Abstract
Bakgrunn
Long ikke-kodende RNA (lncRNAs) spiller utbredt roller i genregulering og cellulære prosesser. Men de funksjonelle rollene lncRNAs i tykk- og endetarmskreft (CRC) er ennå ikke godt belyst. Hensikten med denne studien var å måle nivåene av lncRNA 91H uttrykk i CRC og evaluere klinisk betydning og biologiske roller i utvikling og progresjon av CRC.
Metoder
91H uttrykk og kopi antall variasjon (CNV) ble målt i 72 CRC tumorvev og tilstøtende normalt vev ved real-time PCR. De biologiske roller 91H ble evaluert av MTT, scratch såret analysen, migrasjon og invasjon analyser, og flowcytometri.
Resultater
91H ble betydelig overuttrykt i kreftvev og CRC cellelinjer sammenlignet med tilstøtende normalt vev og en normal human tarm epitel cellelinje. Videre 91H overekspresjon var nært forbundet med fjernmetastaser og dårlig prognose for pasienter med CRC, med unntak av CNV av 91H. Multivariat analyse indikerte at 91H ekspresjon var et uavhengig prognostisk indikator, samt fjernmetastaser. Våre in vitro data indikerte at knockdown av 91H hemmet spredning, migrasjon, og invasivitet av CRC celler.
Konklusjoner
91H spilt en viktig rolle i molekylær etiologi av CRC og kan betraktes som en roman prognose indikator hos pasienter med CRC
Citation. Deng Q, han B, Gao T, Pan Y, Sun H, Xu Y, et al. (2014) oppregulering av 91H Fremmer tumormetastase og Spår dårlig prognose for pasienter med tykktarmskreft. PLoS ONE 9 (7): e103022. doi: 10,1371 /journal.pone.0103022
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 15 april 2014; Godkjent: 23 juni 2014; Publisert: 24.07.2014
Copyright: © 2014 Deng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet med tilskudd fra The National Nature Science Foundation of China, Nanjing Science and Technology Committee Prosjekt ((ingen 81172141, 81200401.) no.201108025), Nanjing Medical Technology Development Project (nr. ZKX11025), Nanjing Helse Young talent Project, Jiangsu Provincial Key Medisinsk Talenter til SKW, Nanjing Medical Science and Technique Development Foundation til YQP (Nr. QRX11255) og B.S.H. (Nr. QRX11254). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en vanlig årsak til kreft dødsfall i verden på grunn av sen svulst presentasjon og rask progresjon, med om lag 14,1 millioner nye krefttilfeller og 8,2 millioner kreftdødsfall i 2012 på verdensbasis [1]. I økonomisk utviklingsland, blir CRC blir mer utbredt, spesielt i Kina [2]. Til tross for betydelig fremgang oppnådd i diagnose og behandling for CRC i de senere år, er den samlede fem års overlevelse utilfredsstillende på grunn av metastaser som fører til dårlige resultater [3]. . Derfor, for å søke nye molekylære markører eller faktorer er nødvendig og presserende for tidlig deteksjon før fjernmetastaser vises og forutsi prognose hos pasienter med CRC
Nyere studier har avdekket at lncRNAs, 200 nukleotider i lengde, spill en avgjørende rolle i kreftutvikling og progresjon. Til tross for mindre godt forståelse av lncRNAs sammenlignet med microRNAs [3], [4], [5], akkumulerende bevis indikerer at lncRNAs-mediert biologi kan være involvert i reguleringen av diverse cellulære prosesser, så som cellevekst og apoptose, stamcelle pluripotency og utvikling, meiotisk inngang og telomerlengde [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Imidlertid, i likhet med protein-kodende gener og micorRNAs, kan lncRNAs fungere som oncogener eller tumor suppresjon, og avvikende ekspresjon av dem var assosiert med kreftutvikling. Høy uttrykk for PVT-1 uttrykk i kreftvevet ble ansett som en selvstendig risikofaktor for total overlevelse av CRC pasienter [12], og hotair, fungerer som et onkogen eller en tumor suppressor, ble innblandet i epigenetisk regulering for kreft [7], [13], som ble ansett som en sterk prognose maker som bidro til å forutse metastaser og pasientenes overlevelse i primær brystkreft [7].
