Abstract
Høy makrofag infiltrasjon har vært korrelert til bedre overlevelse i tykk- og endetarmskreft (CRC). Tumor assosiert makrofager (TAM) spille komplekse roller i tumorigenesis siden de antas å holde både svulsten hindrer (M1 makrofager) og tumor fremme (M2 makrofager) aktiviteter. Her har vi brukt et immunhistokjemisk metode for å bestemme graden av infiltrering av makrofager med et M1 eller M2 fenotype i kliniske prøver av CRC i forhold til prognose, både i CRC generelt, men også i subgrupper av CRC definert av mikrosatelitt ustabile (MSI) screening status og CpG island methylator fenotype (CIMP). Totalt 485 påfølgende CRC-prøvene ble farget for nitrogenoksydsyntase 2 (NOS2) (også betegnet iNOS) som en markør for den M1 makrofag fenotype og scavenger receptor CD163 som en markør for M2 makrofag fenotype. Den gjennomsnittlige infiltrasjon av NOS2 og CD163 uttrykker makrofager langs invasive svulster foran var semi-kvantitativt evaluert med en fire-gradert skala. To undergrupper av makrofager, viser M1 (NOS2
+) eller M2 (CD163
+) fenotyper, ble anerkjent. Vi observerte en signifikant sammenheng mellom mengden av NOS2
+ og CD163
+ celler (
P
0,0001). En sterk invers korrelasjon til tumorstadium ble funnet for både NOS2 (
P
0,0001) og CD163 (
P
0,0001) infiltrasjon. Videre pasienter husing svulster sterkt infiltrert av NOS2
+ -celler hadde en betydelig bedre prognose enn de infiltrert av noen NOS2
+ celler, og dette ble funnet å være uavhengig av MSI screening status og CIMP status. Ingen signifikant forskjell ble funnet på kreftspesifikk overlevelse i grupper på CRC med ulike NOS2 /CD163 forholdstall. Som konklusjon, er en øket infiltrering av makrofager med et M1 fenotype på tumor fram ledsaget av en samtidig økning av makrofager med et M2 fenotype, og i et trinn avhengig måte korrelert til en bedre prognose i pasienter med CRC.
Citation: Edin S, Wikberg ML, Dahlin AM, Rutegård J, Öberg Å, Oldenborg PA, et al. (2012) Fordelingen av makrofager med en M1 eller M2 Phenotype i forhold til prognose og molekylære egenskaper av tykktarmskreft. PLoS ONE 7 (10): e47045. doi: 10,1371 /journal.pone.0047045
Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center og Beckman Research Institute, USA
mottatt: 29 juni 2012; Godkjent: 07.09.2012; Publisert: 15 oktober 2012
Copyright: © Edin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet med tilskudd fra det svenske Cancer Society (innvilge ingen CAN 2011/839, Palmqvist,. www.cancerfonden.se), Vetenskapsrådet (gi ingen B03488901, Palmqvist,. www.vr.se), banebrytende forskning Grant fra fylkesrådet Västerbotten, Sverige (gi ingen VLL-132981, Palmqvist.), Cancer Research Foundation i Nord-Sverige (gi ingen AMP 09-619, Edin,. www.cancerforskningsfonden.se), og Tore Nilsons Foundation (Edin, www.torenilsonsstiftelse.nu). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
inflammatoriske celler er til stede i tumoren mikromiljøet av kreft og har blitt rapportert å påvirke miljøet av inflammatoriske mediatorer og celleproliferasjonsprosesser signaler, angiogenese og vev-omforming på en måte som kan fremme tumorprogresjon [1] – [3 ]. Tumor-assosiert makrofager (TAM) og deres roller i tumorinvasjon og metastase har vært diskutert i flere nyere anmeldelser [4] – [8]. Generelt er TAMs innenfor og som omgir de fleste tumorer og kan, når den er aktivert, slipper en rekke faktorer som kan påvirke oppførselen til tumorceller og andre celler i tumor stroma. Muligheten av makrofager til å tilpasse seg til sine omgivelser har ført til identifisering av to hovedpolariserte fenotyper av makrofager [7], [9]. Kort fortalt blir de klassisk aktiverte M1 makrofager, karakterisert ved ekspresjon av nitrogenoksydsyntase 2 (NOS2) (også betegnet iNOS), så vel som mange pro-inflammatoriske cytokiner (f.eks IL1β, IL6, IL12, IL23 og TNF) og er rapportert å ha en høy bakteriedrepende og tumorici-dal kapasitet. De viktigste funksjonene til alternativt aktiverte M2 makrofager er stedet å skatte rusk og fremme vev reparasjon, men de har også immunmyndighetsfunksjoner. Mange av de faktorer produsert av M2 makrofager opptrer i favør av tumorprogresjon, stimulering av tumorvekst, (for eksempel epidermal vekstfaktor (EGF), fibroblast vekstfaktor 1 (FGF1) og transformerende vekstfaktor beta 1 (TGFβ1), angiogenese (f.eks vaskulær endotelial vekstfaktor A (VEGFA)) og matrise remodellering (f.eks FGF1, fibrin og matrise metallopeptidases (MMP)). i tillegg, M2 makrofager produserer også immunreguleringsfaktorer (f.eks IL10 og TGFβ1) som demper immunresponsen.
