet er ikke sannsynlig til å spille en viktig rolle i den opphøyde uttrykk for DSCC1 i kreftceller.
(A) Relativ uttrykk prosenter av
DSCC1
i syv kolorektal kreft vev til deres tilsvarende normalt vev i våre microarray data (øvre panel). Relative uttrykk nivåer av
DSCC1
i ytterligere 20 kolorektal tumorer og tilsvarende ikke-kreft slimhinnen ble analysert ved kvantitativ PCR (nedre panel). Antall
DSCC1
var normalisert til
HPRT1
uttrykk. Y-aksen indikerer forholdet av gjennomsnittet av
DSCC1
ekspresjon i tumor som i sine tilsvarende normale vev. Dataene representerer middelverdi ± SD fra triplikate eksperimenter. (B) Representative bilde av immunhistokjemisk farging av DSCC1 i en human colon cancer vev som inneholder kreftceller og tilstøtende normal slimhinne. (C) Ekspresjon av DSCC1 i CRC-cellelinjer ble påvist ved western blotting ved anvendelse av anti-DSCC1 antistoff. (D) HCT116-celler ble probet med anti-DSCC1-antistoff, etterfulgt av FITC-konjugert anti-mus IgG sekundært antistoff (grønn). Nuclei var teller-farget med DAPI (blå). (E) HCT116, RKO, og DLD-1-celler ble separert i det cytoplasmatiske (CF) og atom fraksjoner (NF), og de cytoplasmiske og kjerneproteiner ble utsatt for SDS-PAGE etterfulgt av western-blotting. Renhet av fraksjonene ble bestemt ved nærværet av β-tubulin (cytoplasmatisk markør) og lamin B (atom markør). (F) Kopier nummer analyse av
DSCC1
i åtte CRC cellelinjer og HEK293 celler. Relativ kopi antall
DSCC1
genet ble bestemt ved kvantitativ PCR ved hjelp av
RPPH1
som en endogen referanse. Kopien nummer ble beregnet ved å dele sine PCR-produkter av de av perifere leukocytter fra friske frivillige, og deretter multiplisere med 2.
Immunhistokjemisk analysis uventet avbildet akkumulert DSCC1 i cytoplasma og kjernen av DSCC1-positive kreft -celler (figur 1 B), selv om Dscc1 ble rapportert å spille en rolle i etableringen av kohesjon under DNA-replikasjon i gjær. For å belyse sin subcellulære lokalisering, gjennomførte vi immunocytokjemisk farging av endogen DSCC1 i HCT116 cellene. I samsvar med den immunhistokjemisk farging av kreft vev, ble DSCC1 proteiner lokalisert både i cytoplasma og cellekjernen (figur 1D og S1B). Videre western blot-analyse ved bruk av cytoplasmiske og kjernefraksjoner trekkes ut fra HCT116, RKO, og DLD-1 celler (figur 1E) og celler som uttrykker Myc-tagged DSCC1 bekreftet at den subcellulære lokalisering i cytoplasma og cellekjernen (fig S1C og S1D) .
Kopier nummer analyse av
DSCC1
for å ta om genamplifisering er involvert i DSCC1 overekspresjon, gjennomførte vi eksemplar nummer analyse av kvantitativ PCR hjelp RNase P som en kontroll . Sammenlignet med perifere leukocytter fra friske frivillige, ble kopiantallet av
DSCC1
ikke økt i noen CRC cellelinjene som ble testet (figur 1F). Det er verdt å merke seg at en reduksjon i kopiantall ble observert i HT-29 celler som rikelig uttrykt DSCC1 (figur 1C). Vi videre analysert kopiantall endring av
DSCC1
i tykktarm og endetarm adenokarsinom (The Cancer Genome Atlas tykktarmskreft prosjekt) ved hjelp av cBioPortal database (https://www.cbioportal.org/public-portal/). Som et resultat ble antatt kopinummerendringer funnet i 7 av 257 kolorektal adenokarsinomer (2,7%), noe som tyder på at forsterkning av
DSCC1
ikke spiller en viktig rolle i den forbedrede DSCC1 uttrykk.