91H, H19 antisense RNA, var en roman lncRNA som ble plassert på plasseringen av H19 /IGF2 locus (Tiltredelse antall NC_000011.9) med 119.329 kbs i lengde. Transkripsjon av 91H ble overuttrykt i menneskelig brystkreft som var involvert i reguleringen av IGF2 uttrykk i trans [14]. Imidlertid har få studier undersøkt funksjonene til 91H i andre former for kreft hos mennesker, inkludert CRC. For å utforske de potensielle biologiske funksjoner av 91H i utvikling og progresjon av CRC, ble studien gjennomført ved å undersøke uttrykk mønster av 91H i CRC tumorvev og tilstøtende normalt vev, og undersøke de biologiske funksjonene ved vurdering av invasivitet, migrasjon, og apoptose av CRC celler med 91H knockdown in vitro.
Materialer og metoder
Kliniske prøver og cellelinjer
72 tumorvev og matchet tilstøtende normalt vev ble oppnådd fra registrert CRC pasienter som gjennomgikk kirurgi ved Nanjing første sykehuset Affiliated til Nanjing Medical University, mellom 2011 og 2014. spesielt nærliggende normalt vev ble tatt 5-10 cm unna tumorvev. Alle prøvene ble umiddelbart frosset i flytende nitrogen etter kirurgi og lagret ved -80 ° C til DNA og RNA-ekstraksjon. Ingen pasienter fikk cellegift eller strålebehandling på pre-operasjon. Klinisk informasjon av disse pasientene ble samlet blant annet alder, kjønn, tumor beliggenhet, TNM stadium, svulst klasse og microstellite ustabilitet (MSI) status som tidligere studie [15] rapportert. De oppfølgingsperioder varierte fra 2 måneder til 3 år, med et gjennomsnitt på 26,6 måneder. Alle prøvene ble oppnådd med pasienters skriftlig informert samtykke og ble bekreftet histologisk. Den medisinske etikk komité av Nanjing første sykehuset Affiliated til Nanjing Medical University godkjent studiet.
Cellelinjer HCT8, HT29, HCT116, SW620 (human tykktarm kreft cellelinjer) og FHC (normal menneskelig intestinal epitel cellelinje) ble hentet fra Shanghai Cell Collection, Chinese Academy of Sciences. Alle ovennevnte cellelinjer ble holdt i DMEM (Hyclone, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone) og dyrket ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO
2
Extraction. av total RNA og genomisk DNA, cDNA-syntese, og QRT-PCR
Total RNA og genomisk DNA (gDNA) ble ekstrahert fra vev og cellelinjer ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, CA) og EZNA Tissue DNA Kit (Omega, USA) etter produsentens protokoll separat. cDNA ble syntetisert ved hjelp av PrimeScript RT reagent Kit med gDNA Eraser (Takara, Kina) og ble brukt til 91H uttrykk nivå analyse av kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) med følgende primere: fremover, 5’GCTTGTCAGTAGAGTGCGCC-3; og omvendt, 5-CATCCAGTTGACCGAGCTTG-3. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll med følgende sekvenser: forover, 5-CAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3; omvendt: 5-AGTCCGCCTAGAAGCATTTG-3. De to
-ΔΔCt metode ble utført for å beregne den relative mengde av 91H sammenlignet med β-aktin ekspresjon. QRT-PCR ble utført ved hjelp av SYBR Premiks Ex TagTM II (Takara, Kina) og ABI 7500 System (Applied Biosystems, USA).
Kopier nummer variant identifikasjon av 91H
Analyse av CNV for gDNA ble også utført ved QRT-PCR som beskrevet ovenfor fremgangsmåte. RNase P ble anvendt som en referanse genet. Kopien antall 91H ble regnet etter ligningen 2 × 2
-ΔΔCT.