TAMs er ofte funnet å ha en M2 fenotype, og har vært forbundet med en redusert overlevelse hos pasienter med for eksempel melanom [10], [11], bryst [12], [13], nyre [14] og blærekreft [15] ., [16] dette er imidlertid ikke tilfelle for alle kreft vi og andre har tidligere vist seg at en økt tetthet av makrofager i CRC er korrelert til en bedre prognose [17] -.. [20] kan også magekreftpasienter er blitt rapportert for å få en bedre prognose med et høyt antall TAMs [21], [22] resultatene på prostata [23], [24], lunge [25] -. [29] og livmorkreft [30] – [32] er imidlertid motstridende. Det blir stadig tydeligere at makrofager kan spille ulike roller i tumorigenesis avhengig av vev og krefttypen. Det er interessant å spekulere i at de ulike rollene spilles av makrofager i ulike krefttyper kan medføre variasjoner i balansen mellom M1 og M2 fenotyper (tumor forebygging vs. tumorvekst), drevet av faktorer i svulsten mikromiljøet av individuelle kreft. Det kan også være variasjoner innenfor visse krefttyper.
CRC er subtyped henhold til deres mikro (MSI) status og CpG island methylator fenotype (CIMP). Omtrent 15% av CRC er definert som mikrosatelitt ustabile (MSI), en fenotype som forårsakes av defekter i DNA mismatch reparasjon, noe som er i motsetning til mikro stabile (MSS) CRC [33]. I sporadiske CRC, har MSI blitt svært knyttet CIMP [34]. CIMP kan klassifiseres som CIMP-høy eller lav-CIMP ifølge hypermetylation status av CpG øyer i et sett av gener som er unmethylated i normalt vev eller kolorektal i CIMP-negative tumorer [35] -. [38]
i denne studien, ble fordelingen av ulike subtyper av makrofager evalutated i 485 kliniske prøver av CRC, ved hjelp av nitrogenoksid syntase 2 (NOS2) som en markør for M1 makrofag fenotype og åtseldyr reseptoren CD163 som en markør for M2 makrofag fenotype. Infiltrasjon av NOS2
+ og CD163
+ -celler var relatert til clinicopathologic og molekylære variabler, så vel som prognose, både i den komp CRC kullet og i undergrupper av CRC definert ved MSI screening status og CIMP status. Vi kan konkludere med at infiltrering av makrofager i M1 CRC er ledsaget av infiltrering av makrofager og M2 korrelert til forbedret overlevelse i et stadium avhengig måte i CRC, og at dette er uavhengig av MSI screening status og CIMP status.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
håndtering av vevsprøver og pasientdata i denne studien ble godkjent av forskningsetisk komité ved Umeå universitetssykehus (Regional etisk Review Board i Umeå, Sverige), inkludert framgangsmåten der pasienter verbalt ga sitt samtykke. Dette samtykke ble dokumentert i hver pasientjournalen, og vurderes av etikkomiteen å være tilstrekkelig. Vevsprøver ble registrert som et saksnummer og år i en database som brukes for analysene, uten navn eller fødselsnummer indikert.