regulering av
DSCC1
promoter aktivitet
for å løse mekanismen av forhøyet DSCC1 uttrykk i CRC, undersøkte vi arrangøren aktiviteten til
DSCC1
i HCT116 cellene. Reporter analyse ved bruk av plasmider som inneholder et 5′-flankerende region av
DSCC1 plakater (pDSCC1-1023 /+ 109) viste at denne regionen har en betydelig promoter-aktivitet (data ikke vist). I regionen, identifiserte vi en antatt E2F-bindende motiv, EBS1 (-3 /+ 5, 5′-CTTGGCGC-3 «) ved hjelp av Jaspar (https://jaspar.genereg.net/) og TFSEARCH databaser (http: //www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) (figur 2A). Denne antatte bindingssetet deles høy likhet med konsensus motiv for E2F, TTTSSCGC med S = G eller C. Siden E2F transkripsjonsfaktorer er ofte deregulert i en rekke tumorer, testet vi effekten av E2Fs på
DSCC1
promoter aktivitet. Selv om E2F1, E2F2, E2F3, og E2F4 økt arrangøren aktivitet, gjorde E2F6 ikke endre aktiviteten. E2F1, som viste den sterkeste induksjons blant de fire medlemmer, forsterket aktiviteten på en doseavhengig måte (figur 2B og S2A). Denne forbedring ble også observert i andre cellelinjer, inkludert LoVo, HeLa, og HEK293 (data ikke vist). For å undersøke en mulig involvering av EBS1 i forsterkning, målte vi rapportøraktivitet, ved hjelp av konstruksjonene pDSCC1-10 /+ 109 og + 10 /+ 109 i nærvær eller fravær av E2F1 (figur 2C). Basale rapportør Virksomheten til disse rapportør plasmider var ikke signifikant forskjellige i fravær av E2F1 plasmider. Sletting av EBS1 (pDSCC1 + 10 /+ 109) dramatisk redusert E2F1-indusert reporter aktivitet (fra 20,4 ganger til 3,2 ganger). Uventet, forbedring av reporter aktivitet ved E2F1 ble fortsatt observert i + 10 /+ 109. Videre sletting opp til 70 av arrangøren (pDSCC1 + 70 /+ 109) helt redusert E2F1-indusert reporter aktivitet (figur 2C). Etter avtale med dette resultatet, fant vi to ekstra presumptive EBSS, EBS2 (+ 31 /+ 38, 5′-CTTCCGGC-3 «) og EBS3 (+ 57 /+ 64, 5′-TTGCCCGC-3») i området mellom 10 og 70. For å ta ansvar EBS1, EBS2, og EBS3 for induksjon, vi utarbeidet fire muterte reporter konstruksjoner (figur 2D) ved å erstatte den GC-rik-segmentet i E2F konsensus motiver, TTTSSCGC (S = C eller G) eller STTTS, fordi disse kjerne motivene var angivelig avgjørende for E2F binding [13], [14]. Sammenlignet med villtype pDSCC1-10 /+ 109 (14,8 ganger induksjon), begge typer EBS1-mutant plasmider (pDSCC1-10 /+ 109 Mut1, og Mut1 «) bemerkelsesverdig redusert reporteren aktivitetsnivået til E2F1 (5,2 ganger og 5,8-fold, henholdsvis). Mutasjoner i både EBS1 og EBS2 (pDSCC1-10 /+ 109 Mut1 + 2) ytterligere redusert i E2F1-indusert aktivitet (3,7 ganger). Mutant reporter plasmid som inneholder erstatninger i de tre elementene (pDSCC1-10 /+ 109 Mut1 + 2 + 3) nesten redusert forsterkning (1,7 ganger), noe som tyder på at de tre E2F bindende motiver er ansvarlig for regulering av
DSCC1
promoteraktivitet.