Transfeksjon av siRNA
RNA interferens ble utført ved hjelp av syntetisk siRNA tomannsboliger, som beskrevet av tidligere studier [ ,,,0],16], [17]. To syntetiske siRNA duplekser (SI-91H: si91H1, 5′-GGCGUCAUUCUGAUGGGACTT-3 «og si91H2, 5′- UUCAGGAGCUUAAGAUGCUTT-3′) som svarer til de 91H RNA-sekvenser og en negativ kontroll (Si-NC, 5»-CGUGGGUGGAUGCAUGGAUTT-3- «) ble transfektert inn i HCT-116-celler med 400 pmol henholdsvis ved hjelp av Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, CA) i 6-brønns plate. Etter 48 timer ble 91H ekspresjonsnivåer undersøkt via QRT-PCR.
celleproliferasjonsanalyse
etter transfeksjon i 48 timer som beskrevet ovenfor, infisert HCT-116 celler ble deretter høstet for celleproliferasjonsanalyse (MTT assay) etter produsentens protokoll. Infiserte celler (1 x 10
4) ble sådd ut i flatbunnede 96-brønners plater supplert med 100 ul DMEM per brønn. Etter inkubasjon i 6, 24, 48, 72 og 96 timer henholdsvis, ble 10 ul av MTT tilsatt til hver brønn, og deretter ble mediet fjernet etter 4 timers kultur og deretter supplert med 150 ul DMSO per brønn. Kolorimetrisk analyse ble utført på en mikroplateavleser ved 490 nm bølgelengde. Hver undergruppe ble gjentatt i fem brønner.
Migrasjon og Invasion analyser
For migrasjon analysen, infiserte HCT-116 celler (1 x 10
5 i 200 mL serumfritt DMEM) , på samme måte som beskrevet tidligere, ble podet inn i det øvre kammer av Transwell platene i en 24-brønners format med diameter 8 mm (Corning Costar, USA). 600 ul DMEM inneholdende 5% FBS ble tilsatt til den nederste kammer som et kjemotiltrekkende. Etter 24 timers dyrkning ble cellene fiksert med metanol og ble farget med krystallfiolett. Gjenværende celler ble fjernet fra toppen av den permeable membran ved hjelp av en bomullspinne. Da cellene som migrerte gjennom det øvre kammer ble tellet i fem tilfeldige områder under et lysmikroskop, og den gjennomsnittlige verdien av fem felt ble uttrykt.
For invasjon assay, ble de beste kamrene er belagt med basalmembran Matrigel (40 mg /ml, Becton-Dickinson, USA) ved 37 ° C i 30 minutter. Infiserte celler (3 x 10
5) med serumfritt DMEM ble tilsatt i de øverste kamre, ble bunnkamrene fylt med DMEM inneholdende 10% FBS. Etter 24 timers inkubering ble cellene som invaderte baksiden av toppkamrene fiksert, farget, og beregnet ved hjelp av et lysmikroskop. Hver invasjonen analysen ble utført i tre eller flere paralleller.
Scratch såret analysen
Seks-brønners plater ble belagt med infiserte HCT-116 celler. Sår ble laget på konfluente celler ved bruk av en 10 ul pipettespiss ved 48 timer etter transfeksjon. Deretter frittflytende celler og debris ble fjernet ved anvendelse av PBS, og FBS-fritt medium tilsatt. Deretter observerte vi den sårtilheling ved ulike tidsperioder og fotografert representative skrape linjer ved hjelp av lysmikroskop. Hvert eksperiment ble gjentatt i triplikat.
Apoptose analyse
celle apoptose ble bestemt ved hjelp av flow cytometri etter farging med Annexin V-FITC og propidiumjodid (PI, BD Bioscience, CA). HCT-116 celler ble infisert med SI-91H eller si-NC i seks-brønns plate. Apoptose ble analysert etter 48 timers infeksjon. Alle apoptose analyser ble utført i tre eksemplarer.