studiepopulasjonen
Kliniske prøver fra pasienter av tykktarmskreft i Umeå Study (crums) [39], kirurgisk reseksjon for CRC ble samlet mellom 1995 og 2003 ved kirurgisk avdeling, Umeå universitetssykehus, Umeå, Sverige. Fra alle pasienter, ble formalinfiksert parafin innebygd vev samplet og patologiske variabler ble preget av en patolog ved å gjennomgå rutinemessig farget seksjoner. Kliniske data, inkludert overlevelsesdata, ble innhentet av en kirurg ved å gjennomgå pasientjournaler. Totalt 485 pasienter (300 tykktarm kreft, 180 endetarms kreft, og fem ikke spesifisert Subsite innenfor colorectum) ble inkludert i studien. Med 28 pasienter mangler informasjon om enten NOS2 eller CD163 uttrykk, 474 prøver for NOS2 og 468 prøver for CD163 var tilgjengelige for analyse. Adjuvant kjemoterapi ble administrert til 68 (14,0%) pasienter. Preoperativ strålebehandling ble gitt til 108 (60,0%) endetarmskreftpasienter hvorav 83 fikk 5 x 5 Gy, og 25 fikk 25 × 2 Gy. For å overleve analyser, ble 37 pasienter ekskludert på grunn av ufullstendige oppfølgingsdata eller på grunn av død av perioperative komplikasjoner. For å overleve analyserer score om NOS2 /CD163 ratio, totalt 422 pasienter var tilgjengelige.
Immunohistochemistry og immunoflourescense
Prøvene ble fiksert i 4% formaldehyd og dyppet i parafin, ifølge rutinemessige prosedyrer ved avdeling for klinisk patologi, Umeå universitetssykehus, Umeå Sverige. En 4-mikrometer delen fra hver pasient ble kuttet, tørket, de-vokset og vannes ut. Platene ble deretter underkastet varme-mediert antigen hentes ved hjelp av diva-oppløsning (Biocare Medical, Concord, CA) i en Decloaker ™ trykkoker. For immunhistokjemiske prosedyrer, ble en halvautomatisk farging maskin (Ventana ES, Ventana Inc., Tuscon, Arizona) brukes. Anti-CD163 monoklonalt antistoff (Novacastra) ble anvendt ved en fortynning på 1:100, og anti-NOS2 polyklonalt antistoff (Abcam) ble anvendt ved en fortynning på 1:50. Skinnene ble kontra med hematoksylin.
For evaluering, ble lysbilder vurdert under lysmikroskop. Immunhistokjemisk farging ble vurdert som mest representative området ved invasiv foran og vurderes som ingen /svak (skår 1), moderat (skår 2), sterk /robust (skår 3) og massiv infiltrasjon (skår 4) ifølge Forssell et al. [18]. Prøvene ble evaluert to ganger av samme observatør, og uharmoniske saker ble anmeldt for tredje gang, etterfulgt av en avgjørende dom. For immunoflourescense, ble anti-CD163 monoklonalt antistoff, anti-NOS2 kanin-polyklonalt antistoff og anti-CD68 kanin polyklonalt antistoff (GeneTex Inc) ble brukt ved en fortynning på 1:50, og anti-CD68 monoklonalt antistoff (Dako) ble anvendt ved en fortynning av 1:400. For blokken, ble vevssnittene ble behandlet med PBS inneholdende 10% normalt geiteserum og 0,4% Triton X-100 i 20 minutter, etterfulgt av vask i vaskebuffer (PBS, 0,2% Triton X-100, 0,2% bovint serumalbumin). Deretter ble platene inkubert med primært antistoff (i PBS, 0,1% Triton X-100) i 1 time ved romtemperatur, hvoretter de ble vasket i vaskebuffer. Platene ble inkubert ytterligere med DAPI ved en fortynning på 1:1000 og sekundær anti-kanin-IgG Alexa®488 og anti-kanin-IgG-antistoffer Alexa®555 (Invitrogen) fortynnet 1:400 (i PBS, 0,1% Triton X-100) i 1 time. Etter flere vasker, ble platene montert i Vectashield montering medium (Vector Laboratories) og vises ved hjelp av et Nikon D-Eclipse C1 konfokalmikroskop med olje nedsenking og en 40 × objektiv.