(A) Nukleotidsekvens av -10 til 90 bp region human
DSCC1
. Tre antatte E2F bindende motivene er understreket. (B) pDSCC1-1023 /+ 109 ble transient transfektert med PRL-TK og pcDNA3 HA-E2Fs inn SW480, eller med PRL-TK og pcDNA3 HA-E2F1 (0,01-1 mikrogram) i SW480 og HCT116-celler. (C) pDSCC1-10 /+ 109 eller de kortere promotor konstruksjonene ble transfektert med E2F1 eller den tomme vektoren inn SW480 celler. (D) Site-rettet mutasjon analyse av mulige E2F bindingssteder i proksimale promoter regionen. pDSCC1-10 /+ 109 eller dets mutante kloner ble transfektert med E2F1 eller tom vektor inn SW480 celler. Dataene representerer middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Arrangøren aktivitet indikerer den relative luciferase enheten eller fold induksjon løpet tom vektor transfektant. (E) Chromatin immunoutfelling ble utført ved anvendelse av anti-E2F1 antistoff. De utfelte DNA ble utsatt for amplifikasjon av
DSCC1
promoter ved kvantitativ PCR. For å finne den spesifikke binding til EBS, forsterkningen av en distal oppstrømsregion i
DSCC1
promoter ble brukt for normalisering. En signifikant forskjell ble bestemt ved t-test. (F) HCT116-celler ble transfektert med kontroll eller E2F1 siRNA (25 nM) i 48 timer.
DSCC1
uttrykk ble oppdaget av kvantitativ PCR. En signifikant forskjell ble bestemt ved t-test. (G) SW480-celler ble transfektert med kontroll eller E2F1 siRNA (25 nM), etterfulgt 8 timer senere ved transfeksjon med reporter plasmid (pDSCC1-10 /+ 109) og E2F1 ekspresjonsvektor eller tom vektor. Etter 48 timer ble luciferaseaktivitet målt. Dataene representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter.
Samspill E2F1 med
DSCC1
promoter omegn
For å finne ut om E2F1 bindes til promoter-regionen
DSCC1
, utførte vi kvantitativ ChIP analyse ved bruk av anti-E2F1-antistoff og et sett av primere som omfatter de tre antatte E2F-bindende elementer. Promotoren av celledeling syklus 2-genet (
CDC2
), et velkjent E2F1 målet, ble anriket 13,4 ganger med immuno-DNA (figur S2B). Expectedly,
DSCC1
promoter regionen ble beriket av opp til 15,4 ganger i DNA, noe som tyder på en interaksjon av
DSCC1
promoter-regionen med E2F1 (figur 2E).
for å bekrefte involvering av E2F1 i å regulere DSCC1 uttrykk, undersøkte vi stanse effekten av E2F1 på DSCC1 uttrykk. Real-time PCR og Western blot analyser viste at uttømming av E2F1 redusert DSCC1 uttrykk (figur 2F og S2C). RNAi-mediert knockdown av E2F1 aktivitet ble bekreftet av reporter analysen viser betydelig reduksjon av
DSCC1
promoter aktivitet fra 10,4 (Ctrl siRNA) til 4,7 ganger ved E2F1 siRNA i SW480 celler (figur 2G). Disse resultatene antydet at
DSCC1
transaktivering er, i det minste delvis, regulert av E2F1 i CRC gjennom dets interaksjon med
DSCC1
promoter-regionen, og at de tre EBSS spiller en viktig rolle i transkripsjonen aktivering. For ytterligere å undersøke om DSCC1 uttrykk moduleres av E2F transkripsjonen aktivitet, sammenlignet vi den relative uttrykk for
DSCC1
med
CDK1 product: (
CDC2
), som avlesning av E2F transkripsjonen aktivitet ved hjelp av to uavhengige datasett (E-MEXP-3715 og geod-23878) i Gene Expression Atlas database (https://www.ebi.ac.uk/gxa/). I datasettene,
DSCC1 Hotell og
CDK1
var signifikant oppregulert i kolorektal tumorer sammenlignet med normal colonic vev (figur 3). Spesielt, begge datasettene beregnet høye verdier av korrelasjonskoeffisient (E-MEXP-3715,
r
= 0,912 og geod-23878,
r
= 0,864) mellom
DSCC1
og
CDK1
, støtter det syn at
DSCC1
er en annen nedstrøms genet reguleres av E2F.