Statistisk analyse
Optimal lodde nivåer av 91H i kreft /noncancerous ble beregnet ved å bruke mottakeren som opererer karakteristikk analyse (ROC) [18], [19]. Sammenligning av kontinuerlige data ble analysert ved hjelp av en uavhengig
t
-test, og kategoriske data ble analysert ved chi-kvadrat test. I mellomtiden, overlevelse ble beregnet ved Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og Log-rank test. En Cox modell univariat og multivariat analyse ble gjennomført for å fastslå effekten av 91H uttrykk og clinicopathologic parametere på total overlevelse (OS). Nomogram for OS ble etablert ved å bruke R-programvare. Harrell er samsvar indeks (c-index) ble brukt for å estimere prediktiv nøyaktighet av det. Statistikk med
P
-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle disse statistiske beregninger ble utført ved hjelp av IBM SPSS 20,0 programvare (IBM, USA), R 3.0.3 programvare (Institutt for statistikk og matematikk, Wien, Østerrike), OriginLab 8.5.1 programvare (OriginLab Corp, Northampton, USA) og GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, USA).
Resultater
Sammenheng mellom 91H relative uttrykk og clinicopathologic faktorer i CRC
91H uttrykk nivåer ble bestemt ved QRT-PCR for 72 kreft og tilstøtende noncancerous vev fra CRC pasienter. 91h nivåer i kreftvevet var åpenbart høyere enn de i noncancerous vev (
P
0,001; figur 1). ROC-kurve analyse viste at de optimale cut-off nivåer for ekspresjon 91H var 2,86 ganger for OS i kreft /noncancerous (figur 2). Da de 72 pasientene med CRC ble delt inn i en høy 91H uttrykk gruppe (n = 42) som 91H ekspresjon forholdet ≥2.86 og en lav 91H uttrykk gruppe (n = 30) som 91H ekspresjon forholdet 2,86 (figur 3), ifølge cut-off-nivået. Clinicopathologic faktorer ble sammenlignet mellom to 91H uttrykk grupper (tabell 1). 91H uttrykk var signifikant korrelert med fjernmetastaser (
P
= 0,027). Men 91H uttrykk ble neppe korrelert med pasientenes kjønn, alder, tumor beliggenhet, TNM stadium, N scenen eller klasse. For å beregne ytterligere sammenhengen mellom 91H uttrykk og prognosen for pasienter med CRC, ble Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og log-rank tester utført ved hjelp av pasientenes postoperative overlevelse. Resultatene viste at pasienter med høyt 91H uttrykk hadde en åpenbart dårligere prognose enn de med lav 91H uttrykk (
P
0,001, figur 4).
Unvariate analyse av overordnet analyse viste at 91H relative uttrykk, TNM stadium, fjernmetastaser eller klasse var prognostiske indikatorer (tabell 2). Videre 91H relative uttrykk og fjernmetastaser var uavhengige prognostiske indikatorer for den totale overlevelsen av pasienter med CRC (HR: 3,66,
P
= 0,001; HR: 8,97,
P
0,001 ) henholdsvis multivariat analyse (tabell 2). I tillegg ble prognostisk nomogram med clinicopathologic faktorer og 91H uttrykk etablert for å forutsi sannsynligheten for at pasienter med CRC ville dø innen 3 år av sitt første operasjonen, forutsatt at pasienten ikke dør av andre årsaker først (figur 5). I mellomtiden ble prediktiv nøyaktighet nomogram er målt via en samstemmighet indeks (c-indeks). For CRC, nomogram inneholder 91H hadde mer forutsigbar nøyaktighet enn det uten 91H (c-index: 0,90 versus 0,85 henholdsvis)
DNA kopiantall variasjon (CNV) var ikke involvert i opp-. regulering av 91H uttrykk
for å avgjøre om 91H uttrykk nivå i CRC ble assosiert med CNV, uttrykket mønster av 91H ble målt ved QRT-PCR, og videre beregnet samsvar mellom 91H DNA kopiantall og 91H relative uttrykk nivå . Kun 2,8% (2/72) av sammenkoblede normale og tumorvev med CNV viste overekspresjon av 91H. Imidlertid ble det avvikende uttrykk for 91H påvist i 95,8% (69/72) av sammenkoblede normale og tumorvev uten kopiantall endring (figur 6).