MSI screening status og CIMP status
MSI screening status ble bestemt ved immunohistokjemi som tidligere beskrevet [39]. En positiv MSI screening status (MSI) ble tildelt vevsprøver med tumorceller som mangler nukleær farging for ett eller flere av proteinene MLH1, MSH2, MSH6, eller PMS2, dette i motsetning til en negativ filtrering status (MSS), hvor positiv tumor kjerner var tilstede uttrykker alle fire markører. CIMP status ble bestemt i henhold til hypermethylation av en åtte-gen panel (
CDKN2A
,
MLH1
,
CACNA1G
,
NEUROG1
,
RUNX3
,
SOCS1
,
IGF2
,
og CRABP1
) ved MethyLight metode (kvantitativ real-time PCR) med tidligere beskrevet primer og probe sekvenser [39] [40]. Følgende antall hypermethylated gener definert CIMP-negative tumorer, 0 gener; CIMP lave svulster, 1-5 gener; og CIMP høye svulster, 6-8 gener.
Statistiske analyser
Statistiske analyser ble utført med PASW Statistikk 18 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). Kryss tabuleringer ble analysert med Fischers eksakte test og lineære relasjoner med nøyaktig lineær-by-lineær assosiasjon test. Kaplan-Meier-overlevelsesanalyse ble brukt til å estimere cancer-spesifikk overlevelse, og sammenligninger mellom grupper ble utført med log-rank test. Kreftspesifikk overlevelse ble definert som død med kjente disseminert eller tilbakevendende sykdom. Multivariate overlevelses analyser ble utført ved hjelp av Cox proporsjonal fare modeller.
P
. 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Uttrykk for M1 og M2 makro markører
NOS2 ble valgt som en markør for makrofager med en M1 fenotype og CD163 som en markør for makrofager med et M2 fenotype. For å validere om NOS2 og CD163 var markører, i stand til å skille mellom forskjellige populasjoner av makrofager, ble prøver av 10 CRC pasienter tilfeldig valgt og fordeling av NOS2 og CD163 ble analysert ved å dobbelt immunoflourescent farging, etterfulgt av konfokal mikroskopi. NOS2 og CD163 ble funnet å være primært uttrykkes ved forskjellige populasjoner av makrofager (figur 1A). En liten over runde kan imidlertid identifiseres, som er på linje med den plastiske natur av makrofager. Makrofager at høyt uttrykte en av markørene, men konsekvent ikke uttrykke andre markør. Dette bekrefter NOS2 og CD163 som markører som kan brukes til å skille mellom forskjellige subpopulasjoner av makrofager som viser hovedsakelig M1 eller M2 fenotyper, respektivt. Videre ble NOS2 og CD163 uttrykk funnet i celler som også uttrykte makrofag markør CD68 (figur 1B og C).
Confocal bilder av immunoflourescent stainings i CRC av (A) NOS2 (rød) og CD163 (grønn) (B) CD68 (rød) og CD163 (grønn) og (C) NOS2 (rød) og CD68 (grønn). Atomkjerner blir avslørt av DAPI farging (blå), og overlegg er flourescense innsamlet av alle kanaler.
Uttrykk for NOS2 og CD163 var semi-kvantitativt evaluert i prøver fra 485 CRC pasienter som bruker immunhistokjemi henhold til en tidligere dokumentert fire-gradert skala [18]. Representative stainings av infiltrerende NOS2
+ eller CD163
+ makrofager er vist i figuren vises 2. Omtrent 70% av alle svulster en beskjeden til massiv infiltrasjon av NOS2
+ og CD163
+ celler (skår 2 -4), mens de resterende viser svak eller ingen infiltrering (skår 1). Flertallet av NOS2 og CD163 uttrykk ble funnet i celler lokalisert i svulsten stroma, med høyest tetthet langs invasiv tumor foran.