Denne foreningen ble vist av to sett med microarray data, E-MEXP-3715 (A) og geod-23878 (B), i Gene Expression Atlas database (https://www.ebi.ac.uk/gxa/). Pearsons korrelasjonskoeffisient (r) mellom
DSCC1 Hotell og
Cdk1
uttrykk verdier ble da beregnet til å vurdere sin sammenheng.
Effekt av DSCC1 på spredning av CRC celler
for å ta rollen som sin opphøyde uttrykk i CRC celler, undersøkte vi om DSCC1 er involvert i spredning av kreftceller. Vi gjennomførte celleviabilitet analyse ved hjelp av plasmider uttrykker både DSCC1 shRNA (shDSCC1 # 1, eller shDSCC1 # 2) og neomycin motstandsdyktig genet. Plasmider som inneholder egge sekvens av DSCC1 shRNAs (shDSCC1 # 1scr og shDSCC1 # 2scr) og plasmid som inneholder EGFP shRNA (shEGFP) fungerte som kontroller. Transfeksjon med disse DSCC1 shRNAs (shDSCC1 # 1, eller shDSCC1 # 2) reduserte ekspresjonen av DSCC1, mens transfeksjon med kontroller (shEGFP, shDSCC1 # 1scr og shDSCC1 # 2scr) ikke hadde noen effekt (figur 4A). HCT116-celler ble dyrket i medium inneholdende passende konsentrasjon av G418 og cellenes levedyktighet ble målt. Vi fant at antallet levedyktige celler transfektert med DSCC1 # 1 eller DSCC1 # 2 shRNA ble signifikant redusert sammenlignet med de transfektert med EGFP, DSCC1 # 1scr, eller DSCC1 # 2scr shRNA, noe som indikerer at DSCC1 spiller en rolle i levedyktigheten av kreftceller (Figur 4B). Konsekvent data ble innhentet i SW480 og RKO celler (Figur S3A). Disse resultatene ble bekreftet i gjentatte forsøk.
(A) HCT116-celler ble transfektert med kontroll (Mock og EGFP) og DSCC1 shRNAs i 48 timer ved hjelp av Nucleofector kit, og western blot-analyse ble utført. Ekspresjon av β-actin tjente som en kontroll. (B) Levedyktighet av celler transfektert med shRNAs ble målt ved hjelp av WST-8-analyse. Dataene representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige trans. P-verdier ble beregnet med Dunnetts test for multiple sammenligninger til shEGFP-transfekterte celler. (C) Overekspresjon av DSCC1 i SW480-celler ble bekreftet ved Western-blotting ved anvendelse av anti-DSCC1 antistoff. Ekvivalenttall på tre og tre mock DSCC1-celler ble sådd ut i 96-brønners plater, og celleproliferasjonsprosesser analyser ble utført ved de angitte tidspunkter. Dataene representerer middelverdi ± SD fra fem eksperimenter. En vesentlig forskjell mellom uekte og DSCC1 celler ble bestemt av to-veis gjentatte tiltak ANOVA.
I tillegg etablerte vi SW480 celler som konstitutivt uttrykker eksogene DSCC1, og sammenlignet deres spredning med kontrollceller transfektert med mock vektor (Figur 4C). I samsvar med DSCC1-knockdown data, celler som uttrykker eksogent DSCC1 viste utvidet celleproliferasjon i forhold til foreldre SW480 celler eller kontrollceller (
p
= 2,2 × 10
-5). Tilsvarende eksogene DSCC1 utfoldelse forbedret spredning av HCT116-celler (figur S3b).
rolle DSCC1 i induksjon av apoptose
Siden E2F1 dratt motstand mot gentoksiske fornærmelser [15], [16 ], [17], vi videre undersøkt om forhøyede DSCC1 ekspresjon spiller en rolle i følsomheten av kreftceller til å genotoksiske stimuli. SW480-celler som uttrykker-eksogent DSCC1 (SW480-DSCC1 # 1, # 3 og # 8) ble utsatt for y-bestråling, og induksjon av apoptose ble analysert ved immunblotting med anti-spaltet PARP-antistoff.