A, The 91H relative uttrykk i matchet kreft og noncancerous vev ble målt ved QRT-PCR. β-actin ble betraktet som den interne kontroll. B, Kopien antall variant av 91H i kreft og noncancerous vev ble også målt ved QRT-PCR. RNase P ble brukt som referanse genet.
91H fremmet spredning, invasjon og migrasjon av CRC celler in vitro
For å evaluere de biologiske funksjonene til 91H, 91H uttrykk nivåene ble målt i en rekke cellelinjer (FHC, HCT-8, HT-29, HCT-116, og SW-620) av QRT-PCR. Som vist i figur 7, ble 91H ekspresjon detektert de høyere nivåer i HCT-8, HT-29 og HCT-116 sammenlignet med FHC, med unntak av SW-620. Etterpå ble HCT-116 celler transfektert med SI-91H eller si-NC. Etter transfeksjon i 48 timer, ble 91H effektivt silenced i HCT-116 celler (Figur 8).
neste søkt å fastslå om 91H knockdown påvirket celleproliferasjon ved MTT-analyse. Dataene, sammenlignet med HCT-116 celler infisert med SI-NC, viste at spredning av HCT-116 celler med si-91H var bebodd til 36,7% (
P
0,05), 45,4% (
P
0,05), 43,2% (
P
0,05), 65,6% (
P
0,01) og 65,3% (
P
0,01) på 6, 24, 48, 72 og 96 timer, henholdsvis (figur 9). I tillegg, ble induksjon av apoptose etter 48 timers behandling med Si-91H eller si-NC målt ved hjelp av flow cytometri. HCT-116 celler med 91H knockdown ikke åpenbart vise apoptose sammenlignet med dem i kontroll (figur 10).
Deretter for å få tilgang til effektene av 91H undertrykkelse på HCT-116 celler motilitet, en ripe sår analysen ble utført for å måle effekten av 91H knockdown på cellemotilitet. 91H undertrykkelse førte dempe motilitet av HCT-116 celler. Spesielt sammenlignet med infiserte celler med Si-NC, såret restitusjon ble signifikant forsinket i siRNA-infiserte celler (figur 11). Videre ble migrasjon og invasjon analyser brukes til å ytterligere tilgang til denne effekten av 91H knockdown på migrasjon og invasivitet av CRC celler. Resultatene viste at migreringen og invasivitet ble betydelig inhibert i infiserte celler med Si-91H, sammenlignet med si-NC-infiserte celler (figur 12). Videre ble HCT-116 cellemigrasjon og invasjon ble redusert med 49,4% (P 0,05) og 43,9% (P 0,05), henholdsvis, etter 91H undertrykkelse (figur 13). Disse funnene indikerer at 91H hemming kan være nært korrelert med spredning, migrasjon og invasjon av CRC cellelinjer.
Antall invasive eller migrerte celler for hver forsøksgruppe ble regnet som den gjennomsnittlige av 5 fem felt av visjon under et mikroskop (*
P
0,05)
Diskusjoner
Som en roman molekylære stjerne for lncRNA, samler studier har. fokusert på virkningen av lncRNA på kreft patogenesen, og kunne gi ny innsikt i biologien til disse kreftformene [20], [21], [22]. Til tross for betydelig fremgang lncRNAs i kreft patogenesen, biologiske roller lncRNAs er ikke klart i CRC. For å utforske biologi lncRNA i CRC, ble denne studien utført for å først undersøke de biologiske roller 91H i CRC progresjon og vurdere effekten av 91H på clinicopathological egenskaper og prognose.