Representative lette mikroskopiske bilder av immunhistokjemiske stainings av NOS2 og CD163 i påfølgende deler av det samme CRC tumorprøve.
forholdet mellom NOS2
+ og CD163
+ makrofager
Frekvensen av infiltrerende NOS2
+ og CD163
+ makrofager på svulsten fronten er presentert i tabell 1. Infiltrerende makrofager uttrykker NOS2 eller CD163 ble svært positivt korrelert (
P
0,0001). Mengden av CD163
+ celler i svulsten foran, men var ofte høyere enn for NOS2
+ celler.
Association mellom infiltrere NOS2
+ og CD163
+ makrofager og clinicopathologic og molekylære parametre
score til å infiltrere NOS2
+ og CD163
+ makrofager i CRC prøvene ble korrelert til ulike clinicopathologic variabler (tabell 2). Når inkludert alle svulster, ingen relasjon til NOS2
+ eller CD163
+ makrofag infiltrasjon ble funnet til kjønn, alder, klasse, vekstmønster, adjuvant kjemoterapi eller preoperativ strålebehandling. En svak lineær trend ble funnet for økt infiltrasjon av NOS2
+ makrofager fra ceacum til endetarmen (
P
= 0,043). Mens ingen signifikant assosiasjon av NOS2 uttrykk ble funnet med tumor type, ble en signifikant sammenheng med tumortype funnet for CD163 uttrykk (
P
= 0,005), med CD163 infiltrert svulster oftere å ha en ikke-mucinous histologi. En sterk invers assosiasjon med tumorstadium ble funnet for både NOS2
+ (
P
0,0001) og CD163
+ (
P
0,0001). Makrofag infiltrasjon
Når knyttet infiltrere NOS2
+ eller CD163
+ makrofager til molekylære parametre (Tabell 3), ingen sammenheng med NOS2
+ eller CD163
+ makrofag infiltrasjon ble funnet å enten MSI screening status eller CIMP status. Når man kombinerer MSI screening status med CIMP status imidlertid CD163
+ makrofag infiltrasjon ble funnet å være betydelig lavere i CIMP-høy svulster sammenlignet med CIMP-negative eller CIMP lave svulster blant gruppen av MSS tumorer (
P
= 0,042).
Prognostic viktigheten av å infiltrere NOS2
+ og CD163
+ makrofager
for å vurdere den prognostiske effekten av makrofag infiltrasjon, sammenlignet vi samlet kreft -spesifikke overlevelse hos pasienter med ulike scorene til å infiltrere NOS2
+ eller CD163
+ makrofager. Figur 3 viser Kaplan-Meier plott av kreftspesifikk overlevelse i crums pasienter med ulike nivåer av infiltrerende NOS2
+ og CD163
+ makrofager. En økt infiltrasjon av NOS2
+ makrofager i svulsten forsiden var sterkt signifikant assosiert med en forbedret prognose (Log-rank
P
= 0,0003) (figur 3A). En lignende foreningen ble sett også for CD163
+ makrofager (Log-rank
P
0,0001) (Figur 3D). I potensielt curatively resected CRC (dvs. unntatt pasienter med fjernmetastaser eller ikke-radikal kirurgi) betydningen av sammenhengen mellom NOS2
+ makrofag infiltrasjon og prognose var tapt (Log-rank
P
= 0,132). Men i denne gruppen betydningen av NOS2
+ makrofag infiltrasjon og prognose ble gjenopprettet da skille tilfeller av tykktarmskreft fra endetarms kreft, Log-rank
P
= 0,008 i tykktarmen i forhold til Log-rank
P
= 0,881 i endetarmen (figur 3B og C). For tilsvarende analyse av CD163
+ makrofag infiltrasjon i curatively resected CRC en lignende tendens ble funnet (Log-rank
P
= 0,034 i alle CRC, Log-rank
P
= 0,059 i tykktarm,. Log-rank
P
= 0,236 i endetarmen) (Figur 3E og F)
CRC saker ble scoret for NOS2 (A-C) og CD163 (D-F) uttrykk , scorer 1-4. Vist er Kaplan-Meier plott av kreftspesifikk overlevelse i (A og D) alle CRC, (B og E) potensielt curatively resected tykktarm kreft, og (C og F) potensielt curatively resected endetarms kreft. Log-rank tester ble brukt for å beregne
P
verdier.
På grunn av den sterke korrelasjonen mellom tumorstadium og uttrykk for NOS2 og CD163 vi gjennomført multivariate Cox proporsjonal fare modeller inkludert variablene henholdsvis kjønn, alder, lokalisering, tumor stadium, og en makrofag markør,. Hazard ratio (HRS) for både NOS2 (HR 0,67, 95% KI 0,40 til 1,12,
P
= 0,12) og CD163 (HR 0,66, 95% KI 0,42 til 1,06,
P
= 0,087) indikerte en beskyttende effekt, men nådde ikke statistisk signifikans, med vekt på scenen avhengighet.
den mulige effekten av variasjoner i NOS2 /CD163 ratio på pasientens overlevelse ble også analysert. Ingen signifikant forskjell ble sett på cancer-spesifikk overlevelse i CRC i forhold til NOS2 /CD163-forhold, heller ikke i alle CRC tilfeller (figur 4A) og heller ikke i den valgte gruppe av potensielt curatively resekterte coloncancere (figur 4B). Videre NOS2 /CD163 forholdet ble ikke signifikant assosiert med overlevelse i multivariat analyse (data ikke vist).
Kreft spesifikk overlevelse av CRC tilfeller scoret for NOS2 /CD163 forholdet. Vist er Kaplan-Meier plott av NOS2 /CD163 forholdet i (A) alle CRC, eller (B) potensielt curatively resected tykktarm kreft. Log-rank tester ble brukt for å beregne
P
verdier.
Prognostic viktigheten av å infiltrere NOS2
+ og CD163
+ makrofager ifølge MSI screening status og CIMP status
for ytterligere å analysere den prognostiske verdien av makrofag infiltrasjon, sammenlignet vi samlet kreftspesifikk overlevelse innenfor ulike undergrupper av CRC definert av MSI screening status og CIMP status.
MSI tilfeller av CRC er funnet å ha en litt bedre prognose i forhold til MSS tilfeller [33]. Makrofag infiltrering ble funnet å være en prognostisk faktor i undergrupper av både MSI (figur 5A og D) og MSS tilfeller (figur 5B og E). Den prognostiske verdien av NOS2
+ makrofag infiltrasjon ikke nådde betydning i MSI tilfeller (Log-rank
P
= 0,256), men det gjorde det i MSS tilfeller (Log-rank
P
= 0,002). CD163
+ makrofag infiltrasjon var viktig for prognosen i både MSI (Log-rank
P
= 0,009) og MSS (Log-rank
P
= 0,003) tilfeller. Når man kombinerer MSI screening status med lav (skår 1-2) eller høy (skår 3-4) infiltrasjon av NOS2
+ eller CD163
+ makrofager, signifikante effekter på prognose ble funnet for både NOS2
+ ( log-rank
P
= 0.005) og CD163
+ (log rank
P
= 0,0004) makrofag infiltrasjon (figur 5C og F). Den mest gunstig prognose ble funnet i MSI tilfeller sterkt infiltrert av makrofager, særlig ved NOS2
+ makrofager. MSS tilfeller med lav makrofag infiltrering vises det verste prognose (Figur 5C og F). ble ingen signifikante forskjeller på prognose mellom MSI og MSS saker innenfor undergruppene med lav eller høy infiltrasjon av NOS2
+ eller CD163
+ makrofager.
Undergrupper av CRC ble arrangert i henhold til MSI screening status og scoret for NOS2 (A-C) og CD163 (D-F) uttrykk, scorer 1-4. Vist er Kaplan-Meier plott av kreftspesifikk overlevelse i (A og D) MSI tilfeller (B og E) MSS saker, og (C og F) kombinert MSI screening status og NOS2 eller CD163, scorer 1-2 eller 3- 4, henholdsvis. Log-rank tester ble brukt for å beregne
P
verdier.