I denne studien data viste at 91H uttrykk nivåer i CRC vev var betydelig høyere enn i tilsvarende noncancerous vev. Resultatet ble identifisert in vitro med CRC-cellelinjer og normal human tarm epitel cellelinje (figur 7). Videre ble overekspresjon av 91H forbundet med fjernmetastaser av clinicopathologic faktorer (
P
0,05). 91H ble påvist å være stabil ekspresjon i brystkreftcellelinjer, og det ble observert å være oppregulert hos pasienter med primær brystkreft [14]. Mer viktig, mus myoblasts, 91H var fast bestemt på å bli innblandet i co-regulering av gener i H19 /IGF2 locus bidra til kreftutvikling og kreft progresjon [16]. Men 91H uttrykk var ikke forbundet med fjernmetastaser av clinicopathologic faktorer i esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) [23]. Inkonsekvent konklusjoner å knytte 91H uttrykk med clinicopathological faktorer kan skyldes ulike histopatologiske typer. I tillegg bruker in vitro data viste vi at 91H knockdown hemmet cellemotilitet, migrasjon og invasivitet av CRC celler. Resultatene indikerte at 91H kan spille en potensiell rolle i å fremme metastaser fra CRC.
Videre vi først beskrev bevis på at høy 91H uttrykk nivåer i svulstvev var knyttet med dårlig prognose, og 91h relative uttrykk nivåer var intimt beslektede med dårlig klinisk utfall av pasientene, noe som indikerer et uttrykk for 91H kunne serveres som en verdifull uavhengig prognostisk biomarkør uavhengig på store clinicopathological egenskaper, med unntak av metastasestatus. Faktisk, tidligere studier indikerte at lncRNAs ble også ansett som molekylære biomarkører i kreft. PVT-en, genererer antiapoptotic aktivitet i CRC, ble identifisert som en ny prognostisk indikator for CRC pasienter [12], [24]. I mellomtiden hotair var involvert i tumorprogresjon og ble sett på som en roman epigenetisk molekylære biomarkører hos pasienter med ESCC eller CRC [18], [25], [26]. Derfor, anser vi at 91H kunne være en potensiell ny prognostisk indikator på pasienter med CRC.
Generelt nomogrammer har blitt utviklet i de fleste krefttyper [27], [28], [29], som skaper en enkel grafisk representasjon av en statistisk forutsigbar modell som genererer en numerisk sannsynlighet for en klinisk hendelse [30]. Videre er evnen til å fremstille individualiserte nomogrammer forutsigelser muliggjør deres anvendelse i identifikasjon og lagdeling av pasienter for deltagelse i kliniske forsøk [30]. I denne studien, basert på 91H relative uttrykk i svulsten og clinicopathological faktorer, ble en prediktiv nomogram utført for å forutsi sannsynligheten for at postoperative pasienter vil dø av CRC innen 3 år, med unntak for å dø av en annen årsak først. I mellomtiden, nomogram inneholder 91H hadde mer forutsigbar nøyaktighet enn det uten 91H (c-index: 0,90 versus 0,85 henholdsvis), noe som indikerer at 91H uttrykk i tumor åpenbart påvirket prediktiv nøyaktighet nomogram. Enda viktigere, kan nomogram brukes av leger for å identifisere pasienter ved å beregne sannsynligheten for postoperative pasienter med CRC, og for å kunne tilby riktig behandling og optimal strategi. Derfor bør pasienter med overekspresjon av 91H overvåkes nøye og fikk passende adjuvant behandling etter CRC reseksjon.
overekspresjon av 91H var involvert i kreft progresjon [14], [23]. Men grunnen til at 91H ble dysregulerte i svulsten forble ukjent. Kopier nummer variant var en viktig form for genomisk struktur endring, bidrar til visse genetiske og utviklings sykdommer, inkludert kreft i eggstokkene og brystkreft [31], [32]. H19 /IGF2 med kopi nummer variasjoner, som ligger på 11p15 trykt regionen, ble rapportert i Beckwith-Wiedemann og Silver-Russell syndrom [33], [34]. I mellomtiden, 91H-genet, H19 antisense-RNA, var også plassert i kromosomet 11p15.5 [14]. Derfor, kan det spekulert i at overekspresjon av 91H i CRC kan være forbundet med CNV. I denne studien ble CNV av 91H observert hos to pasienter med høyt 91H uttrykk, og kopiantall sletting av 91H ble forekom hos én pasient med CRC (figur 2). Selv om resultatet ikke viser statistisk signifikant, det ga en potensiell ny strategi i å undersøke 91H-mediert genregulering på kreft. På grunn av den begrensede størrelsen på saker som deltok i denne studien, ble det videre studier trenger i fremtiden for å illustrere potensialet forholdet.