makrofagin viste seg å være av prognostisk betydning i alle CIMP undergrupper (Figur 6A-C og E-G). NOS2
+ makrofag infiltrasjon viste en signifikant effekt på kreftspesifikk overlevelse i CIMP-lav tilfeller (
P
= 0,011). Makrofager uttrykker CD163 viste signifikante effekter på prognose i CIMP-neg (Log-rank
P
= 0,006) og CIMP-høy (Log-rank
P
= 0,022) tilfeller. Når man kombinerer CIMP screening status med lav (skår 1-2) eller høy (skår 3-4) infiltrasjon av makrofager uttrykker NOS2 eller CD163, signifikante effekter på prognose ble funnet for både NOS2 (Log-rank
P
= 0,015) og CD163 (Log-rank
P
= 0,001) infiltrasjon (figur 6D og H). Den mest gunstig prognose ble funnet i høyt infiltrerte CIMP undergrupper (figur 6D og H). CIMP undergrupper med lav infiltrasjon av NOS2
+ eller CD163
+ celler i sammenligning viste en dårligere prognose. Ingen signifikante forskjeller på prognosen ble funnet mellom CIMP-negative, CIMP lave eller CIMP høye saker innenfor undergrupper med lav eller høy infiltrasjon av NOS2
+ eller CD163
+ makrofager.
Undergrupper av CRC ble arrangert i henhold til CIMP status og scoret for NOS2 (A-D) og CD163 (E-H) uttrykk, scorer 1-4. Vist er Kaplan-Meier plot av prøver av (A og E) CIMP-negative tilfeller, (B og F) CIMP-lav tilfeller, (C og G) CIMP-høy måter, og (D og H) kombinert CIMP status og NOS2 eller CD163, scorer 1-2 eller 3-4, henholdsvis. Log-rank tester ble brukt for å beregne
P
verdier.
Diskusjoner
Det vert mikromiljøet gjennomgår dramatiske endringer under utviklingen av kreft, påvirker stromale celler, matrise sammensetning, angiogenese, så vel immunresponsen, som i sin tur kan ha betydelige effekter på tumorvekst og spredning [41]. En inflammatorisk tumor mikromiljø er blitt foreslått som den sjuende kjennetegn på progresjon av kreft [42]. Analyse av immun contexture – dvs. plassering, tetthet og funksjonell orientering av immunceller – og hvordan den er integrert med svulst molekylære egenskaper kan gi viktig informasjon om pasienten prognose samt prediksjon av respons på ulike behandlinger [43], [ ,,,0],44]. Makrofager spiller en viktig rolle ved tumor forsiden, utskillende faktorer som på mange måter kan påvirke både tumor og omgivende stromale celler, herunder andre celler i immunsystemet.
Vi har tidligere vist i en forholdsvis stor klinisk kohort at en høy infiltrasjon av celler som uttrykker CD68 makrofag markør på tumorfram i CRC resulterer i en forbedret prognose [18]. Her, ble fordelingen av makrofager med et M1 eller M2 fenotype undersøkt
in situ
i denne kohort for å analysere for betydningen av forskjellige undertyper av makrofager i CRC pasient prognose. For denne studien ble NOS2 og CD163 valgt som markører for å skille mellom makrofager viser primært M1 eller M2 fenotyper, henholdsvis. Både NOS2 og CD163 har vært benyttet av andre som markører for å definere M1 eller M2 makrofag fenotyper i humane cancere [10], [45] – [57]. Vi her bekreftet med dobbelt immunoflourescent flekker og confocal analyse at disse markørene i stor grad gjøre separat mellom to forskjellige cellepopulasjoner som er av makrofag avstamning (figur 1). Det synes imidlertid å være et lite antall celler som uttrykker både NOS2 og CD163, men som oftest i reduserte mengder, noe som tyder på at en blandet fenotype noen ganger oppstå. Makro subtyper som sterkt uttrykker enten NOS2 eller CD163, men svært sjelden uttrykker markør for motsatt subtype. Den distinkte definisjonen av makrofager i til populasjoner av M1 og M2 undertyper er sannsynlig å være en svak overforenkling, ettersom makrofager er svært plast celler og kan vise et spektrum av fenotyper [58]. Imidlertid kan markører for M1 og M2 makrofager likevel brukes til å gjenkjenne hoved fenotype eller funksjon av forskjellige makrofag-populasjoner. Selv om vi finner ut at NOS2 og CD163 uttrykkes ved ulike bestander av makrofager, er det fortsatt en risiko for at ikke alle M1 eller M2 makrofager uttrykke disse markørene, og at vi derfor kan miste deler av makro befolkninger i vår studie. Videre studier er nødvendig for å bekrefte M1 og M2 fenotyper og for å finne mer spesifikke markører som skiller mellom M1 og M2 makro populasjoner.