Noen begrensninger i denne studien bør bli anerkjent. For det første, det antall pasienter med CRC var ikke store. Videre studier bør utføres for å bekrefte sammenhengen mellom 91H uttrykk og CRC, og for å avgjøre om 91H uttrykk var assosiert med CNV hos pasienter med CRC. For det andre oppfølgingsperioder var ikke nok lang (rekkevidde, 2-36 måneder), som ikke nøyaktig forutsi total overlevelse av CRC pasienter. Videre undersøkelser ble foretatt for å validere dette resultatet av langvarig oppfølging av pasienten kohort eller annen kohort av pasienter med CRC. Til slutt, alle in vitro-analyser for biologiske funksjoner ble bare gjennomføres i en enkelt cellelinje. Til tross for begrensningene viste i denne studien, disse funnene støttes viktigheten av den rollen 91H i ulike stadier av kreft progresjon fremme metastasering av CRC.
I sammendraget, 91H uttrykk var signifikant oppregulert i CRC vevsprøver og cellelinjer. Den forhøyede uttrykk for 91H var assosiert med dårlig prognose og fjernmetastaser. Videre 91H CNV forklarte bare noen få prosent av observert overuttrykk. Kumulativt, disse funnene indikerte at 91H spilt en viktig rolle i utvikling og progresjon av CRC. Ved å forstå nøyaktig rolle 91H i patogenesen av CRC, en roman og lovende terapeutisk strategi vil bli utviklet for videre CRC behandling, basert på nedregulering av disse onkogene lncRNAs.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1 . .
Forholdet mellom kopi nummer variasjon og 91H uttrykk i tumorvev og tilstøtende normalt vev
doi: 10,1371 /journal.pone.0103022.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
91H relative uttrykk ble kvantifisert i fire CRC cellelinjer og et normalt menneske intestinal epitel cellelinje ved QRT-PCR (gjennomsnitt ± SEM; **
P
0,01)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s002 product: (TIF)
Figur S3.
HCT-116 celler ble transfektert med SI-NC og si-91H. Etter 48 timer ble 91H ekspresjon effektivt inhibert av QRT-PCR sammenlignet med Si-NC (gjennomsnitt ± SEM; **
P
0,01)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022. S003 product: (TIF)
Figur S4.
91H fremmet spredning av HCT-116 celler via MTT-analyse (gjennomsnitt ± SEM;
P
0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s004 product: ( TIF)
Figur S5.
Apoptose ble undersøkt ved hjelp av cytometri analyse på 48 timer etter infeksjon med si-91H eller si-NC
doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s005 plakater (TIF)
Figur S6.
scratch såret analysen ble vurdert til cellemotilitet. Knockdown av 91H hemmet HCT-116 cellemotilitet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s006 plakater (TIF)
Figur S7.
91H fremmet invasjon og migrasjon av HCT-116 celler basert på transwell analysen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s007 plakater (TIF)
Figur S8.
antall celler som invaderte eller migrerte gjennom kammeret ble evaluert i 5 felt for hver forsøksgruppe og i gjennomsnitt. Antallet invasive eller migrerte celler for hver forsøksgruppe ble regnet som gjennomsnittet av 5 fem felt av visjon under et mikroskop (*
P
0,05)
doi: 10,1371 /journal.pone.. 0103022.s008 product: (TIF)
Tabell S1.
Pasient informasjon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s009 plakater (docx)
Tabell S2.
Resultatene av QRT-PCR for hver prøve
doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s010 plakater (XLSX)