Når korrelert til clinicopathologic egenskaper (tabell 2), en svak lineær trend ble funnet for økt infiltrasjon av M1 makrofager fra ceacum til endetarmen, som er på linje med kolorektal kontinuum teorien foreslått av Yamauchi et al [59], [60]. I sin studie, CIMP-high, MSI-høy og
BRAF
mutasjoner ble funnet å gradvis øke fra endetarmen til tykktarmen. Ceacal kreft ble funnet å representere et unikt subtype som ikke følger linearitet trend. Men for makrofagin ceacal kreft ble ikke ekskludert fra linearitet. Uttrykk for NOS2 og CD163 omvendt korrelert til tumor stadium, noe som indikerer at høyere stadium svulster i større grad har rømt immunsystemet. Videre NOS2 og CD163 uttrykk korrelert godt til uttrykk for makrofag markør CD68 (
P
0,0001)., Som støtter at NOS2 og CD163 uttrykkes av celler i makrofag avstamning
I mange kliniske studier har det blitt observert at en høy infiltrasjon av TAMs korrelerer til en dårlig prognose og TAM er således foreslått å være av M2 fenotype som fremmer tumorprogresjon. Imidlertid har vi og andre nylig sett at store mengder TAMs i CRC gi en bedre prognose og overlevelse [17] – [20], [52]. Dette er den første studien, til vår kunnskap, hvor markører for undergrupper av M1 og M2 makrofager brukes sammen i hensikt å sammenligne fordelingen av ulike makro fenotyper og deres forhold til prognosen i CRC. Vi kunne observere en signifikant statistisk sammenheng mellom mengden av NOS2
+ og CD163
+ makrofager (
P
0,0001), noe som viser den parallelle nærvær av makrofager med både M1 og M2 fenotyper ved svulst invasiv foran (tabell 1). Videre er økt infiltrasjon av både NOS2
+ og CD163
+ makrofager i tumoren foran var korrelert til en signifikant forbedret prognose (figur 3). Denne sammenhengen ble også funnet i en undergruppe av curatively resected tykktarm kreft, men ikke i en undergruppe av curatively resected endetarms kreft. En mulig forklaring på denne forskjell kan være at i motsetning til de fleste tykktarmskreftpasienter, mange (60%) av de rektale kreftpasienten preoperativ radioterapi, som er kjent for å forårsake en redusert inflammatorisk reaksjon [61]. Men vi fant ingen forskjell i makrofag infiltrasjon mellom svulster hos pasienter som hadde fått preoperativ strålebehandling og de som ikke hadde (tabell 2).
Forholdet mellom infiltrere makrofager av M2 fenotype og prognose i CRC har tidligere blitt analysert i noen få studier. Ifølge Nagorsen et al., Som i vår studie, stromal infiltrasjon av CD163
+ M2 makrofager i CRC ble korrelert til en betydelig forbedret overlevelse [52]. Disse forfatterne har imidlertid ikke vurdere parallell nærvær av M1 makrofager. Algars et al. funnet en positiv korrelasjon på peritumoral CLEVER-1 /Stabilin-en
+ M2 makrofager og overlevelse i CRC [17]. De fant videre at en lav M1 /M2-forhold resulterte i mer tilbakevendende sykdom. Men i sin studie M1 makrofager ble ansett som de makrofager som ikke uttrykker Clever-1 /Stabilin-en. M1 makrofager er blitt foreslått å ha tumorici-dal aktivitet, og som forventet, pasienter som hadde tumorer med høy infiltrering av NOS2
+ makrofager ble funnet å ha en vesentlig bedre prognose enn de med liten eller ingen NOS2 infiltrering (figur 3A). I likhet med vår studie, Ohri et al.
